Abstract
이러한 폐, 간, 뼈 등의 보조 사이트에 전이가 약 90 % 1의 사망률과 외상 이벤트입니다. 이러한 사이트 중 폐 인해 몸, 섬세한 자연과 적절한 생리 유지에 중요한 역할 내에서 밀폐 된 위치로 생체 내에 광학 영상을 사용하여 평가하기가 가장 어렵다. 임상 양상 (양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 컴퓨터 단층 촬영 (CT)이)이 조직의 비침 이미지를 제공 할 수있는 반면, 한 번의 픽셀과 초기 시드 이벤트를 시각화하는데 필요한 해상도를 결여 거의 천 세포로 구성. 단지 종양 세포의 도착 후 이벤트가 생존과 이후의 성장에 결정적 전이성 폐 시드 가정의 현재 모델. 이 단일 세포 분석이 실시간으로 생체 내에 이미징 도구 시딩 CEL의 표현형을 정의하기 위해 필요하다는 것을 의미LS는이 모델을 테스트합니다. 폐의 고해상도 광학 영상은 다양한 생체 제제를 사용하여 수행되었지만, 이러한 실험은 전형적으로 단일 시간 시점 분석하고 (인해 대폭 변화된 환경 온도 풍부, 사이토 카인 등 아티팩트 가능한 잘못된 결론에 취약 ) 흉강 및 순환 시스템 3에서 제거한. 최근 작품은 진공 그러나 영상 창 2,4,5 안정화 사용 가능한 그대로 폐의 시간 경과 생체 내에 광학 영상입니다 보이고있다 일반적인 영상 시간은 약 6 시간으로 제한되어있다. 여기에서 우리는 12 시간의 기간에 걸쳐 이러한 윈도우를 이용한 폐의 장기간 생체 내에 촬영 된 영상을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법을 사용하여 얻어진 시간 경과 이미지 시퀀스는 폐의 시각화 및 세포 - 세포 상호 작용의 정량, 막 역학과 혈관 관류 수 있습니다. 우리는 더 라폐의 미세 혈관의 전례 명확한 도면을 제공하는 영상 처리 기술을 방접원을 그리다.
Introduction
고해상도 생체 내에 광학 영상은 단일 셀 및 하위 세포 매개 변수 측정 및 정량화 될 수 있도록 다수의 생물학적 과정을 이해하는데 중요한 것으로 입증되었다. 암 연구에서, 종양 및 기질 세포의 생체 내에 영상은 그대로 동물에만 존재하는 많은 미세 환경의 상호 작용 6-11의 발견하게되었다.
생체 내에서 단일 세포 해상도 광학 영상을 이용하여 유방암 intravasation 및 종양 세포의 보급과 관련된 미세 환경에 대한 발견은 심지어 예후 유방암 환자의 12-16 치료에 대한 반응에 대한 신규 마커하게되었다. 그대로 내부 중요한 장기 내에서 깊은 볼에 사용할 수있는 최고의 영상 기술은 전체 기관의 뛰어난 전망을 제공하고 임상 증상을 생산하기도 전에 병리을 표시 할 수있는 임상 양상 (MRI, PET, CT)입니다. 그들은 수없는, 시간owever 때문에 단일 셀 해상도의 부족으로 종양의 진행을 구동 전이의 초기 단계와 세포 메커니즘을 공개합니다. 그 때까지는 폐 전이가이 양식에서 볼 수 있습니다, 그들은 잘 설립 및 확산된다. 그들은 훨씬 이전에 이미 도달 생존의 초기 단계 촬상 19 예상보다 도착 파종 성 종양의 폐에 도달하거나 17 생존하지 않거나 초기 휴지 18 남아 세포 및 관찰의 90 %가 중요하게되는 예상 주어 원거리 사이트에 시딩 전이성 종양 성장의 반복 과정을 이해.
폐에서 이러한 관측을 수행하면 그러나 매우 어려운 입증했다; 영상화 연구의 대부분은 단지 하나의 시점에서 폐로보기를 제공 체외 이식편 또는 제제 (20-23)을 이용했다. 이러한 준비는 유용한 정보를 제공 할 수 있지만rmation, 그들은 미세 환경의 다양한 구성 요소 사이에 발생하는 상호 작용, 원인과 결과 관계, 역학의 완전한 이해를 제공하지 않습니다. 적절한 순환 시스템 (및 항상성 수반 불균형)과 신체의 면역 시스템의 나머지 부분에서 단절의 부족은 내리기이 제제는 생체 내에서 그대로 조직에서 생성 결론을 확인 할 수 있습니다.
많은 그룹은 Wearn과 독일은 흉막 층 (24)을 노출 외과 적 먼저 테리 이식 이미징 창 (25)을 활용하는 첫번째 인에 그대로 폐 2,4,5,24-33의 생체 내에 이미징을 수행했습니다.
폐의 고해상도 영상은 크게 폐의 지속적인 움직임에 의해 방해되고, 몇몇 기술은 이러한 한계를 극복하기 위해 개발되었다. 바그너와 Filley 27 개 폐의 자연적인 움직임을 연구바그너는 조직 (28)를 고정하기 위해 자신의 창 수술 준비에 진공을 이용하면서 상대적으로 고정 된 영역에 걸쳐 이식 창을 찾기 위해 자신의 수술 프로토콜을 설계했습니다. 기관지 클램프, 순차적 인 가사와 게이트 이미징, 오버 샘플링 수집, 폐 엽 진공 (34)의 접착 : 그 이후, 다양한 기술은 이미지에 포함 폐를 활용하고있다. 이러한 각각의 장단점을 갖고 어떤 하나의 기술은 서로 34 우량 등장하지 않았다. 예를 들어, 기관지 클램핑 순차적 무호흡증은 폐에서 가스의 정상적인 교환을 변경하고 무기폐의 원인이 될 수 있습니다. 정문 이미징 및 오버 샘플링 된 인수는 이러한 단점을하지만 고속 또는 전문 영상 장비 널리 액세스 할 수 없습니다 필요하지 않습니다. 결국 폐 모두 접착제 및 진공 기술은 상술 한 문제점을 모두 피할 수 있지만,주의가 탁하지 않은 경우 전단력에 의한 손상을 나타낼 수있다엉. 최근, 진공 창 소형화되었고 공 초점 및 다 광자 현미경 4,5,33 우수한 고해상도 화상을 사용하여 마우스에서 사용되도록 획득 된이. 표 1은 이러한 오랜 역사를 요약 및 신규를 설명 그 종이를 강조 생체 내에 폐 촬상 창 사용의 발전.
이 프로토콜은 가능한 가장 높은 세포 내 해상도 라이브, 그대로 폐의 이미지 전이에 장시간 경과 광자 생체 내에 현미경의 사용을 설명합니다. 이미지는 고 개구 수 대물 렌즈 복수 광전자 증 배관 (PMT) 검출기를 구비 한 다 광자 현미경을 사용하여 최대 12 시간 동안 획득된다. 형질 전환 마우스 모델은 형광 고 분자량 덱스 트란과 형광 단백질 형질 전환 된 종양 세포 (혈관과 종양 세포가 respectivel 레이블을 함께 형광 라벨 기본 식세포에 사용된다와이). 형광 표지 된 세포의이 선택은 종양 세포 내피 세포 - 대 식세포 상호 작용과 역학의 시각화 할 수 있지만,이 프로토콜은 형광 또는 비 형광 마우스의 변형을 위해 작동합니다. 인수 후, 잔류 드리프트 운동 (있는 경우) 레이블이없는 순환 혈액 세포에 의한 점멸 제거하기 위해 35, 36 및 사용자 지정 매크로 시간 평균에게 혈관 채널을 플러그인 피지를 사용하여 제거된다.
이 프로토콜은 촬상 전이에 초점을 맞추고 있지만, 기술은 폐 고해상도 단일 셀 이미징 관찰 다른 여러 생물학적 과정에 적용될 수있다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 알버트 아인슈타인 대학의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행되었다.
1. 생성 형광 표지 된 마우스 모델 및 종양 세포
- PBS 100㎖로 BSA 0.1 g을 혼합하여 0.1 % (w / v)의 소 혈청 알부민 / 인산 완충 생리 식염수 (BSA / PBS) 완충액 100 ㎖를 준비한다.
- 안정적인 형질 전환에 의해 형광 표지 된 종양 세포를 준비합니다.
참고 : 여기에서 우리는 E0771-LG 세포, 정맥 부모 E0771 셀 (38)를 주입 C57BL / 6 마우스의 폐에서 개발 된 전이성 종양에서 고립 된 E0771 마우스 유방 선암 세포 (37)의 높은 전이성 유도체를 사용합니다.- 형질 전환 이전에 24 시간, 플레이트 (1) × 10 antibio 2 ㎖에 60mm 조직 배양 접시에 5 EO771-LG 세포틱 무료 10 % FBS (소 태아 혈청) DMEM (둘 베코의 변형 이글 중간) 및 37 ° C에서 품어 5 % CO 2.
- 트랜시, 혈청 감소 배지 190 μl를 첨가하기 전에 30 분 동안 형질 감염 시약 10 μL와 형광 단백질 벡터의 2 μg의 부화.
- 워시 EO771-LG는 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (D-PBS)와 세포를 한 번 부드럽게 형질 믹스를 추가합니다.
- 6 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 품어.
- 2 일 동안 완전한 DMEM 2 ㎖ (10 % FBS, 1mM의 피루브산, 100 U / ㎖ 페니실린, / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg의)에 형질 감염된 세포와 문화를 씻으십시오.
- 멸균 PBS 2 ㎖로 세포를 씻으 0.25 % 트립신 EDTA 500 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 분 동안 품어.
- 세포 현탁액을 수집하고 완전한 DMEM의 1 이상의 볼륨과 혼합하고 280 x g에서 스핀 다운.
- 완전 DMEM 1 ㎖에 재현 탁하고 세포로 세포 배양을 확장10cm의 조직 배양 접시.
- 3 일 매체를 변경, 일주일 동안 완전한 DMEM과 문화의 8 ml의 G418 선택적 항생제의 700 ㎍ / ml에 추가하여 형질 전환 된 세포의 선택을 시작합니다.
- 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 39, 40에 의해 G418의 선택을 받고있는 형질 감염된 세포에서 형광 인구 풍부.
- PBS 5 ㎖로 세포를 씻으 1.5 ml의 0.25 %의 트립신을 추가합니다.
- 37 ° C에서 2 분 동안 품어하고 완전한 DMEM 적어도 하나의 볼륨으로 섞는다.
- 세포 현탁액을 수집하고 280 XG에 스핀 다운 및 멸균 0.1 %의 1 ㎖ (w / v)의 BSA / PBS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 40 μm의 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터링 및 정렬 0.1 % BSA / PBS 버퍼 1 ml의에 볼륨을 조정합니다.
- FACS 분류기 (41)를 사용하여 형광 스펙트럼에 기초하여 10 % 밝은 인구 FACS는 정렬 -.
- 다른 주 u를위한 문화 정렬 된 셀파인더 선택 (전체 DMEM 700 μg의 / ㎖의 G418).
- 세포 계측법 다시 한 번 단계 1.3.6에 1.3.1를 반복하여 흐름에 의해 형광 표지 된 세포를 다시 선택.
- (단계 1.3.1-1.3.4) 한 바와 같이 선택를 Trypsinize, 필터의 제 2 라운드에서 0.1 % BSA / PBS에 세포를 다시 일시. FACS 분류기를 사용하여 96 웰 플레이트에 정렬 단일 셀 2 × 10 6 세포 / ml로 농도를 조절합니다.
- 컬렉션의 전체 DMEM 100 ㎕로 3 ~ 96 웰 플레이트를 준비합니다. 정렬 후 생존율을 향상 EO771-LG 셀 (42)을 성장시켰다 요리에서 필터링 배지 100 μl를 추가합니다.
- 96 웰 플레이트로 세포를 선별 한 후, 2 일 동안 배양 세포 복귀 (37 ° C, 5 % CO 2).
- 5 배 배율에서 거꾸로 현미경으로 검사가 가능한 단일 클론과 우물을 확인합니다.
- 를 Trypsinize 및 실행 가능한 클론을 확장하여 백업을 위해 세포를 동결.
- GR에 우물을 씻으십시오멸균 PBS 100 ㎕와 클론을 때문에. V 트립신 / w 0.25 %의 50 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 분을 품어. 완전한 DMEM 50 μl를 추가하고 5 분 동안 280 XG에 스핀 다운 멸균 V-바닥 또는 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 전송할 수 있습니다.
- 재현 탁의 700 μg의 / ㎖의 G418 완전한 DMEM 100 ㎕의 세포를 12 웰 플레이트의 각 클론을 접시. 합류 할 때까지 G418와 문화 완전한 DMEM의 400 μl를 추가합니다.
- , PBS 500 μL와 우물을 씻어 0.25 % 트립신의 100 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 분을 품어. 완전한 DMEM의 100 μl를 추가하고 280 X g에서 5 분 동안 스핀 다운. 합류까지 6 웰 플레이트에서 G418 및 플레이트 세포 완전한 DMEM의 100 UL에서 세포를 재현 탁.
- 합류 후를 Trypsinize 세포는, 스핀 다운 및 FBS 10 % DMSO에 재현 탁 세포의 주식을 동결 할 수 있습니다.
- 자신의 전이성 잠재력의 평가를 위해 100mm 조직 문화 요리를 도금 문화의 세포 현탁액의 1/10을 유지합니다.
- 선택된 클론의 전이 가능성을 테스트합니다.
- 를 Trypsinize 및 ml의 2.5 × 10 6 세포 /의 농도로 생리 식염수 세포를 재 - 일시 중단 꼬리 정맥을 통해 정맥 C57BL / 6 마우스에 200 μl를 주입.
- 이전 23 바와 같이 이주 후, 폐 조직을 수집 표면 수나 stereological 방법 (43)에 의해 종양 부담을 정량화. 생체 내에 영상에 대한 높은 전이성 잠재력을 가진 클론을 선택합니다.
- MacBlue 기자 마우스 (44) (시안 형광 단백질 (CFP) 식 (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)를 구동 골수 특이 적 프로모터)를 올립니다.
참고 : 일반적으로, 8, 12 주 사이에 마우스가 사용되지만, 빠르면 7로하고 후반 20 주뿐만 아니라 작업을 테스트 한 마우스.
2. 다중 광자 현미경 세트 업 및 이미지 준비
주 :이 프로토콜은 모든 m에 대해 수행 될 수 있지만ultiphoton 현미경이 프로토콜에 도시 된 데이터를 획득하기 위해 사용되는 시스템을 상세히 45 이전에 설명되었다.
- 두 광자 레이저와 적어도 한 시간 앞으로 원하는 영상 시간의 검출기를 포함하여 모든 현미경과 레이저 구성 요소의 전원을 켭니다.
- 에 판독 단지 수술하기 전에 단지 현미경 전에 빔 경로의 광 파워 미터의 헤드를 배치하여 현미경 광 입력 전력을 측정하고, 880 nm에서의 최대 광 강도까지 레이저 단부 공동 미러 노브 조정 광 파워 미터.
3. 진공 시스템 설정
- 시아 노 아크릴 레이트와 이미징 창 (보충 그림 1)에 coverslip에 접착제. 완전히 건조 접착제에 적어도 4 시간을 허용합니다.
참고 :이 단계는 또한 미리 수행 할 수 있습니다. - 작은 구멍에서 첫 번째 줄에 100 μL 피펫 팁을 잘라 얇은 V에 포경 끝을 연결acuum 호스.
- 그림 1과 보조 그림 2에 따라 진공 시스템을 연결합니다.
- 에 진공 차단 개방 끝으로, <3 inHg와의 진공 조절기를 조정합니다.
주 : 진공 수준을 최종적으로 조정은 생체 내에서 혈관의 관찰에 의해 수행 될 것이다. - 이미징 플레이트에 의해 얻어 사악한에서 대물 렌즈 액침 매체를 방지하는 촬상 플레이트의 밑면에 석유 윤활제의 박막을 적용한다.
- 현미경 단계에있는 이미징 플레이트를 놓습니다.
주 : 사용자 촬상 판 (보조도 3) 1/8의 시트는 "두께의 알루미늄은 모두 스테이지 삽입 공간에 맞지 촬상 윈도우를 유지하는 중앙의 관통 구멍으로하는 가공. - 아래 커버 슬립와 이미징 플레이트에 진공 창을 삽입합니다.
- 소독 모든 표면 및 악기 이미징 스테이지 판을 포함, 및 이미징 승리70 % 에탄올로 다우.
- 진공 창에 피펫 팁의 절단 끝을 연결하고 영상 판까지 호스를 테이프.
- 이미징 창 목적 가까이 가져오고 목적과 커버 슬립 사이에 물의 큰 방울을 배치합니다.
- 진공 윈도우의 중앙 개구를 차단하고 객관적이고 커버 슬립 사이의 워터 드롭이 흡입되지 않는 것을 확인하여 커버 슬립에서 누출이 없는지 확인합니다.
참고 : 창 위에 배치 오래 된 스타일 컴퓨터 마우스 볼이 중앙 개구를 차단하는 데 유용합니다.
4. 수술
- 멸균 수술 영역을 준비합니다.
- 쉽게 이동할 수 있습니다 모든 악기를 놓습니다. 외과 영역 및 70 % 에탄올로 수술 도구를 포함하여 모든 표면 및 악기를 소독.
- 이중 매듭 부싱 위 카테터에 ¼ 인치를 2-0 봉합사의 3 인치의 길이를 묶어.
- 꼬리 정맥 카테터 FOL 준비Harney 등의 등. (46)에 의해 게시 된 프로토콜을 lowing의.
- ~ 5 분 꼬리 정맥에서 혈액 흐름을 증가시키고, 카테터의 삽입을 돕기 위해하기위한 적외선 (IR) 가열 램프를 사용하여, 그 장에 동물을 가온. 가열 램프 또는 온난화 패드를 사용하여 수술을 통해 생리적 온도로 가열 동물을 유지하는 것이 좋습니다.
- 5 % 이소 플루 란과 동물을 마취하고 발가락 핀치에 대한 응답이 없음을 확인합니다.
- 동물의 눈 안과 연고를 적용합니다.
- 동물의 좌측으로부터 모발을 제거하기 위해 10 ~ 30 초 동안 제모 로션 적용; 뒷면의 ¼에 가슴의 중간 선에서 바로 흉곽 아래에 잎 겨드랑이에서.
- 초과 로션을 청소하고 70 % 알코올에 노출 된 피부를 소독.
- 꼬리 정맥 카테터로 PBS로 가득 멸균 주사기를 부착하고 Harney 등의 알에 의해 게시 된 프로토콜 다음 장소에 삽입하고 테이프. 46. 테이프가 안전하게 바늘 자체에 부착하고, 꼬리와 테이프 사이의 간격에서 무료로하지 않습니다되어 있는지 확인합니다.
- 다스 등. (47)에 의해 또는 듀 페이지 등에 의한 게시 된 프로토콜 중 다음 마우스를 삽관. (48)
- 인공 호흡기의 전원을 켜고 분 당 135 호흡과 이소 플루 란 산소의 혼합물 200 μl를 공급하기 위해 설정합니다.
- 인공 호흡기에 기관 카테터를 연결합니다.
- 수술 영역으로 마우스를 이동합니다. 카테터을 제거하지 않도록 세심한주의를 기울입니다.
- 앞니에서 마우스의 코 주위에 2-0 봉합을 묶어.
- 주둥이에 카테터를 테이프입니다.
- 수술 분야에서 그것을 유지하기 위해 카테터에 왼쪽 앞다리를 테이프.
- 2.5 %의 유지 보수 레벨에 이소 플루 란 마취를 내리고 발가락 핀치에 대한 응답이없는 확인.
- 날카로운 가위를 사용하여, 왼쪽 가슴 벽 위에 피부의 1cm 2를 제거합니다.
- 리프트 t그는 지방 패드를 유선과 소작 펜으로 노출 된 혈관을 소작.
- 날카로운 가위로 절단하여 지방 패드를 절제.
- 날카로운 가위로 절단하여 흉곽에 근육 층을 제거합니다. 앞다리의 기지에서 겨드랑 정맥의 실행을 차단하지 않도록주의하십시오.
- 잡아 6 번째 늑골을 들어 올려 집게를 사용합니다. 얕은 각도에서 열린 날카로운 가위를 사용하여 (~ 5 °)은 피부의 구멍의 가장자리 근처에 리브를 잘라. 노출 된 폐 조직을 건드리지 않도록 세심한주의를 기울입니다.
- 연속 4 리브를 제거함으로써 전체 폐 로브를 노출 가슴 벽의 개구를 넓힐.
참고 : 마음을 피하기 위해 흉골에서 최소 5mm 거리에 개통을 유지합니다. - 조심스럽게 꼬리와 기관 카테터를 잡고 마우스를 올려 현미경 이미징 단계로 마우스를 이동합니다.
- 진공 해제로, PBS와 진공 윈도우의 챔버를 입력합니다.
- 마우스를 반전하고 노출 위치진공 촬상 창 위에 폐.
- 천천히 볼 밸브를 사용하여 수은의 약 3-5인치에 진공을 켭니다.
- 기업도 2에 도시 된 바와 같이 스테이지 판의 마우스와 테이프의 가슴 위에 두번 접은 반 휴지 이루어지는 구속 하네스 놓는다.
- 동물의 상부 허벅지에 맥박 산소 측정기의 허벅지 센서를 클립하고 소프트웨어를 시작합니다.
- 무대에 환경 챔버를 놓고 생리적 온도에서 마우스를 유지하기 위해 열을 켭니다.
- 마취를 유지하고 혈류를 유지하기 위해 1.5 %의 이소 플루 란의 레벨을 줄인다.
5. 생체 내에 영상
- 커버 슬립 근처 25 X 0.95의 개구 수 (NA)의 대물 렌즈를 가지고 그들 사이에 물의 큰 방울을 추가한다.
- 표면 형광 모드를 이용하여 FITC 채널을 확인하고 초점 폐 조직을 가지고.
- 수술 이전에 수행하지 않은 경우, 나는꼬리 정맥 카테터를 통한 nject 종양 세포.
- 꼬리 정맥 카테터에서 PBS 주사기를 분리합니다.
- 종양 세포 현탁액 (PBS 최대에서 2 × 107 세포 / ㎖) 100 ㎕와 함께 멸균 주사기를로드.
참고 :이 단계는 서로 다른 시간 지점에서 폐에 암 세포 도착을 연구하기 위해 사전에 수행 할 수 있습니다. - 꼬리 정맥 카테터에 종양 세포에 주사기를 연결합니다.
- 천천히 꼬리 정맥에 종양 세포를 주입.
- 꼬리 정맥 카테터에서 종양 세포와 주사기를 분리합니다.
- 꼬리 정맥 카테터에 PBS 주사기를 다시 연결합니다.
주 :이 주입 후 안구 통해 덱스 신호로부터 종양 세포를 구별하는 것이 곤란해진다로서 덱스 트란을 주입하기 전에 종양 세포 모두의 위치를 식별한다.
- 이미지에 종양 세포를 찾습니다
- 각각의 종양 세포 이미징을위한 모든 종양 세포를 찾아 번째로 그 위치를 기록소프트웨어의 전자 멀티 패널.
- 현미경 안구의 종양 세포를 관찰하여 이미지 뷰의 모든 필드를 찾습니다.
- 소프트웨어에서 멀티 포인트 버튼을 클릭하여 멀티 패널로 전환하고 추가 위치 버튼을 클릭하여 셀의 위치를 저장합니다.
- 모자이크 영상의 경우, 모자이크의 원점을 찾은 영상 좌표를 설정할
- 구조의 왼쪽 상단 모서리에 위치를 찾은 것은 캡처 할 수 있습니다.
- 스테이지 컨트롤러의 "제로"버튼을 눌러 스테이지의 제로 X, Y 및 Z 좌표.
- "로드"버튼을 클릭하고 목록을 선택하여 모자이크 좌표의 해당 목록을로드합니다.
주 : 볼 500 ㎛의 영역의 20 % 오버랩을 갖는 2 × 2의 모자이크에 대한 예시적인리스트가 될 것이다 : Pos.1 = (0,0), 순위. 2 = (400,0), 순위. 3 = (0400), 순위. 4 = (400400).
- 각각의 종양 세포 이미징을위한 모든 종양 세포를 찾아 번째로 그 위치를 기록소프트웨어의 전자 멀티 패널.
- 주사기 w를 제거꼬리 정맥 카테터 PBS i 번째 덱스 트란을 포함하는 주사기로 교체한다.
- 천천히 라인을 플러시 멸균 PBS의 50 μl를 주입 다음에 20 mg의 꼬리 정맥 카테터를 통해 마우스로 PBS에 용해 / ㎖ 155 kDa의 로다 민 - 덱스 트란 100 ㎕까지 주입. 라인에 모든 거품을 소개하지 마십시오. 마우스에게 투여 전량을 4 ㎖ / ㎏ / 인사를 초과하지 않도록, 필요에 덱스 트란을 암세포 주입 후, 1 시간 주입.
- 영상 매개 변수를 설정합니다.
- 광자 모드로 현미경을 전환합니다.
- 타이밍 신호 버튼을 클릭하여 줌 배율 필드를 업데이트하여 2 배의 배 줌을 설정합니다.
- 레이저 파워를 조정에 ~ 10 % (~ 샘플에서 10 ~ 15 MW) (10)에 지진 해일 전원 슬라이더를 조정 한 후 검출기 및 레이저 버튼을 클릭하여.
- 이미지 각 위치는 종양 세포의 존재를 확인하고 vascu의 흐름과 무결성을 시각화lature.
참고 : 선박이 완전히 흐르는 적혈구와 관류 나타납니다해야하며, 형광 덱스 트란이 혈관 외 공간에 누출하지 않고 용기 내에 포함되어야한다. 약 10-20 종양 세포는 진공 창 투명 개구 내에있을 것으로 예상된다. - 각 위치의 시작 농도를 조정하는 촬상한다.
- 각각의 위치는, 이미지에 대한 종양 세포의 정상 슬라이스 스테이지 제어부에 초점 노브의 회전에 의해 Z 방향 위치를 조정한다.
- 시야의 중심에있는 셀을 배치.
- 는 멀티 버튼을 클릭하여 선택하고 지점 목록에서 셀의 저장 위치를 대체하기 위해 삭제 버튼 다음 추가를 클릭하여보기의 필드의 위치를 클릭합니다.
- 시각 각 위치에서의 종양 세포의 상대적인 밝기를 관찰한다.
- 다 지점 패널에서 저장 버튼을 클릭하여 각 셀의 새 위치를 저장파일 이름을 지정 거라고.
- 개별 종양 세포의 이미징의 경우, 약 동등한 밝기의 3 개의 셀을 선택하고 삭제 버튼을 클릭 한 다음 목록에서 자신의 위치를 클릭하여 다중 목록에서 다른 모든 위치를 삭제합니다.
- 감지기 및 레이저 버튼을 클릭하고 신호가 포화 미만이라는 녹색과 적색 채널 45 그렇게의 PMT의 이익을 위해 슬라이더를 조정합니다.
- 대 식세포는 시안 표시 그래서 파랑 채널 (45)의 슬라이더를 조정합니다.
주 : 모든 두 번째 고조파 신호 만 청색 채널에 나타나고 채널 감산 절차에 따라 시안 식세포로부터 분리 될 수있는 이전 (45)을 설명했다. - 0 μm의에 Z-스택 시작 깊이와 각각 위치로 Z 스테이지를 이동하고 시작을 클릭하고 종료 버튼을 24 μm의 최종 깊이를 설정합니다.
참고 :이 깊이 내에서 세포는 가장 좋은 신호로 가시화 될 것이다소음 및 해상도. - 3 μm의는 z 스텝 크기를 설정합니다.
- 다음 파라미터 촬상 파라미터는 이전에 설명 45,49 설정한다.
- 개별 종양 세포의 이미징의 경우, 타이밍 신호 버튼을 클릭 한 다음 (1.5 배의 줌 배율에 해당) 줌 배율 필드, 프레임 평균 필드에 3 입력 시간 경과 버튼을 클릭하고 10을 입력으로 4 V를 입력 시간 경과 필드에.
참고 :이 설정은 1 프레임마다 3 초를 취득합니다. - 모자이크 영상의 경우, 타이밍 신호 버튼을 클릭하고 (4 배의 줌 배율에 상당) 1.5 V의 줌 배율을 입력 프레임 평균의 수에 3을 입력하고 시간 경과 버튼을 클릭하고 시간 -에 10를 입력 시간 지연 필드 경과.
참고 :이 설정은 1 프레임마다 3 초를 취득합니다.
- 개별 종양 세포의 이미징의 경우, 타이밍 신호 버튼을 클릭 한 다음 (1.5 배의 줌 배율에 해당) 줌 배율 필드, 프레임 평균 필드에 3 입력 시간 경과 버튼을 클릭하고 10을 입력으로 4 V를 입력 시간 경과 필드에.
- 해당 버튼을 클릭하여 멀티, Z-스택 t 경과 영상 모드를 활성화합니다.
- 이미지를 수집 할 수있는 녹음 버튼을 누릅니다.
아니E : 폐 조직이 매우 섬세하고 사진 손상에 영향을 받기 쉽다. 다른 필드의 시간 경과 이미징 혈액 흐름이 이미지화 된 필드에 정지 된 후, 레이저가 가장 가능성이있는 경우 너무 높은 이후의 영상은 낮은 전력에서 수행해야합니다. - 매 30-45 분 천천히 동물의 수화를 유지하기 위해 PBS 또는 식염수 50 ㎕를 주입.
6. 안락사
- 5 %로 이소 플루 란을 늘립니다.
- 그것은 호흡과 무대에서 동물을 제거하기 위해 중단 후 30 초까지 5 % 이소 플루 란에서 동물을 유지합니다.
- 완전한 안락사을 보장하기 위해 자궁 경부 전위를 수행합니다.
7. 이미지 분석
- 단일 세포 이미징 실험 :
- 피지에 이미지를로드하고 Hyperstack로 포맷합니다.
- Hyperstack 각 Z 슬라이스의 경우, 시간 경과 동영상을 재생 및 잔류 XY 운동을 찾습니다. 잔류 XY 운동이 발견되는 경우에 스택 (36)이라고 StackReg 플러그인 적용움직임을 제거한다.
- 모자이크 영상 실험의 경우 :
- 피지로 이미지를로드 및 디렉토리, 파일베이스 명, 모자이크 x 및 y 필드의 수와 개수와 화상에 관한 모자이크 스티칭 매크로 (기업 코드 파일 모자이크 스티치) 및 입력 정보를 열어 그것들을 함께 스티치 조각의 시점.
참고 : 자바 디렉토리를 해석하는 방법으로 인해, 폴더 이름은 하위 폴더 구분 기호로 두 개의 백 슬래시가 있어야합니다. 내장 된 플러그인 인접 쌍 바느질의 제한으로 인해, 기본 파일 이름은 대시를 포함 할 수 없습니다. - 혈관의 경계를 명확하게보기를 얻기 위해, 하나의 화상으로 통합 혈액 채널의 시점을 모두 평균 한 후, 다른 채널의 동영상의 각 프레임의 배경이 이미지를 복제.
참고 :이 단순히 혈액 평균화를 수행 매크로를 실행하면됩니다 (기업 코드 파일이 혈액 평균화를 수행합니다). - Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
- Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
- Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
- Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
- Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
- Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
- Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
- St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
- Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
- De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
- Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F.
- Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
- Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
- Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
- Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
- Gross, A., et al.
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
- Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
- Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).
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Representative Results
이 방법으로 얻을 수있는 결과의 유형을 설명하기 위해, 수술 전에 시점 변화에 MacBlue 마우스 (44)의 꼬리 정맥에 형광 단백질 클로버 표지 E0771-LG 종양 세포 주입. 수술 후, 155 가와사끼 로다 민 표지 된 덱스 트란은 혈관과 시간 경과 영상이 수행 된 표시하는 IV를 주입 하였다.
쥐 24 시간 후 분사를 이미징 할 때, 하나의 세포는 대 식세포와 단핵 세포와의 상호 작용, 혈관의 안쪽에 볼 수 있습니다. 이것의 예는도 2A (보조 영화 1)에 나타낸다. 그것은 일시적 거주자의 대 식세포 (시안)과 상호 작용으로 여기에 12 μm의 깊이가 폐 혈관에 박혀 독방 종양 세포 (녹색)의 단일 광학 부분은 5 시간 20 분에 걸쳐 이미징된다. 혈관은 고 분자량 덱스 트란에 의해 표시된다. 의 안정성이미징 필드의 연속 Z 스택 영상 획득 될 수 있고, 3 차원의 재구성이 (도 2B, 기업 영화 2)을 만들 수 있도록한다.
모자이크 영상의 프로토콜에 기재된 현미경 설정을 사용하면 볼의 단일 필드보다 큰 구조의 이미징을 허용한다. 예를 들어, 그림 3은 하나의 전이성 병변의 인수를 보여 12 일 주입을 게시 할 수 있습니다. 폐의 표면 아래 25 μm의 (그림 3A, 오른쪽 패널)이 5 × 5 모자이크는 (보충 영화 3 패널 왼쪽 그림 3A) 15에서 205 분에 걸쳐보기 890 μm의 필드를 보여줍니다. 염색체 분리 (그림 3B, 기업에 의해 입증보기의 큰 필드에도 불구하고, 모자이크를 구성하는 기본 프레임의 고해상도는 단일 세포의 유사 분열로 세포 내 이벤트를 캡처 할 수 있습니다영화 4).
고 분자량의 혈관 내 주입은 형광 그러나 적혈구 및 백혈구는 덱스 트란을 폐색 순환 레이블이 지정되지 않은, 혈관 내강의 라벨에 덱스 트란 결과를 표시. 폐의 작은 모세 혈관에서 폐색 완전한 덱스 트란 신호의 점멸 발생 및 혈관의 경계를 정의하는 손실 (; 기업 영화 5 좌측도 4)이다. 이 프로토콜에 의해 제공되는 높은 안정성 공간 따라서 임시 폐색 복원 번짐없이 혈액 채널의 시간 평균을 허용한다. 다른 신호 채널은 혈관의 경계 (; 기업 영화 6,도 4, 오른쪽)의 명확한 도면을 제공하기 위해 혈관계에 중첩 될 수있다.
그림 2 : 폐에서 단일 세포 이미징 (A) 아직도 폐의 모세 혈관 침대에서 단일 종양 세포의 시간 경과 영화에서 24 시간 꼬리 정맥 후.주입. (빨간색 = 혈관, 녹색 = 종양 세포, 시안 = 식세포) (B) 안정 영상은 시간이 지남에 따라 영상 데이터의 세 가지 차원 재구성 할 수 있습니다. 혈관 시간 명확성을 위해 평균화되었다. (빨간색 = 혈관은 녹색 = 종양 세포, 블루 = 식세포). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 폐의 안정성은 복수의 낮은 배율 필드의 연속 수집 및 바느질에 의해 폐의 고해상도보기 이미지의 큰 필드를 할 수 있습니다 (A)의보기의 890 μm의 필드를 나타내는 5 × 5 모자이크. 십이일 폐 표면 아래로 15㎛의 찍은 종양 세포의 꼬리 정맥 주사 후 폐 전이성 병변(왼쪽 패널). 오른쪽 패널은 폐 표면 아래 25 μm의에서 같은 전이성 병변을 보여줍니다. (B) 각각의 고해상도 필드는 염색체 정렬 (노란색 화살표)와 세포 분열 동안 분리 (빨간색 화살표)로 세포 내 프로세스를 알 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 고 분자량 덱스 트란 마크 혈관의 루멘 레이블이 찬란의 혈관 내 주입 레이블이없는 적혈구 및 기타 순환 세포가 깜박이는 효과 어둡게의 결과로 시간 이동 불완전한 라벨의 형광 신호 (A) 폐색 결과를 폐색하는 경우를 제외하고 혈관 경계. (B) 고진공 창의 공간적 안정성 혈액 채널 시간 임시 폐색 채우는 명확 혈관의 경계를 정의 평균화 될 수있다. 다른 채널을 한 후 평균없이 중첩되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 년 | 먼저 저자 / 마지막 저자 | 동물 | 외과 | 영상의 종류 | 노트 |
| 1,926 | Wearn 및 독일어 | 고양이 | 가슴 벽 흉막 층 아래로 잘라. 제 2 개구는 아래로 조명 늑막에 진동판을했다. | 밝은 필드 현미경. | 흉막 벽을 통해 먼저 "창". |
| 1,939 | 테리 직물 | 고양이 갈비뼈가.에, 1을 분리 창 주입, 공기는 진공 가슴에서 제거. | 편광 조명을 사용하여 양안 피부 현미경. | 제 1 광학 창을 이식. 중고 진공 창으로 조직을 그립니다. | |
| 1,963 | 드 알바 & 라이너 | 토끼 및 개 | 하나 또는 두 개의 리브는 절제와 1. 창 삽입 가슴 벽에 봉합된다. 피부는 창을 치유 할 수 동물에 걸쳐 폐쇄되었다. 촬상 전에, 피부를 윈도우를 노출 해부 하였다. | 저 잡지 (11X) 목표를 통해 중고 고속 스트로보 촬영. | 첫 번째 생존 창. |
| 1,965 | 바그너 & Filley | 개 | 오른쪽 앞다리는 1 리브 컷을 제거하고 창을 삽입하고 봉합. | 22X 목표와 반사 현미경. | 진공없이 먼저 상대적으로 움직임 무료 창. |
| 바그너 | 개 | 하나의 리브는에, 3을 절제한다. 창이 이식. 창 플랜지 스레드 나사 흉벽에 시일을 형성한다. | 높은 배율 100X 오일 침지 목적으로 시야 현미경. | 첫 번째 창은 조직의 움직임을 안정시키기 위해 진공을 사용합니다. | |
| 1,992 | GROH & 게츠 | 토끼 | 하나의 리브에 1.2을 절제. 창 이식. 창 플랜지 스레드 나사 흉벽에 시일을 형성한다. 진공 적용했다. | 25X 목표와 Epifluorescent 현미경. | 표면 형광와 진공 창 처음 사용. |
| 1,994 | Fingar & Wieman | 쥐 | 2 리브.에, 1을 절제 창이 이식과 가슴 벽과 피부에 봉합된다. | 40X 목표와 Epifluorescent 현미경. | 쥐의 첫 번째 생존 창. |
| 2,000 | Funakoshi 및 미쓰이 | 마우스 | 전체 가슴 벽을 제거. 진공 흡입 링은 우측 폐에 연결합니다. | 20 배 목표와 공 초점 현미경. | 마우스 진공 창 처음 사용. |
| 2,005 | 람 및 Glenny | 쥐 | 전체 가슴 벽에, 1을 제거. 창은 폐에 연결합니다. | 20 배 목표와 반사 및 epifluorescent 현미경. | 쥐 진공 창 처음 사용. |
| 2,008 | 타 부치 & Keubler | 마우스 | 3 갈비뼈가 절제되어, 플라스틱 필름은 가슴 벽에 구멍을 밀봉 개방에 적용. 에어 흉부 내 카테터를 통해 제거. | 20X 목표와 Epifluorescent 현미경. | 첫 번째는 가슴 벽에 구멍을 밀봉 플라스틱 필름을 사용할 수 있습니다. |
표 1 : (STABLE)의 역사 설문 조사생체 내에 폐 이미징의 Windows opment. 많은 새로운 생체 내에 폐 촬상 창 최근은 조직 안정화 진공을 이용한 세포 내 및 세부 사항을 드러내 가능하도록 충분히 높은 해상도를 달성하는, 마우스에 사용되는 소형으로 수년에 걸쳐 개발되어왔다.
보충 그림 1 : 진공 이미징 윈도우의 드로잉 디자인 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2 : 진공 설정의 사진은 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3 : 디자인 Drawi무대 플레이트 삽입의 NG는 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
기업 영화 1.도 2a에 스틸의 영화 (오른쪽 다운로드 클릭).
기업 이동 2 :. 다른 시청 각도와 시간에 진행을 보여주는 그림 2b에 도시 3D 재건의 영화 (오른쪽 다운로드 클릭).
보충 영화 3 :. 폐 표면 아래 15 μm의에서 그림 3a에 도시 5 × 5 모자이크의 영화 (오른쪽 다운로드 클릭).
보충 영화 4 :. 폐에서 유사 분열을 겪고도 3b에 도시 된 단일 셀의 영화 (오른쪽 다운로드 클릭).
보충 영화 5 : 그림 4의 영화, 폐쇄 및 피를 보여주는 왼쪽 패널매질. (오른쪽 다운로드 클릭).
보충 영화 6 :. 그림 4의 영화, 혈액 평균 후 혈관 정의의 회복을 보여주는 오른쪽 패널 (오른쪽 다운로드 클릭).
기업 코드 파일 :. 모자이크 바느질 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
기업 코드 파일 :. 혈액 평균화를 수행하여 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단백질 및 항체로 형광 표지 기능 태그와 함께 생체 광학 영상에서 높은 해상도는 전이성 캐스케이드에 대한 우리의 이해를 증가 극적으로했다. 이는 직접적인 시각화 및 단일 셀 및 종양 세포의 서브 세포 매개 숙주 세포 및 미세 정량화있게되었다. 기본 종양 내에서이 영상은 성장 침입 또는 보급 6,7 중 하나의지지 이산 미세 환경의 발견, 예를 들어, 주도하고있다. 침략의 경우, 생체 내 이미징은 intravasation 7,50에서 대 식세포 및 종양 세포의 공동 migrational 스트리밍의 우선적 인 역할을 공개했다.
폐와 같은 보조 사이트, 종양 세포의 하나의 작은 그룹이 도착했을 때, 전이의 초기 단계에서 종양 세포 행동의 역학을 이해하는 사전 미세 전이의 시드 단계를 포함 및상기 혈관 내피 세포와 상호 작용 만 고해상도 광학 영상을 이용하여 달성된다. 표준 임상 이미징을 모세관 층의 미세 구조 또는 단일 셀 해상도 세포의 형태 및 상호 작용 중 하나를 시각화하는데 필요한 해상도가 없다. 이 프로토콜에서 제시하는 영상 기술이 어려운 작업을 수행.
이러한 관류를 포함하여 적절한 폐 생리학, 면역 시스템에 연결을 유지하고 세포 역학 단지 정적 뷰 이상을 제공함으로써 생체 폐 준비를 통해 표 1 이벤트에 상당한 이점을 열거 된 바와 같은 생체 내에 영상 창. 진공은 특정 제공에 삼차원 재구성 (그림 2B) 및보기 모자이크 영상의 큰 필드에 대한 기능을 가능하게 높은 등록 된 이미지의 취득을 허용 조직 안정성의 수준, (그림 창을 안정화우레의 3A). 이 두 심지어 염색체 분리를 공개하고 휴면 및 분할 종양 세포 (그림 3B)를 구별 할 수있는 서브 셀룰러보기로, 조직 형태를 제공하는 조직 학적 유형 저배율보기에서, 폐의 전망의 범위를 제공합니다. 다수의 수집 채널은 여러 유형의 세포와의 상호 작용을 동시에 가시화 (도 2A)되도록.
프로토콜이 최대 12 시간의 절차 및 이미징 시대의 성공률을 개선 할 몇 가지 중요한 단계 및 포인트에 약간의 기술, 연습과 관심을 수행하는 동안 예상 될 수있다. 폐 조직이 잘 창 (단계 4.25) 위에 중심되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 진공 폐 조직 (단계 4.27)에 걸쳐 균일 완전히인가되는 것을 보장한다. 조직을 중심 않으면 조직의 움직임에 발생합니다. 구속 하네스 (보충 그림 2) t를 사용오 동물이 걸리는 자연 호흡 중 늑간 근육의 수축에 의해 유도 된 움직임을 줄일 수 있습니다. 이 마우스를 통해 아늑한하지만, 가슴을 압축하지해야합니다. 너무 많이 압축 마우스의 감소 된 가능성에 폐의 돌출부뿐만 아니라 심장 및 모든 결과에 압력을 둔다. 덱스 트란 사출 (단계 5.8) 후 폐 혈관에 흐르는 관찰되지 않는 경우, 폐 조직은 수술 중에 부적절한 취급 손상이나 진공 레벨이 너무 높으면되는 하나. 0.5-1 인치 수은에 의한 진공을 절감하는 흐름이 복원됩니다 있는지 확인하기 위해 시도 할 수 있습니다. 흐름이 복원되지 않는 경우가 흐름이지만, 덱스 트란 extravascularly 관찰되었을 경우, 폐 조직은 해당 지역에 손상되어 있으며 이미지를 볼 때 다른 필드 필요할 것이다. 촬상 영역에서 적절한 혈액 흐름의 유지는 적절한 생리 측정되는 것을 보장하는 것이 중요하다. 산소는 VAS 통하여 폐포의 내부 조직에 공급되지 않기 때문에culature, 허혈성 저산소증는 어렵다. 그러나 unperfused 혈관은 잠재적으로 변경된 산소 / CO 2 수준을 초래할 수 있으며, 관심의 조직에 도달하는 백혈구를 순환 방지 할 수 있습니다. 흐르는 적혈구 시각화 적절한 폐 기능의 지표로서 사용될 수있다. 폐 조직은 매우 섬세하고 사진 손상도 영향을 받기 쉽다. 다른 필드의 시간 경과 이미징 혈액 흐름이 이미지화 된 필드에 정지 된 후, 레이저가 가장 가능성이있는 경우 너무 높은 이후의 영상은 낮은 전력에서 수행해야합니다. 형질 감염된 세포 (네 번 평균 휘도를 갖는다) 또는 GFP 클로버를 사용하면 우리는 광 손상없이 충분히 밝은 이미지를 생성 할 수있는 샘플을 ~ 10 내지 15 mW의 발견했다. 형광 단백질의 최소 휘도 레벨은 현미경을 매개하고, 세포의 발현 수준에 크게 의존하며, 경험적으로 시험되어야한다.
이 프로토콜에서, 종양 세포는 밝은 cytoplas으로 표시되는셀 본체와 단백질 (즉, 핵)을 제외 세포 내 공간의 명확한 전망을 제공 마이크 형광 단백질. 대 식세포는 암세포로 형질 전환 마우스 모델 동계를 이용하여 라벨링된다. 두 세포 유형에 레이블은 실시간으로 자신의 직접적인 상호 작용의 시각화를 가능하게한다. 촬상의 연장 기간은 암세포는 생리 관련 컨텍스트에서 대 식세포에 작용하는 빈도, 기간 및 정도를 정량화 할 수있다.
제대로 수행하면,이 절차는 최대 12 시간의 기간 동안 그대로 폐에 모션 무료, 다중 채널, 고해상도, 단일 세포 이미징을 할 수 있습니다. 이러한 전자 줌위한 25X 0.95NA 및 광자의 능력 및 높은 개구 수의 대물 렌즈의 사용은 지금까지 본 폐에서 가장 높은 해상도의 광학 영상을 허용한다.
혈관 내 주입 형광등, 고 분자량 덱스 트란 체육혈관 공간 라벨과 무결성을 검증의 이중 역할을 rforms. 155 kDa의 덱스 트란은 interendothelial 공간으로의 확산을 방지하기 위해 사용된다. 혈관의 흐름이나 혈관 외 공간으로 혈관 누출의 부족의 흔적으로 인해 부적절한 취급이나 과도한 진공 조직의 손상을 나타냅니다.
마지막으로, 고유 이미지 프로세싱 기술이 프로토콜의 안정성이 높은 공간 활용이 사용될 수있다. 그들이 모세 혈관을 통과 할 때 레이블이없는 적혈구와 다른 백혈구는 형광 덱스 트란을 제외하기 때문에,이 신호는 자신이 만든 것을 점멸을 제거하는 시간이 평균 될 수있다. 이것은 혈관의 잘 정의 된보기 불가능 그렇지 않으면를 제공합니다.
이 기술의 한계, (예를 들면 후기의 전이성 암을 잠재적으로 동물을 약화 질병의 연구를위한 사용을 복잡하게 수술의 침략적 성격을 모두 포함급성 겸상 적혈구 빈혈), 긴 불구 (12 시간까지가 단일로 사용 제한 수술 단말기라는 사실), 촬상 세션. 또한, 화상 회의와 마우스 (51)의 낮은 간 글리코겐 예비의 긴 기간 주어진 포도당 섭취는 실험에 바이어스 전위 소스를 방지하기 위해 제공 될 수있다.
이 프로토콜은 잠재적으로 또는 실시간으로 다른 구조 또는 세포 유형 라벨 위하여 덱스 트란 외에 어느 곳에 주사 형광 표지 된 항체로 변형 될 수있다. 이 분석하고 직접 실시간으로 종양 세포 숙주 세포의 상호 작용과 역학을 시각화하여 종양 미세 환경을 해부의 기능을 확장합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155 kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | - | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter | Kent Scientific | Pulse Oximeter | |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
