This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Metastaser til sekundære områder som lunger, lever og bein er en traumatisk hendelse med en dødelighet på ca 90% en. Av disse områdene, er det lunge den mest vanskelig å vurdere ved å bruke intra optisk avbildning på grunn av sin lukkede posisjon inne i legemet, skjøre natur og vital rolle i å opprettholde riktig fysiologi. Mens kliniske modaliteter (positronemisjonstomografi (PET), magnetisk resonans imaging (MRI) og computertomografi (CT)) er i stand til å tilby ikke-invasive bilder av dette vevet, de mangler den oppløsningen som er nødvendig for å visualisere de tidligste seeding arrangementer, med en enkelt piksel som består av nesten tusen celler. Aktuelle modeller av metastatisk lungesykdom seeding postulat at hendelser like etter en svulst celle ankomst er deterministisk for overlevelse og påfølgende vekst. Dette betyr at sanntidsintraavbildningsverktøy med enkelt celle oppløsning 2 er nødvendig for å definere de fenotyper av seeding cells og teste disse modellene. Mens høy oppløsning optisk avbildning av lungen har blitt utført ved anvendelse av forskjellige ex vivo preparater, disse eksperimentene er typisk enkelt tids-punktprøvene, og er utsatt for artefakter og eventuelle feilaktige konklusjoner etter den dramatisk endret omgivelsene (temperatur, overflod, cytokiner, etc. ) som følge av fjerning fra brysthulen og sirkulasjonssystemet 3. Nyere arbeider har vist at time-lapse intra optisk avbildning av det intakte lungen blir mulig ved hjelp av en vakuum stabilisert bildevinduet 2,4,5 har imidlertid typisk bilde ganger vært begrenset til omtrent 6 timer. Her beskriver vi en protokoll for å utføre langtidsintra time-lapse avbildning av lungene anvendelse av et slikt vindu i løpet av en periode på 12 timer. Time-lapse bildesekvenser som oppnås ved hjelp av denne metoden gi visualisering og kvantifisering av celle-celle interaksjoner, membran dynamikk og vaskulær perfusjon i lungene. Vi videre describe et bildebehandlingsteknikk som gir en uhørt klar utsikt til lunge microvasculature.
Høy oppløsning intra optisk avbildning har vist seg å være avgjørende for å forstå mange biologiske prosesser, slik at enkelt-celle og sub-cellulære parametre som skal måles og kvantifiseres. I kreftforskning har intravital avbildning av tumor og stromale celler førte til oppdagelsen av mange microenvironmental interaksjoner 6-11 som bare er til stede i det intakte dyr.
Oppdagelser om microenvironments forbundet med intravasation og spredning av kreftceller i brystkreft ved hjelp av enkelt celle oppløsning optisk imaging in vivo har selv ført til nye markører for prognose og behandlingsrespons hos brystkreftpasienter 12-16. De beste bildeteknologi tilgjengelig for visning dypt inne intakte indre vitale organer er de kliniske modaliteter (MRI, PET, CT) som tilbyr utmerket utsikt over hele organet og kan avsløre sykdommer selv før de produserer kliniske symptomer. De er ikke i stand, hsom fører til, for å avsløre de tidligste stadier av metastasering og de cellulære mekanismer som driver tumorutvikling på grunn av deres mangel på enkeltcelle-oppløsning. Etter den tid lungemetastaser er synlige i disse modaliteter, de er godt etablert og voksende. Gitt den anslår at 90% av disseminerte tumorceller som kommer til lungen heller ikke overlever 17 eller innledningsvis forbli hvil 18, og den observasjon at de kommer langt tidligere enn tidligere antatt 19, å avbilde de tidligste trinnene for ankomst og overlevelse blir avgjørende for å å forstå prosessen med metastatisk såing og tilbakefall av tumorvekst ved fjerntliggende områder.
Utføre disse observasjonene i lungen har vist seg svært vanskelig imidlertid; de aller fleste imaging studier har benyttet ex vivo eller eksplantering preparater 20-23, som bare gir et blikk inn i lungene ved enkelt tidspunkter. Selv om disse preparatene kan gi oss nyttig infobekreftelse, de gir ikke en fullstendig forståelse av samspillet, årsak og virkning relasjoner, og dynamikken som oppstår mellom de ulike komponentene i mikromiljøet. Mangelen på en skikkelig sirkulasjonssystemet (og samtidig ubalanse av homeostase) og frakobling fra resten av kroppens immunsystem gjør det ønskelig å validere konklusjoner som disse preparatene genererer i intakt vev in vivo.
Mange grupper har utført intra avbildning av det intakte lunge 2,4,5,24-33 med Wearn og tysk å være den første til å kirurgisk eksponere pleural lag 24 og Terry den første til å utnytte en implanterbar bildevinduet 25.
Høy oppløsning i lungen er sterkt hindret av lunge konstant bevegelse og flere teknikker har blitt utviklet for å overvinne denne begrensningen. Wagner og Filley 27 studerte den naturlige bevegelse av canine lungeog utviklet sin kirurgiske protokollen til å finne sin implantert vindu over en relativt stasjonær region mens Wagner utnyttet vakuumet i vinduet hans kirurgisk forberedelse til å immobilisere vevet 28. Siden den gang har en rekke teknikker blitt benyttet til bilde lungene inkludert: bronkie klem, sekvensiell apnea og gated bildebehandling, oversamples oppkjøp, liming av lungen lapp og vakuum 34. Hver av disse har sine fordeler og ulemper, og ingen teknikk har dukket opp som bedre enn en annen 34. For eksempel, bronkie klem og sekvensiell apné endre den normale utveksling av gasser i lungen, og kan føre til atelektase. Lukket bildebehandling og oversamples oppkjøpet ikke lider av disse ulempene, men krever høy hastighet eller spesialisert tenkelig utstyr ikke allment tilgjengelig. Endelig er både liming av lungen og vakuumteknikken unngå begge de ovennevnte ulemper, men kan utvise skjærkraft indusert skade hvis behandling er ikke takno. I de senere år har vakuum vinduet blitt miniatyrisert og tilpasset for bruk i mus ved hjelp av konfokal mikroskopi og multiphoton 4,5,33 og utmerket høy-oppløsning avbildning er blitt oppnådd 2. Tabell 1 oppsummerer denne rike historie og fremhever de papirer som beskriver nye fremskritt i bruk av intra lunge bilde vinduer.
Denne protokollen beskriver bruk av utvidede time-lapse multiphoton intravital mikroskopi av bildet metastaser i lever, lunge intakt med den høyeste subcellulære mulig oppløsning. Bildene er kjøpt for opp til 12 timer ved hjelp av en multiphoton mikroskop utstyrt med en høy numerisk apertur objektiv og flere fotomultiplikatorrør (PMT) detektorer. Transgene musemodeller anvendes for å fluorescerende merke opprinnelige makrofager sammen med fluoriserende høy molekylvekt, dekstran og fluorescerende protein transfekterte tumorceller (for å merke vaskulaturen og tumorceller hhv støttevalseney). Selv om dette valget av fluorescerende merkede celler muliggjør visualisering av tumorcelle-endotelial celle-makrofag-interaksjoner og dynamikk, vil denne protokollen fungere for en hvilken som helst stamme av fluorescerende eller ikke-fluorescerende mus. Etter oppkjøpet blir rest drift bevegelse (hvis noen) elimineres ved hjelp av en Fiji plugin 35,36 og egendefinerte makroer tid gjennomsnittlig vaskulær kanal for å eliminere blinkende forårsaket av umerkede sirkulerende blodceller.
Selv om denne protokollen fokuserer på avbildningsmetastase, de teknikker som er anvendbare for mange andre biologiske prosesser observerbare med høy oppløsning encellet avbildning i lungen.
Høy oppløsning in vivo optisk avbildning kombinert med fluorescensmerkede funksjonelle koder som proteiner og antistoffer har dramatisk økt vår forståelse av metastatisk kaskade. Det har gjort det mulig direkte visualisering og kvantifisering av enkelt-celle og sub-cellulære parametre i tumorceller, vertsceller og deres mikromiljø. Denne avbildning innenfor den primære svulsten har ført, for eksempel, til oppdagelsen av diskrete mikromiljøer som er støttende for enten vekst eller spredning invasjon <…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
Depillatory Lotion | Nair | – | |
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
Oxygen | TechAir | OX TM | |
1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
96 Well Plate | Costar | 3599 | |
60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |