Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Långsiktig Högupplösta Intravital Mikroskopi i lungan med en vakuum Stabiliserad Imaging Fönster

Published: October 6, 2016 doi: 10.3791/54603
Automatic Translation
1, 5, 1,2, 1,2,5, 3,4, 3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

Abstract

Metastas till sekundära platser såsom lunga, lever och ben är en traumatisk händelse med en dödlighet på cirka 90% 1. Av dessa platser, är den svåraste att bedöma med hjälp av intravital optisk avbildning lungan på grund av dess slutna läge i kroppen, delikat natur och viktig roll för att upprätthålla korrekt fysiologi. Medan kliniska modaliteter (positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonanstomografi (MRT) och datortomografi (CT)) kan tillhandahålla icke-invasiva bilder av denna vävnad, de saknar upplösning som krävs för att visualisera de tidigaste sådd händelser, med en enda pixel bestående av nästan tusen celler. Nuvarande modeller av metastaserad lung sådd postulat att händelser strax efter en tumörcell ankomst är deterministiska för överlevnad och efterföljande tillväxt. Detta innebär att i realtid intravital bildframställning med en enda cell upplösning 2 krävs för att definiera fenotyper av sådd cells och testa dessa modeller. Medan hög upplösning optisk avbildning av lungan har utförts med användning av olika ex vivo preparat, dessa experiment är typiskt enda tidspunktsanalyser och är känsliga för artefakter och eventuella felaktiga slutsatser på grund av den drastiskt förändrad miljö (temperatur, profusion, cytokiner, etc. ) till följd av avlägsnande från brösthålan och cirkulationssystemet 3. Senaste arbete har visat att tidsförlopp intravital optisk avbildning av den intakta lungan är möjlig med hjälp av en vakuum stabiliserad avbildning fönster 2,4,5 har dock typiska avbildnings gånger varit begränsade till cirka 6 timmar. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra långsiktiga intravital tidsförlopp avbildning av lungan med användning av ett sådant fönster under en period av 12 h. Time-lapse bildsekvenser erhålls med denna metod möjliggör visualisering och kvantifiering av cell-cell interaktioner, membrandynamik och vaskulär perfusion i lungan. Vi ytterligare dEscribe en bildbehandlingsteknik som ger en exempellöst tydlig bild av lungan mikrovaskulaturen.

Introduction

Högupplöst intravital optisk avbildning har visat sig vara avgörande för att förstå många biologiska processer, vilket gör encelliga och sub-cellulära parametrar som skall mätas och kvantifieras. I cancerforskningen har intravital avbildning av tumör och stromaceller ledde till upptäckten av många microenvironmental interaktioner 6-11 som endast förekommer i det intakta djuret.

Upptäckter om mikromiljöer i samband med intravasering och spridning av tumörceller i bröstcancer med hjälp av en enda cell upplösning optisk avbildning in vivo har även lett till nya markörer för prognos och svar på behandling i bröstcancerpatienter 12-16. De bästa avbildningstekniker tillgängliga för visning djupt inom intakta inre vitala organ är de kliniska modaliteter (MRI, PET, CT) som erbjuder utmärkt utsikt över hela organet och kan avslöja sjukdomar innan de producerar kliniska symtom. De är inte, however, för att avslöja de tidigaste stadierna av metastaser och de cellulära mekanismer som driver tumörprogression på grund av deras brist på en enda cell upplösning. Vid tiden lungmetastaser är synliga i dessa villkor, de är väl etablerade och breder ut sig. Med tanke på uppskattningen att 90% av spridda tumörceller som anländer till lungan antingen inte överlever 17 eller initialt förblir vilande 18, och observationen att de anländer mycket tidigare än väntat 19, avbildning de tidigaste stegen ankomst och överlevnad blir avgörande för förstå processen av metastaserad sådd och återfall av tumörtillväxt på avlägsna platser.

Utföra dessa observationer i lungorna har visat sig vara extremt svårt men; den stora majoriteten av imaging studier har utnyttjat ex vivo eller Explantation förberedelser 20-23, som bara ger en inblick i lungan vid enstaka tidpunkter. Även om dessa preparat gör ge användbar informationrmation, ger de inte en fullständig förståelse av samspelet, orsak och verkan, och dynamik som uppstår mellan de olika komponenterna i den mikromiljö. Avsaknaden av en riktig cirkulationssystemet (och samtidig obalans av homeostas) och frånkoppling från resten av kroppens immunsystem gör det önskvärt att validera de slutsatser som dessa preparat genererar i intakt vävnad in vivo.

Många grupper har utfört intravital avbildning av den intakta lungan 2,4,5,24-33 med Wearn och tyska är den första att kirurgiskt exponera pleura skiktet 24 och Terry först med att utnyttja en implanterbar avbildningsfönster 25.

Högupplösande avbildning i lungan är kraftigt hindras av lungans konstant rörelse och flera tekniker har utvecklats för att övervinna denna begränsning. Wagner och Filley 27 studerade naturlig rörelse hundlungaoch utformat sina kirurgiska protokoll för att lokalisera deras implanterade fönster över en relativt stillastående region medan Wagner utnyttjade vakuum i sitt fönster kirurgisk förberedelse för att immobilisera vävnaden 28. Sedan dess har en mängd olika tekniker använts för att bilden lungan inklusive: luftrör kläm, sekventiell apné och gated imaging, översamplade förvärv, limning av lungan lob och vakuum 34. Var och en av dessa har sina fördelar och nackdelar och ingen teknik har vuxit fram som överlägsen till en annan 34. Exempelvis bronk fastspänning och sekventiell apné förändra den normala gasutbyte i lungan och kan orsaka atelektas. Gated imaging och samplade förvärvet inte lider av dessa nackdelar, men kräver hög hastighet eller specialiserad bildutrustning inte allmänt tillgängliga. Slutligen både limning av lungan och vakuumteknik undvika båda av de ovan nämnda nackdelarna, men kan uppvisa skjuvkraft inducerad skada om vård är inte taksv. Under de senaste åren har vakuumfönstret har miniatyriserade och anpassade för användning i möss med användning av konfokal och multifotonmikroskop 4,5,33 och utmärkt hög upplösning avbildning har uppnåtts två. Tabell 1 sammanfattar denna rika historia och belyser de papper som beskriver nya framsteg i användningen av intravital lungavbildningsfönster.

Detta protokoll beskriver användningen av förlängda tidsförlopp multifoton intravital mikroskopi för att bilden metastaser i lever, intakt lunga med högsta subcellulära möjliga upplösning. Bilderna förvärvas för upp till 12 timmar med hjälp av en multifotonmikroskop utrustad med en hög numerisk öppning objektiv och flera fotomultiplikatorrör (PMT) detektorer. Transgena musmodeller används för att fluorescerande etikett infödda makrofager tillsammans med fluorescerande hög molekylvikt dextran och fluorescerande protein transfekterade tumörceller (för att märka kärlsystemet och tumörceller respectively). Även om detta val av fluorescerande celler möjliggör visualisering av tumörcell endotel cell makrofag växelverkan och dynamik, kommer detta protokoll fungerar för alla stam av fluorescerande eller icke-fluorescerande mus. Efter förvärvet återstående drift rörelse (om någon) elimineras med hjälp av en Fiji plugin 35,36 och anpassade makron medelvärdet kärlkanalen för att eliminera blinkande orsakas av omärkta cirkulerande blodkroppar.

Även om detta protokoll fokuserar på avbildning metastasering, teknikerna är tillämpliga på många andra biologiska processer observer med hög upplösning encelliga avbildning i lungan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler för användning av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande av Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Generera fluorescerande musmodell och tumörceller

  1. Bereda 100 ml av 0,1% (vikt / volym) bovint serumalbumin / fosfatbuffrad saltlösning (BSA / PBS) buffert genom att blanda 0,1 g BSA med 100 ml PBS.
  2. Förbered fluorescerande tumörceller genom stabil transfektion.
    OBS: Här använder vi E0771-LG-celler, en mycket metastatisk derivat av E0771 mus bröst adenokarcinomceller 37 som isolerats från metastaserande tumörer utvecklades i lungorna av C57BL / 6-mus intravenöst med föräldra E0771 celler 38.
    1. 24 timmar före transfektion, platta 1 x 10 5 EO771-LG-celler på en 60 mm vävnadsodlingsskål med 2 ml av antibiotic fri 10% FBS (fetalt bovint serum) DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
    2. Vid tiden för transfektion, inkubera 2 ^ g av det fluorescerande proteinet vektor med 10 | il av transfektionsreagens för 30 min före tillsats av 190 | il av minskade serummedier.
    3. Tvätta EO771-LG-celler med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) en gång och tillsätt transfektion blanda försiktigt.
    4. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 6 timmar.
    5. Tvätta de transfekterade cellerna och odling i 2 ml fullständigt DMEM (10% FBS, 1 mM pyruvat, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin) under 2 dagar.
    6. Tvätta cellerna med 2 ml steril PBS, tillsätt 500 | il av 0,25% trypsin-EDTA och inkubera i 2 min vid 37 ° C.
    7. Samla cellsuspension och blanda med minst en volym komplett DMEM och spinn ner vid 280 x g.
    8. Resuspendera cellerna i 1 ml fullständigt DMEM och expandera cellkulturen in ien 10 cm vävnadsodlingsskål.
    9. Starta selektion av transfekterade celler genom att tillsätta 700 | j, g / ml av G418 selektiva antibiotikumet till 8 ml fullständigt DMEM och kultur under en vecka, ändra mediet var tredje dag.
  3. Berika den fluorescerande populationen från transfekterade celler som har varit under selektion i G418 genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 39,40.
    1. Tvätta cellerna med 5 ml PBS och tillsätt 1,5 ml av 0,25% trypsin.
    2. Inkubera under 2 min vid 37 ° C och blanda med minst en volym komplett DMEM.
    3. Samla cellsuspension och spinna ned vid 280 x g och återsuspendera celler i en ml sterilt 0,1% (vikt / volym) BSA / PBS-buffert.
    4. Filtrera cellsuspensionen genom en 40 | am mesh och justera volymen till 1 ml med 0,1% BSA / PBS-buffert för att sortera.
    5. FACS-sortera 10% ljus befolkning baserad på fluorescensspektrum med hjälp av FACS sorterare 41.
    6. Kultur de sorterade cellerna för en vecka under selektion (700 | ig / ml G418 i fullständigt DMEM).
    7. Markera fluorescerande celler med flödescytometri av steg återigen upprepa 1.3.1 till 1.3.6.
    8. Efter en andra runda av selektion, trypsinize, filter och återsuspendera cellerna i 0,1% BSA / PBS såsom beskrivits (steg 1.3.1-1.3.4). Justera koncentrationen till 2 x 10 6 celler / ml för enskild cell sortering i plattor med 96 brunnar med hjälp av FACS-sorterare.
    9. Förbereda 3-5 96-brunnsplattor med 100 pl av fullständig DMEM för insamling. Att öka överlevnaden efter sortering, tillsätt 100 pl av filtrerat odlingsmedium från rätter där de EO771-LG-celler odlades 42.
    10. Efter sortering av cellerna in i de 96-brunnsplattor, retur celler till odling under 2 dagar (37 ° C, 5% CO2).
    11. Identifiera brunnar med livskraftiga enstaka kloner genom undersökning under ett inverterat mikroskop vid 5x förstoring.
    12. Trypsinize och expandera livskraftiga kloner och frysa celler för säkerhetskopiering.
      1. Tvätta brunnarna med grgrund kloner med 100 | il av steril PBS. Tillsätt 50 | il av 0,25% vikt / vol trypsin och inkubera 2 min vid 37 ° C. Tillsätt 50 pl av komplett DMEM och överföra till steril V-botten eller rundbottnad platta med 96 brunnar för att snurra ner vid 280 xg under 5 min.
      2. Resuspendera cellerna i 100 | il av 700 | ig / ml G418 komplett DMEM och platta varje klon i 12-brunnsplattor. Tillsätt 400 pl komplett DMEM med G418 och kultur tills sammanflytande.
      3. Tvätta brunnarna med 500 | il av PBS, tillsätt 100 | il av 0,25% trypsin och inkubera 2 min vid 37 ° C. Tillsätt 100 pl komplett DMEM och spinn ner i 5 minuter vid 280 x g. Resuspendera celler i 100 ul av komplett DMEM med G418 och platt celler i 6-brunnsplattor tills sammanflytande.
      4. När sammanflytande, trypsinize celler, spinn ner och återsuspendera i 10% DMSO i FBS att frysa celllager.
      5. Håll 1/10 av cellsuspensioner i odling genom att stryka ut dem i 100 mm vävnadsodlingsskålar för utvärdering av deras metastatisk potential.
  4. Testa metastatisk potential av utvalda kloner.
    1. Trypsinize och återsuspendera cellerna i saltlösning till en koncentration av 2,5 x 10 6 celler / ml och injicera 200 pl in i C57BL / 6-möss intravenöst genom svansvenen.
    2. Efter 2 veckor, samla lungvävnad som tidigare beskrivits 23 och kvantifiera tumörbörda efter antalet yta eller stereologisk metod 43. Välja ut kloner med hög metastatisk potential för intravital avbildning.
  5. Höj MacBlue (en myeloid specifik promotor som driver cyan fluorescerande protein (GFP) uttryck (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) reporter möss 44.
    OBS: Normalt möss mellan 8 och 12 veckor användas, men möss så tidigt som 7 och så sent som 20 veckor har testats för att fungera lika bra.

2. multifotonmikroskop Ställ upp och Imaging Beredning

OBS: Även om detta protokoll kan utföras på multiphoton mikroskop, det system som används för att förvärva de data som visas i detta protokoll har beskrivits tidigare i detalj 45.

  1. Slå på alla mikroskop och laserkomponenter inklusive två-photon laser och detektorerna åtminstone en timme framför önskad avbildningstiden.
  2. Strax före operation, mäta effekten av ljus ingången till mikroskopet genom att placera chefen för den optiska effektmätare i strålgången strax innan mikroskopet och justera laser slutet hålrum spegel rattarna tills maximal ljusintensitet vid 880 nm avläses på den optiska effektmätare.

3. Vakuum som inrättats

  1. Limma täck i fönstret imaging (Supplemental figur 1) med cyanoakrylat. Tillåt minst 4 timmar för limmet torka helt.
    OBS: Detta steg kan också göras i förväg.
  2. Skär 100 mikroliter pipettspets vid den första raden från den lilla öppningen och anslut den oklippta änden till den tunna vacuum slang.
  3. Ansluta vakuumsystemet enligt figur 1 och Supple Figur 2.
  4. Med vakuum och den öppna änden blockerad, justera vakuumregulator för <3 inHg.
    OBS: Slut justering av vakuumnivån kommer att utföras genom observation av vaskulaturen in vivo.
  5. Applicera en tunn film av olja fett på undersidan av bildplatta för att förhindra att objektivlinsen nedsänkning mediet från att ledas bort av avbildningsplattan.
  6. Placera bildplattan på mikroskop scenen.
    OBS: Den anpassade bildplatta (Supplemental figur 3) är en skiva av 1/8 "tjock aluminium bearbetas både för att passa i scenen insatsen utrymme och med ett genomgående hål i mitten för att hålla bildfönstret.
  7. Sätt vakuum fönstret till bildplatta med täck ner.
  8. Sterilisera alla ytor och instrument, inklusive avbildning skede platta och bildbehandling vinnadow med 70% etanol.
  9. Anslut den skurna änden av pipettspetsen till vakuumfönstret och tejpa slangen ned till bildplatta.
  10. Ta med målet nära bildfönstret och placera en stor droppe vatten mellan målet och täck.
  11. Se till att det inte finns några läckor från täck genom att blockera den centrala öppningen av vakuumfönstret och kontrollera att vattendroppen mellan målet och täck inte får aspire.
    OBS: En gammal stil datormus boll placeras över fönstret är användbar för att blockera den centrala öppningen.

4. kirurgi

  1. Förbereda det sterila operationsområdet.
    1. Placera alla instrument inom räckhåll. Sterilisera alla ytor och instrument, inklusive operationsområdet, och kirurgiska instrument med 70% etanol.
  2. Knyt en 3 tums längd av 2-0 sutur till katetern, ¼ tum ovanför bussningen med en dubbelknut.
  3. Förbereda svansvenen kateter foljande den publicerade protokollet från Harney et al. 46.
  4. Med användning av en infraröd (IR) värmelampa, värma djuret i sin bur för ~ 5 min för att öka blodflödet i svansvenen och för att underlätta kateter införing. Det rekommenderas att hålla djuret värmdes till fysiologiska temperaturer under hela det kirurgiska förfarandet med användning av antingen en värmelampa eller en värmande dyna.
  5. Söva djuret med 5% isofluran och kontrollera att det inte finns något svar på en tå nypa.
  6. Applicera oftalmisk salva för ögonen på djuret.
  7. Applicera hårborttagnings lotion för 10-30 sekunder för att ta bort hår från den vänstra sidan av djuret; från mittlinjen av bröstkorgen till ¼ av ryggen och från armhålan till strax under bröstkorgen.
  8. Rengör eventuellt överskott lotion och sterilisera exponerad hud med 70% alkohol.
  9. Bifoga en steril spruta fylld med PBS i svansvenen kateter och sätt och bandet på plats efter det publicerade protokollet från Harney et al. 46. Se till att tejpen är säkert fäst vid själva nålen och inte är fritt i spalten mellan svansen och bandet.
  10. Intuberas musen efter antingen publicerade protokollet från et al. Das 47 eller DuPage et al. 48
  11. Slå på fläkten och ställa in den för att leverera 135 andetag per minut och 200 pl isofluran-syreblandning.
  12. Anslut trakeala katetern till ventilatorn.
  13. Flytta musen till operationsområdet. Var mycket noga med att inte rubba katetern.
  14. Knyt 2-0 sutur runt nosen av musen under framtänder.
  15. Tejpa katetern till nosen.
  16. Tejpa vänster forelimb till katetern för att hålla den ur det kirurgiska området.
  17. Sänk isoflurananestesi till en underhållsnivå på 2,5% och kontrollera att det inte finns något svar på en tå nypa.
  18. Med hjälp av vass sax, ta bort en cm2 hud ovanför vänster bröstkorgen.
  19. lift than bröstfettkudde och bränna alla exponerade blodkärl med diatermi penna.
  20. Resect fettkudden genom att skära med vass sax.
  21. Ta muskellagret ned till bröstkorgen genom att skära med vass sax. Se till att inte skära armhålan ven körs vid foten av forelimb.
  22. Använd pincett för att ta tag i och lyfta 6: e revbenet. Med hjälp av vass sax som hölls på en flack vinkel (~ 5 °) skär revbenet nära kanten av öppningen i huden. Var mycket noga med att inte vidröra den oskyddade lungvävnad.
  23. Bredda öppnandet i bröstkorgen för att exponera hela lungan lob genom att ta bort fyra på varandra följande revben.
    Obs: Håll öppna minst 5 mm bort från bröstbenet för att undvika hjärtat.
  24. Lyft försiktigt musen genom att ta tag i svansen och luftrör kateter och flytta musen till mikroskopets avbildningssteget.
  25. Med vakuum bort, fylla kammaren av vakuumfönster med PBS.
  26. Vänd musen och placera den exponeradelunga över vakuumavbildningsfönstret.
  27. Sakta slå på vakuum till ca 3-5 inches kvicksilver med hjälp av kulventilen.
  28. Placera en återhållande sele tillverkad av mjukpapper viks på mitten två gånger över bröstet av musen och bandet till scenen plattan som visas i Kompletterande Figur 2.
  29. Clip låret sensor pulsoximeter till djurets övre lår och starta programmet.
  30. Placera klimatkammare på scenen och slå på värmen för att hålla musen vid en fysiologisk temperatur.
  31. Minska nivån av isofluran till 1-1,5% för att upprätthålla anestesi och upprätthålla blodflödet.

5. Intravital Imaging

  1. Ta med 25 x 0,95 numerisk bländare (NA) objektiv nära täck och lägga en stor droppe vatten mellan dem.
  2. Med hjälp av epifluorescence läge, se FITC-kanal och få lungvävnaden i fokus.
  3. Om inte gjort före det kirurgiska ingreppet, jagnject tumörceller genom svansvenen katetern.
    1. Koppla PBS sprutan från svansvenen kateter.
    2. Ladda en steril spruta med 100 pl av tumörcellsuspension (2 x 10 7 celler / ml i PBS maximum).
      OBS: Detta steg kan göras i förväg för att studera cancercell ankomst till lungan vid olika tidpunkter.
    3. Anslut sprutan med tumörceller på svansvenen kateter.
    4. Långsamt injicera tumörcellerna i svansvenen.
    5. Koppla bort sprutan med tumörcellerna från svansvenen kateter.
    6. Anslut PBS sprutan svansvenen kateter.
      OBS: Identifiera placeringen av alla tumörcellerna innan injicering av dextran eftersom det blir svårt att urskilja tumörcellerna från dextran signal via den okulära efter injektion.
  4. Lokalisera tumörceller till bilden
    1. För avbildning enskilda tumörceller, lokalisera alla tumörceller och spela in sina platser med the flerpunkts panel av programvaran.
      1. Lokalisera alla synfälten till bilden genom att observera tumörcellerna i mikroskopet okulär.
      2. I programmet, växla till multipanelen genom att klicka på Multi-Point-knappen och spara platsen i cellen genom att klicka på Lägg till plats knappen.
    2. För mosaik avbildning, lokalisera ursprunget av mosaik och ställa bildkoordinater
      1. Leta upp en position i det övre vänstra hörnet av strukturen som ska fångas.
      2. Noll x, y och z-koordinaterna för scenen genom att trycka på "Noll" -knappen på scenen controller.
      3. Ladda upp en lämplig förteckning över mosaik koordinater genom att klicka på "Load" -knappen och välja listan.
        OBS: Ett exempel lista för en 2 x 2 mosaik med en 20% överlappning av en 500 | j, m synfält skulle vara: pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), pos. 3 = (0400), pos. 4 = (400400).
  5. Avlägsna sprutan wed PBS i svansvenen katetern och ersätta med sprutan innehållande dextran.
  6. Injicera långsamt upp till 100 pl av 20 mg / ml 155 kDa rodamin-dextran löstes i PBS i musen via svansvenen katetern följt av injicering av 50 | il av steril PBS för att spola ledningen. Inte införa några bubblor i linjen. När det är nödvändigt, injicera dextran minst en timme efter cancercellinjektion, så att den totala volymen som administreras till musen inte överstiger 4 ml / kg / h.
  7. Inrätta avbildningsparametrar.
    1. Växla mikroskop för att multifoton läge.
    2. Ställa in zoom till en faktor 2X genom att klicka på knappen tidsbestämningssignaler och uppdatera zoomfaktor fältet.
    3. Justera lasereffekt till ~ 10% (~ 10-15 mW vid provet) genom att klicka på Detektorer och Laser knappen och sedan justera reglaget Tsunami Ström till 10.
  8. Bild varje plats för att verifiera närvaron av tumörceller och visualisera flödet och integritet Vasculature.
    OBS: Fartyg ska visas helt perfusion med flytande erytrocyter och fluorescerande dextran bör ingå i kärlen utan läckage till extravaskulära utrymmen. 20 tumörceller förväntas vara inom tydlig öppning av vakuumfönstret - 10 ungefär.
  9. Anpassa utgångs djupet för varje plats som skall avbildas.
    1. För varje plats, justera z-positionen genom att vrida fokuseringsvredet på scenen styrenheten för att avbilda det övre skiva av tumörcellen.
    2. Positionera cellen i centrum av synfältet.
    3. Klicka på Multi knappen, klicka på läget för synfältet för att markera det och klicka på Lägg följt av knappen Ta bort för att ersätta cellens lagrade position i multilistan.
    4. observera visuellt relativa ljusstyrkan hos tumörcellen i varje position.
  10. Spara de nya platserna för var och en av cellerna genom att klicka på knappen Spara i Multi panelen end ange ett filnamn.
  11. För avbildning av enskilda tumörceller, plocka tre celler av ungefär lika ljusstyrka och ta bort alla andra platser från multi listan genom att klicka på deras plats i listan och sedan klicka på knappen Ta bort.
  12. Klicka på Detektorer och Laser knappen och justera reglagen för PMT vinst på de gröna och röda kanalerna 45 så att signalerna är under mättnad.
  13. Justera reglaget för den blå kanalen 45 så att makrofager verkar cyan.
    OBS: Alla andra harmoniska signalen visas endast i den blå kanalen och kan separeras från cyan makrofager genom att följa kanal subtraktion ovan beskrivna förfarandet 45.
  14. Ställ in z-stack start djup 0 um och slutdjupet till 24 um genom att flytta Z-steget till platsen och klicka på Start och End knapparna respektive.
    OBS: Celler inom detta djup kommer att visualiseras med den bästa signalen tillbuller och upplösning.
  15. Ställa in z stegstorleken till 3 ^ m.
  16. Ställ bildparametrar följande parametrar som tidigare beskrivits 45,49.
    1. För avbildning av enskilda tumörceller, klicka på knappen tidsbestämningssignaler och ange 4 V i zoomfaktor fält (motsvarande en zoomfaktor på 1,5X) anger tre i medel ram fältet och klicka på Time-Lapse knappen och ange 10 i Time-lapse fält.
      OBS: Dessa inställningar kommer att förvärva en ram varje 3 sek.
    2. För mosaik bildbehandling, klicka på knappen tidsbestämningssignaler och ange en zoomfaktor på 1,5 V (motsvarande en zoomfaktor på 4X) anger tre i antal i genomsnitt ram och klicka på time-lapse-knappen och skriv in 10 i tids lapse tidsfördröjningsområdet.
      OBS: Dessa inställningar kommer att förvärva en ram varje 3 sek.
  17. Aktivera multi, z-stack och t-lapse avbildning lägen genom att klicka på sina knappar.
  18. Tryck på inspelningsknappen för att få bilder.
    INTEE: Lungvävnad är mycket känslig och mottaglig för fotoskador. Om efter tidsförlopp avbildning blodflödet stannar den avbildade området är troligen lasern för hög och efterföljande avbildning av andra områden måste göras på lägre effekt.
  19. Varje 30-45 min, långsamt injicera 50 | il PBS eller saltlösning för att upprätthålla hydratiseringen av djuret.

6. Eutanasi

  1. Öka isofluran till 5%.
  2. Hålla djuret under 5% isofluran tills 30 sek efter det upphör att andas och ta bort djuret från scenen.
  3. Utföra halsdislokation att säkerställa fullständig eutanasi.

7. Bildanalys

  1. För encelliga avbildningsexperiment:
    1. Ladda bilder till Fiji och formatera dem som en Hypers.
    2. För varje z-skiva i Hypers, spela time lapse film och leta efter kvarvarande xy rörelse. Om rest xy rörelse hittas tillämpa plugin som heter StackReg 36 till stacken för atteliminera rörelsen.
  2. För mosaikavbildningsexperiment:
  3. Ladda bilder till Fiji och sy ihop dem genom att öppna den mosaiska Stitching makrot (Supplemental kodfil Mosaic Stitching) och ange information om bilderna som katalogen, filen bas namn, antal x- och y-fält i mosaik och antalet skivor och tidpunkter.
    OBS: På grund av hur Java tolkar kataloger måste mappnamn har två snedstreck som undermappar separatorer. På grund av begränsningar i den inbyggda plugin Parvis Broschyr, måste basen filnamn inte innehålla några streck.
  4. För att få en klar bild av gränserna för kärl genomsnitt ihop alla tidpunkter för blodkanalen i en enda bild och sedan replikera denna bild som bakgrund för varje bildruta i filmen av de andra kanalerna.
    OBS: Detta görs genom att helt enkelt köra Utför Blood medelvärde makro (Supplemental kodfil Utför Blood medelvärde).

    5. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att demonstrera den typ av resultat som kan uppnås med denna metod, injicerade vi E0771-LG tumörceller märkta med det fluorescerande proteinet Clover i svansvenen av MacBlue möss 44 vid varierande tidpunkter före operation. Efter operationen var 155 kD rodaminmärkt dextran injiceras IV för att markera kärl och time-lapse avbildning utfördes.

När avbildning möss 24 timmar efter injektion, enskilda celler är synliga inne i kärlsystemet, interagera med makrofager och monocyter. Ett exempel på detta visas i Figur 2A (Supplemental Movie 1). Här en enda optisk del av en ensam tumörcell (grön) 12 um djupa inkom i lungan kärlsystemet avbildas över 5 timmar och 20 minuter som det övergående interagerar med en bosatt makrofager (cyan). Vaskulatur är märkt med hög molekylvikt dextran. Stabiliteten iavbildning är sådan att sekventiell z-stack avbildning av området kan förvärvas och en tre dimensionell rekonstruktion kan göras (Figur 2B, Supplemental Movie 2).

Användning av mikroskop inställningar som beskrivs i protokollet för mosaik avbildning tillåter avbildning av strukturer större än en enda synfält. Till exempel, figur 3 visar förvärv av en enda metastatisk lesion, 12 dagar efter injektionen. Detta 5 x 5 mosaik visar ett fält 890 | im av vy över 205 minuter vid 15 (Figur 3A, vänster panel, Supplemental Movie 3) och 25 | j, m (Figur 3A, höger panel) under ytan av lungan. Trots det stora synfältet, möjliggör hög upplösning av de underliggande ramar som bildar mosaik fångst av subcellulära händelser såsom mitos av en enda cell, vilket framgår av kromosomseparation (Figur 3B, SupplementalMovie 4).

Intravaskulär injektion av en högmolekylär fluorescensmärkt dextran resulterar i märkning av de vaskulära lumen dock omärkt cirkulerande erytrocyter och leukocyter ockludera dextranet. I de små kapillärerna i lungorna, är ocklusion komplett resulterar i en blinkande dextran signal och en förlust av definition av kärlgränser (Figur 4, vänster, Kompletterande Movie 5). Den höga rumsliga stabilitet som tillhandahålls av detta protokoll ger tid medelvärdes av blodkanalen, utan oskärpa, alltså återställa tillfälliga inneslutningar. De andra signalkanaler kan sedan överlagras på kärl att ge en klar bild av kärlgränser (Figur 4, höger, Supplemental Movie 6).

Figur 1
Figur 1:. Layout av vakuumsystemet House vakuum utnyttjas och inställd på definierad nivå med en vakuumregulator. En infångnings kolv förhindrar förorening av regulatorn och vakuumsystemet genom kroppsvätskor. Ett tunt flexibelt rör förmedlar vakuum till en pipettspets skuren för att passa in i vakuumporten av avbildningsfönstret. Avbildningsfönstret är lämplig i en försänkt spår i bildplatta behålla sin lägesstabilitet i förhållande till mikroskop objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: En cell imaging i lungan (A) fortfarande från en time lapse film av en enda tumörcell i den kapillära bädd av lungan 24 timmar efter svansvenen.injektion. (Röd = Blodkärl, Grön = tumörceller, Cyan = makrofager) (B) Stabil imaging tillåter tre dimension rekonstruktion av bilddata över tid. Blodkärl har tid i genomsnitt för tydlighetens skull. (Röd = Blodkärl, Grön = tumörceller, blå = makrofager). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Stabiliteten i Lung tillåter hög upplösning, Stor-synfält Imaging i lungan genom sekventiell Förvärv och sy ihop av flera låg förstoring Fields (A) 5 x 5 mosaik visar en fält 890 um med tanke på. en metastatisk lesion i lungan 12 dagar efter injektion i svansvenen av tumörceller togs vid 15 pm under lungytan(Vänstra panelen). Högra panelen visar samma metastatisk skada på 25 um under lungytan. (B) De enskilda högupplösta fält avslöjar subcellulära processer såsom kromosom inriktning (gula pilar) och separation (röda pilar) under celldelningen. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: intravaskulär injektion av fluorescensmärkt med hög molekylvikt Dextran Marks lumen i vaskulaturen Utom när Omärkt Erytrocyter och andra cirkulerande celler täppa till fluorescenssignal (A) Ocklusion resulterar i en ofullständig märkning som rör sig i tiden resulterar i en blinkande effekt fördunklande. kärl gränser. (B) Den högarumslig stabilitet vakuum fönstret kan blodkanalen att vara dags genomsnitt, fylla i de tillfälliga ocklusioner och klart definiera fartygs gränser. De andra kanalerna sedan överlagras utan genomsnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

År Första Författare / Last Författare Djur Kirurgi Typ av Imaging Anmärkningar
1926 Wearn & tyska katter Bröstkorgen skära ned till pleural skikt. Andra öppning sker genom membranet ner till lungsäcken för belysning. Ljusfältsmikroskop. Först "fönster" genom pleural vägg.
1939 frotté katter Revben är separerade, en i. Fönster implanterad, luft avlägsnas från bröstkorgen med vakuum. Kikare och hud mikroskop med hjälp polariserat ljus. Implanteras först optiska fönstret. Begagnade vakuum för att dra vävnad till fönstret.
1963 de Alva & Rainer Kaniner & Dogs En eller två revben opererande och en i. Fönster in och sys till bröstkorgen. Hud stängdes över fönster och djur får läka. Innan avbildning, var huden dissekerades för att exponera fönstret. Begagnade hög hastighet stroboskopisk filmkonst genom en låg mag (11X) mål. Första överlevnadsfönster.
1965 Wagner & Filley Hundar Höger framben bort ett revben klippa och fönster in och sys. Reflektion mikroskopi med 22X objektiv. Först relativt rörelse fri fönster utan vakuum.
Wagner Hundar En Rib är opererande, 3. Fönster implanterad. Gängade fläns skruvar på fönstret för att bilda tätning mot bröstväggen. Bright mikroskopi med hög förstoring 100X olja immersionsobjektiv. Första fönster att använda vakuum för att stabilisera vävnadsrörelse.
1992 Groh & Goetz kaniner En ribba opererande, 1,2 i. Fönster implanterad. Gängade fläns skruvar på fönstret för att bilda tätning mot bröstväggen. Vakuum som appliceras. Epifluorescent mikroskopi med 25X objektiv. Första användningen av ett vakuum fönster med epifluorescence.
1994 Fingar & Wiemans råttor 2 revben är opererande, en i. Fönster implanteras och sys fast bröstkorgen och hud. Epifluorescent mikroskopi med 40X objektiv. Första överlevnads fönster i råttor.
2000 Funakoshi & Mitsui Möss Hela bröstkorgen avlägsnades. Vakuumsug ring fäst till höger lunga. Konfokalmikroskopi med en 20X objektiv. Första användningen av vakuum fönster i möss.
2005 Lamm & Glenny råttor Hela bröstkorgen bort en i. Fönster fäst vid lungan. Reflektion och epifluorescent mikroskopi med 20x objektiv. Första användningen av vakuumfönstret hos råttor.
2008 Tabuchi & Keubler Möss 3 ribbor opererande ansökte plastfilm att öppna för att täta hål i bröstkorgen. Air avlägsnas via intrapleural kateter. Epifluorescent mikroskopi med 20x objektiv. Första att använda plastfilm för att täta öppningen i bröstväggen.

Tabell 1: Historisk Undersökning av Devellingen av Intravital Lung Imaging Windows. Många nya intravital lungavbildningsfönster har utvecklats under åren med den senaste som miniatyriserade för användning i möss med användning av vakuum för vävnadsstabilisering och uppnå tillräckligt hög upplösning för att kunna avslöja subcellulära detalj.

Kompletterande Figur 1: konstruktionsritning av vakuum Imaging Fönster klicka god här för att ladda ner denna siffra.

Kompletterande Figur 2: Fotografier av Vacuum Setup Klicka här för att ladda ned den här figuren.

Kompletterande Figur 3: Design Drawing Stage Plate Infoga Klicka här för att ladda ned den här figuren.

Kompletterande Figur 1
Kompletterande Movie 1:. Movie av stillbilder i figur 2A (Högerklicka för att ladda ner).

Supplementär Figur 2
Kompletterande Flytta 2. Film av 3D-rekonstruktion som visas i figur 2B visar olika betraktningsvinklar och progression över tid (Högerklicka för att ladda ner).


Kompletterande Movie 3. Film av 5x5 mosaik som visas i figur 3A på 15 um under lungytan (Högerklicka för att ladda ner).

Supplementär Figur 4
Kompletterande Movie 4. Film av en enda cell som visas i figur 3B genomgår mitos i lungan (Högerklicka för att ladda ner).

Supplementär Figur 5
Kompletterande Movie 5: Film i figur 4, vänstra panelen visar ocklusion och fsurrning. (Högerklicka för att ladda ner).

Supplementär Figur 6
Kompletterande Movie 6:. Movie i figur 4, högra panelen visar återhämtning av vaskulär definition efter blod genomsnitt (Högerklicka för att ladda ner).

Kompletterande kodfil. Mosaic sy Klicka här för att ladda ner filen.

Kompletterande kodfil. Utför Blood medelvärde Klicka här för att ladda ner filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hög upplösning in vivo optisk avbildning i kombination med fluorescerande funktionella taggar såsom proteiner och antikroppar har dramatiskt ökat vår förståelse av metastaserande kaskad. Det har möjliggjort direkt visualisering och kvantifiering av encelliga och sub-cellulära parametrar i tumörceller, värdceller och deras mikromiljö. Denna avbildning inom den primära tumören har lett till exempel, till upptäckten av diskreta mikromiljöer som stöder antingen tillväxt invasion eller spridning 6,7. När det gäller invasionen, har in vivo imaging visade förmåns roll co-migrational uppspelning av makrofager och tumörceller i intravasering 7,50.

I sekundära platser som lungan, förstå dynamiken i tumörcells beteende vid de tidigaste stadierna av metastaser, inklusive pre-mikrometastas sådd skede när enskilda och små grupper av tumörceller anländer ochinteragerar med blodkärlet endotel, kommer endast att åstadkommas med användning av högupplösande optisk avbildning. Standardmässiga kliniska avbildningsmetoder har inte den upplösning som behövs för att visualisera antingen den fina strukturen av kapillären säng eller morfologin och interaktion av celler vid enkelcellupplösning. De avbildningstekniker som presenteras i detta protokoll utföra denna utmanande uppgift.

Intravital avbildning fönster såsom de som anges i tabell 1 erbjudande en betydande fördel gentemot ex vivo lungpreparat genom att upprätthålla korrekt lungfysiologi inklusive perfusion, anslutning till immunsystemet och erbjuda mer än bara en statisk bild av cellulära dynamik. Vakuumet stabiliserade fönster i synnerhet erbjuda en nivå av vävnad stabilitet som tillåter förvärv av mycket registrerade bilder, möjliggör tredimensionella rekonstruktioner (Figur 2B) och kapacitet för stort synfält mosaik imaging (Figure 3A). Tillsammans ger dessa en rad synpunkter i lungan, från en histologisk typ låg förstoring vy som ger vävnads morfologi, en sub cellulär vy som även kan avslöja kromosomseparation och diskriminera vilande och delande tumörceller (Figur 3B). Flera förvärvs kanaler kan flera celltyper och deras interaktioner kan visualiseras samtidigt (Figur 2A).

kan förväntas medan protokollet tar viss teknisk kompetens, metoder och uppmärksamhet på vissa kritiska steg och punkter kommer att förbättra andelen framgångsrika förfarandet och avbildningstider på upp till 12 timmar. Det är viktigt att se till att lungvävnaden är väl centrerad över fönstret (steg 4,25). Detta säkerställer att vakuum appliceras jämnt och fullständigt över hela lungvävnaden (steg 4,27). Underlåtenhet att centrera vävnaden kommer att resultera i rörelse av vävnaden. Den återhållande sele (Supplemental figur 2) används to minska rörelsen induceras av sammandragning av interkostal muskler under naturliga andetag djuret tar. Det bör tätt över musen, men inte komprimera bröstet. För mycket kompression sätter press på alla loberna i lungorna såväl som hjärtat och resulterar i en minskad livsduglighet hos musen. Om dextran inte observeras flyter i lungan kärlsystemet efter injektion (steg 5,8), är lungvävnaden antingen skadas av felaktig hantering under operation eller vakuumnivån är för hög. Sänkning av vakuum av 0,5-1 tum Hg kan prövas för att se om flödet är återställd. Om flödet inte är återställd, eller om det finns flöde, men dextran observeras extravaskulärt, lungvävnaden har skadats i denna region och det kommer att bli nödvändigt att bilden en annan synfält. Underhåll av korrekt blodflödet i avbildningsregionen är viktigt att säkerställa att en korrekt fysiologi mäts. Eftersom syre tillföres till vävnaden från insidan av alveolerna och inte genom de vasculature är osannolikt ischemisk hypoxi. Ändå kan unperfused vaskulaturen potentiellt leda till förändrad syre / CO 2 nivåer och kommer också att förhindra cirkulerande leukocyter från att nå vävnaden av intresse. Visualisering av strömmande erytrocyter kan användas som en indikator på en korrekt lungfunktion. Lungvävnad är mycket känslig och också mottagliga för fotoskador. Om efter tidsförlopp avbildning blodflödet stannar den avbildade området är troligen lasern för hög och efterföljande avbildning av andra områden måste göras på lägre effekt. Vi har funnit ~ 10-15 mW vid provet för att producera tillräckligt ljusa bilder utan fotoskador vid användning av antingen GFP eller Clover (som har fyra gånger medel ljusstyrka) transfekterade celler. Minimiljusstyrkenivåer för fluorescerande proteiner är starkt beroende av mikroskop parametrar och uttrycksnivåer i cellerna och måste testas empiriskt.

I detta protokoll, är tumörceller märkta med en ljus cytoplasmic fluorescerande protein som ger en tydlig bild av cellkroppen och intracellulära utrymmen som utesluter proteinet (dvs kärna). Makrofager är märkta genom användning av en transgen musmodell syngena till tumörcellerna. Märkning båda celltyperna möjliggör visualisering av deras direkta interaktion i realtid. Den förlängda varaktigheten av bildbehandling möjliggör kvantifiering av frekvensen, varaktighet och omfattning med vilken cancerceller samverkar med makrofager i en fysiologiskt relevant sammanhang.

När utförs korrekt, kan detta förfarande rörelse fri, flerkanaligt, med hög upplösning, encelliga avbildning i den intakta lungan under perioder på upp till 12 timmar. Användningen av en hög numerisk öppning objektiv såsom 25X 0.95NA och multifoton kapacitet för elektronisk zoom gör den högsta upplösningen optisk avbildning i lungan sett hittills.

Intravaskulärt injicerade fluorescerande hög molekylvikt dextran performs den dubbla rollen av märkning av vaskulära utrymmet och verifiera dess integritet. 155 kDa dextran användes för att förhindra diffusion genom interendothelial utrymmen. Några tecken på bristande vaskulära flödet eller av vaskulär läckage extravasalt indikerar vävnadsskada på grund av felaktig hantering eller överdriven vakuum.

Slutligen kan unika bildbehandlingstekniker användas som tar nytta av den höga rumsliga stabilitet av detta protokoll. Eftersom de omärkta erytrocyter och andra leukocyter utesluter fluorescerande dextran när de passerar genom kapillärerna, kan denna signal genomsnitt över tiden för att ta bort den blinkande att de skapar. Detta erbjuder en väl definierad vy av vaskulaturen inte möjligt på annat sätt.

Begränsningar av denna teknik inkluderar både invasiva karaktär operationen, vilket potentiellt komplicerar dess användning för studier av sjukdomar som försvagar djuret (t.ex. sen metastaserande cancer,akut sicklecellanemi), och det faktum att operationen är terminalen som begränsar den att använda till en enda, om än långa (upp till 12 h), avbildning session. Vidare, med tanke på den långa varaktigheten av bildsession och den låga leverglykogenreserven hos möss 51, glukostillskott kan ges för att undvika potentiella källor till bias i experiment.

Detta protokoll skulle potentiellt kunna modifieras med injicerbara fluorescensmärkta antikroppar, antingen i stället för eller i tillägg till dextranet i syfte att märka andra strukturer eller celltyper i realtid. Detta kommer att utöka funktionerna för att analysera och dissekera tumören mikro genom att direkt visualisera tumörcellvärdcellinteraktioner och dynamik i realtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Tags

Cancer Research Intravital avbildning vakuum fönster multifotonmikroskop lunga Time-lapse cancerbiologi
Långsiktig Högupplösta Intravital Mikroskopi i lungan med en vakuum Stabiliserad Imaging Fönster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T.,… More

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter