Abstract
この原稿は、自動ロボット分配システムを使用して、ヒドロゲルbioinkこれらの機能への細胞の直接送達に続いて、細胞ガイダンス機能の導入について説明します。それは、細胞が向かって沈降や機能を感知することを可能にするように、特定のbioinkを選択しました。分配システムは、背圧アシスト記録ヘッドを用いたヒドロゲルbioinks中の生存細胞をbioprints。しかし、尖ったスタイラスまたはメスでプリントヘッドを交換することによって、分配システムは、表面エッチングによって地形キューを作成するために使用することができます。スタイラスの動きは、X、Y及びZ方向に10ミクロンのステップでプログラムすることができます。パターン化された溝は、溝 '方向に整合した細長い形態を採用するように影響を与える、間葉系幹細胞を配向することができました。パターニングは、直線、同心円、及び正弦波にプロットソフトウェアを用いて設計することができます。以降の手順では、線維芽細胞および間葉系幹細胞は、背圧駆動押し出しプリントヘッドにbioprintingために、2％ゼラチンbioinkに懸濁しました。細胞軸受bioinkは、その後エッチングに使用したのと同じプログラムの座標を用いて印刷しました。 bioprinted細胞が感知し、エッチングされた溝の方向に沿った細長い配向によって実証されるようにエッチングされた機能に対応することができました。
Introduction
セル配置の意図的なパターニングは、 インビボ細胞、組織1 で模倣文化の形成を可能にします。実際、複数の細胞型の間の相互作用の研究は、それらの空間配置2,3を編成することによって支援することができます。ほとんどのパターン形成システムは、後続の受動細胞沈着を伴う細胞接着を促進または防止するための表面修飾方法に依存しています。 Bioprintingは、細胞分布1以上の空間的および時間的な制御を提供しています。これらの機能に加えて、bioprintingは、幾何学的に複雑な足場4を生成するための技術的に、簡単迅速かつ費用効果的な方法であると記載されています。これは、コンピュータ設計ソフトウェアを利用し、製造プロセス4への細胞の導入を可能にします。
Bioprintingシステムは、レーザーベースのインクジェットベースまたは押出しベース4としての動作原理に基づいて分類されています。それは現実的な時間枠内4-6臨床的に関連するサイズの組織化構築物の製造を可能にするように、押出bioprintingは最も有望なものとして説明されています。これは、細胞担持ヒドロゲルbioinkの機械的または背圧補助押出のいずれかによって行われます。ここに提示された方法では、背圧を使用しました。前述したように、細胞は、細胞適合性bioinkで配信されます。このようなbioinkは、有害なせん断応力を生じることなく細胞の送達をサポートし、崩壊または7-10（「インクブリード」と呼ばれる）拡散することなく、印刷されたトレースの完全性を保持するのに十分な粘度であるべきです。
それらの接着面との細胞の相互作用は、細胞の挙動に影響を与えることが知られています。表面トポグラフィは、細胞の形状、方向11、さらに表現型を制御することができます。具体的には、溝およびチャネルの製造を誘導することが実証されています複数の細胞型に伸ばし、細長い形態。この形態を採用する多能及び多能性細胞の表現型に影響を与えることが見出されています。例えば、溝に整列させた場合、間葉系幹細胞（MSC）の合成10,14-17上に収縮性表現型を採用心筋12,13および血管平滑筋細胞への分化の証拠を示します。
チャネル又は溝を整列させる細胞は、例えば、ディープ反応性イオンエッチング、電子ビームリソグラフィ、直接レーザー印刷、フェムト秒レーザー、フォトリソグラフィおよびプラズマドライエッチング18、多数の方法を介してポリマー表面上に生成することができます。これらのアプローチは、多くの場合、時間がかかり、複雑な装置を必要とし、生成されたパターンの形状に限定することができます。また、彼らはbioprintingパターニングを同期しないと即時細胞化することができません。自動化の協調制御された動き分配システムは、ソリューションの堆積のための複雑なパターンに従うことができます。ここでは、マイクロ制御運動が細胞配向のためのチャネルを作成するために利用することができる方法を示しています。尖ったスタイラスまたはメス押出注射器の代わりに、プリントヘッドに取り付けられ、装置は、その後、描画ソフトウェアの指導の下でポリマー表面をエッチングすることができます。この方法は、パターン設計で汎用性を提供し、一般に、ポリスチレン、PTFE、ポリカプロラクトンなどの生物工学に使用されるポリマー材料にも適用可能です。エッチングに続いてのステップとして、細胞が傷の溝に直接bioprintedすることができます。ここで利用されるゼラチンbioinkは、トレースを維持し、堆積した細胞は、エッチングされた特徴を検出することを可能にするのに両方のことができました。エッチングされた溝にbioprinted間葉系幹細胞は、異なる行にそれらに沿って伸長することが実証されました。
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Protocol
注：このプロトコルは、表面エッチング（ 図1B）および押出によるbioprinter（ 図1C）10などの背圧アシストロボット分配システム（ 図1A）の使用を記載しています。
ポリスチレン表面の1.修正
- ポリスチレン組織培養プレートはエッチングや印刷の両方の高さの一貫性を台無しに、中央に上向きにお辞儀をする傾向があるので、1ミリメートルのポリスチレンシートを使用してください。
注：ポリスチレンシートは、細胞接着のために変更されないように、プラズマ処理が行われます。 - 酸素プラズマ処理。
- まず、プラズママシンに接続された酸素ボンベのレギュレータに2バールの圧力を選択します。その後、マシンのコントロールパネルに以下の条件にし、入力プラズママシンを切り替える：150 W、酸素の30 SSCM、10分（電力、ガスの流れと時間のために、それぞれが）。
- ポリスチレンsubstratを配置プラズマチャンバ内に電子、ドアをシールし、コントロールパネル上のスタートボタンを押してください。ウシ胎児血清中の酸素プラズマ処理したポリスチレン基板を浸漬し、三回、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する前に、2時間37℃でインキュベートします。
2.プログラミングプリントパターン
- スタイラスまたはメスで第1のエッチングにサーフェスをプログラムを使用してください。
- スタイラスを使用している場合、それはくさび止めして固定されるまで、（5または10ミリリットル）、分注シリンジのノズルに（細心の注意と内側から）1.5ミリメートルの直径の繊維の針を挿入します。メスを使用している場合、それは印刷アームのクランプ機構に固定することができるように、メスを取り扱うラウンドを選択します。
注：スタイラスは、より良い手術用メスの刃よりも湾曲したパターンをエッチングします。 - 最初bioprinted配置を作成しようとすると、XY座標を生成するために、番号軸とグラフ用紙上に所望のパターンをスケッチ。その後私は表計算ソフト（ 図2）にエッチング/ bioprintedパターンの座標NPUT。
注： "所望のパターン」とは、直鎖状、S字状、または円形のような多くの形状であってもよいです。選択は、ここに示されたように心筋細胞へのMSCの分化のための平行線状の線として、必要な実験モデルに依存します。散布グラフ機能は、提案されたプロットパターンの可視化を可能にします。 - 印刷/ディスペンシング・ソフトウェアを開きます。 「プログラムを>プログラムの追加」を選択し、続いて「編集>ポイントの追加」プログラムを設定します。 Xをエクスポートし、yは関数を使用してソフトウェア/分配プリントにスプレッドシートから得られた座標値を「コピー＆ペースト」。
- 表面にスタイラス/プリントノズルを配置するために、各ランの前にロボットの「Z」の高さを調整します。
- 印刷/分配するソフトウェアでは、「ロボット」オプションを選択して変更モード＆ "をクリックしてください＃34;そして「ティーチングモード」オプションを有効にします。選択すると、ソフトウェアは、ロボットの「ジョグ」機能を有効にします。
- ジョグするには、最初のメニューバーから次のコマンドを選択することで、デフォルトの位置にロボットを初期化します。 「ロボット> Mecaの初期化」は、その後、「ロボット>ジョグ」を選択します。入力パターンの起源に正確にスタイラスを配置するために必要な「XとYスロット」で（単位mm）の数値。
- 次に、「Zスロット」で入力（単位mm）の数値は、表面に接触し、スタイラスや印刷ノズルを配置したが、フレックスないか、表面をインデントします。この点は、「Z」の開始値として指定されます。
注：各溝の深さは、システムのZ高さを使用して容易に変更することができます。 40、80、および170ミクロンの溝は1mm厚のポリスチレンシート（ 図4および表1）の表面にカットすることが実証されています。
- Pを選択終了するためにロボットに知らせるために中間点と「ラインディスペンスの終了」を指定するために、「ラインの受渡し」を最初のポイントと印刷の開始を定義するための座標点、 すなわち 、「ラインディスペンスのスタート」のそれぞれについて、RINT命令プリントラン。
- 上部のメニューバーから次のコマンドを選択することで、ロボットにプログラムを通信：「ロボット> C＆Tのデータを送信します」。
- 「ファイル名を指定して実行」モードにロボットを変更することにより、エッチング/プリントランを開始します。上部のメニューバーから ">実行モードを切り替えるモードの変更>ロボット」を選択することによってこれを行います。
- ロボットディスペンサーコンソール上に緑色の「スタートボタン」を押すことにより、印刷手順を開始します。
- スタイラスを使用している場合、それはくさび止めして固定されるまで、（5または10ミリリットル）、分注シリンジのノズルに（細心の注意と内側から）1.5ミリメートルの直径の繊維の針を挿入します。メスを使用している場合、それは印刷アームのクランプ機構に固定することができるように、メスを取り扱うラウンドを選択します。
3.細胞含有ゼラチンBioinkの調製と印刷
- 最小必須培地アルファ培地（αMEM）中の2％ゼラチンを溶解させ（10％FBSおよび2％の抗生物質/ antimycotを補充2時間60℃でIC）はbioink溶液を調製しました。
- 前培養赤色蛍光タンパク質は、αMEM/ 10％FBSを用いて、10cmの組織培養皿中で70％コンフルエンスまで間葉系幹細胞（RFP-MSCの）を発現します。 37℃で5分間、1×トリプシン-EDTA溶液を用いた培地およびコーティングを除去することにより、サスペンションに付着した細胞を解放します。
- 5分間の千×gの遠心分離により細胞をペレット化し、上清を除去します。 1×PBS 0.5 ml中に細胞ペレットを再懸濁し、血球計を用いて細胞密度を計数します。
- bioinkを室温に冷却した後、穏やかに5×10 6細胞ml -1の最終濃度を達成するためにbioinkにRFP-MSCの懸濁液に十分な量で混合します。
- 密封されたノズルを有する印刷シリンジに細胞ベアリングbioinkを注ぎます。印刷可能な粘度を達成するために、4°Cにロードされた注射器を冷やします。
- 自動でロードされた注射器を置きますロボット分配システムは、空気圧ラインを取り付けます。シリンジルアーシールを外し、プリントノズルを取り付けます。
- 予めプログラムされた堆積以下、ポリスチレンフィルム表面に27 G針/ノズル（円筒上推奨テーパ）を介して、10mLの注射器から5mm /秒の書き込み速度で、0.05メガパスカルに背圧を用いて細線に細胞化bioinksを押し出しますステップ2.1で説明したパターンは、事前にエッチングされた溝の上に細胞化bioinkを配置します。
- 室温で1時間インキュベートした後、倒立蛍光顕微鏡を用いて観察する前に24時間（細胞が感知し、エッチングされた特徴に対応することを可能にする）ために細胞を（10％FBSおよび抗生物質を補充した）を10 mlの増殖培地を添加し、インキュベート10X倍率で。
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Representative Results
代表的な結果は、背圧支援ロボット分配システムは、表面エッチング及びbioink印刷（ 図1 A）の両方を実行するための押出によるbioprinterとして使用することができることを示しています。これは、ポリマー表面にエッチングされた溝の生成のために使用することができ、その後、機能（ 図1 B及びC）に直接bioinkを有する細胞を印刷します。
エッチングと印刷の両方がアプリケーション（ 図3 AC）に必要な線形、湾曲した放射状のパターンの印刷を可能にするソフトウェアを分配/印刷にプログラム座標（ 図2）入力によって決定されます。 Z軸の設定は、エッチングされた溝の深さ（ 図4および表1）の制御を可能にします。
交換後ヒドロゲルプリントヘッドとスタイラス、エッチングをコーディネートプログラミングは、同じデザイン（ 図3 DおよびE）以下のエッチングされた溝に直接細胞ベアリングbioinkを提供するためにロボットディスペンシング・システムを可能にするために再利用することができました。 図5のA及びBに見られるように、幹細胞はbioink内表面に最終的に堆積物をbioprintingにより播種し、感知し、離散ライン内のエッチングの方向に沿って細長いです。特徴の方向に整列bioprintingない培養培地に播種した細胞は、しかしながら、それらはbioink、印刷トレースに細胞を拘束することを証明し、全面に（ 図5のC）をカバーしました。エッチングされた特徴がなければ、培養培地に播種した細胞には向きや位置合わせ（ 図5 D）を示しません。
Figu。1再： 自動ロボット分配システム （A）装置は、ポリスチレンスライド（B）上に同心円をエッチングするプリントヘッドの中心（シリンジ内に固定）先鋭化スタイラスを含めてカスタマイズされました。プリントヘッドは、次に、押出、および以前にエッチングされたパターン（C）上の堆積を支援背圧で、細胞軸受ゼラチンbioinkを押し出すために変換することができます。この図は、Bhuthalingam らから変更されています。 2015年10。
図2： 表計算ソフトでのxy座標をプロットここに示されている画面のグラブは、グラフのプロットで示されるようにプロットされたx-y座標は、正弦波パターンを作成したことを示しています。これらの座標は、コピー/ペーストを用いて作図ソフトウェアに入力されました関数。
図3：エッチングされたパターンの汎用性プロットソフトウェアにプログラムされた座標は、線形の（A）、（B）正弦波と同心円（C）をエッチングすることができました。ポリスチレンにエッチングされた溝は、直接、次の工程（D）及び（E）中にヒドロゲルbioinkで上に印刷することができます。この図は、Bhuthalingam ら。2015年10から変更されています。
図4： エッチング溝の深さエッチング溝の深さは、分配システムのz軸制御により調節することができます。 （C）への画像（A）は平面図を示し、（E）は（D）は断面図を示しています。ロボット40の深さ（（A）及び（D））、90（（B）及び（E））と、180マイクロメートル（（C）及び（F））に表面をエッチングするようにプログラムしました。プログラムされた深さと実際にエッチング深さの近さを表1に表示されている。この図は、Bhuthalingam らから変更されている。2015年10。
図5：Bioinkは、間葉系幹細胞を配信溝（A）と（B）との細長い形態とアライメントによって実証されるようにエッチングされたパターン上にbioinkで印刷RFP-MSCが上に播種した細胞と比較して機能を感知することができます。 bioinkのない機能（ すなわち 、培養培地中）（C </ strong>の）と非パターン化表面（D）に。この図は、Bhuthalingam ら。2015年10から変更されています。
| プログラムの深さ（μm） | エッチングされた溝の深さ（μm） |
| 40 | 35±7 |
| 90 | 81±6 |
| 180 | 175±3 |
表1：ポリスチレン上の実際のエッチング深さに対するプログラムの比較この図は、Bhuthalingam らから変更されている2015年10。。。
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Discussion
この手順の重要なステップは、プロセスが、機能に細胞沈降を可能に出血/ bioinkが広がることなく印刷し、せん断応力の細胞死せずに細胞を送達し、不要な系統への分化を誘発してはならないように、幹細胞の実際のbioprinting配信です。
期待されるセルの配置が発生し失敗した場合は、bioink粘度は、印刷のためのその適合性について評価すべきです。 bioink細胞がパターン化されたポリマー表面に沈降することを可能にすることが重要です。 bioinkポリマーの濃度を低減することができるか、その温度は、粘度を低下させ、細胞の沈殿を促進するために、（37℃の最大値まで）増加しました。しかし、これらの減少は、/ブリード印刷後を広めるためにbioinkを引き起こす可能性があります。ここでは、（w / v）の1×PBSに溶解した2％のゼラチンを使用することをお勧め。細胞濃度印刷後の減少表示された場合、その後の印刷により誘導されるせん断応力は妥協していることができます印刷されたセル7の生存率。前にこのようなレサズリンfluoresence 7の活性化としての生存率アッセイを使用して印刷した後bioinkで細胞を確認してください。 bioprinted幹細胞が表面に接触が、整列していない場合に加え、印刷時の剪断応力は、望ましくない分化経路を誘発することによって、それらの多分化を減少可能です。印刷後の幹細胞性は、CD 29 10,19,20として幹細胞マーカーを用いて、蛍光活性化細胞選別（FACS）分析によって評価することができます。それは、せん断応力が細胞に有害な効果を有していることが見出された場合、bioink印刷粘度は、アルギン酸塩、プルロニックF127、ヒアルロン酸、ジェランガムなど、いずれかの剪断減粘性でbioinkポリマーを追加または置換することによって低減することができますゼラチンメタクリレートまたはポリエチレンオキシド19、21-25。
最後に、最適化することができる他の態様は、印刷背圧、bioink細胞密度を含みます、ノズル直径。背圧はbioinkの粘度に最適化を必要とし、個別の切れ目のないトレースを得るために変更することができます。高い細胞濃度bioink粘度を増加させ、プリントヘッドを詰まらせることができます。しかしながら、この押出プロセスは、他のbioprinting方法26,27よりも比較的高い細胞密度の印刷を可能にするん。印刷ノズルゲージの選択は、小口径ノズルが微細トレースを生成することができるが、目詰まりを起こしやすいとなりますので、考慮されるべきです。テーパーノズルは、同じ流量が円筒状ノズルとしてではなく、したがって、細胞生存度28が改善低いせん断応力で達成することができるので、より良好に機能することが見出されています。
背圧アシスト蒸着法、またにより最小プログラマブルステップ長を、例えば、インクジェットやレーザーアシスト法などの他の細胞の印刷手法より少ない分解能を有する押出bioprintingと呼ばEMERGの広がりbioinkをる。しかし、背圧押出装置は、最も容易にエッチングスタイラスを含めるために修正されます。 PDMS成形に続いて、フォトリソグラフィを使用して、このような微細加工のような製造溝の他の方法は、ロボットのエッチングよりも有意に多くのステップを有し、この方法は、新しい12,15,29-31を既存のパターンを修正または生成において以下多目的あります。
この方法は、1つ以上の細胞型の位置、向き、及び配置は重要な細胞相互作用のin vitro研究のためのツールを提供します。いくつかの細胞型を含む、間葉系幹細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞は、表面溝1,10,14,18に整列することが知られています。ここで紹介するエッチングされたパターンは、修正され、非常に迅速かつ容易に再版することができます。溝を有する表面パターンは形態、遊走、細胞接着の研究で使用され、細胞分化幹されているので、これは重要です。また、私Tはまた、神経および筋骨格組織工学18、32,33に適用されています。溝は、いくつかの細胞タイプの細胞分化または表現型の調節に役割を果たしてないので、この方法は、分化を促進し、画面を行うことができるように、個別の行のセルを堆積させるために、溝を作成するために使用することができます。現在、我々は携帯向きが心臓組織12-14,34の機能にとって重要であるとして、心筋細胞シートの製造のための細胞の異方性セルの配置を促進するため、この方法を評価されています。
ここで実証されたアプローチは、最終的に消費する可溶性bioinkを採用しています。しかし、より恒久的なヒドロゲル被覆が必要とされる場合には、微生物トランスグルタミナーゼを含むことは、リンクを横断し、有害な細胞9の効果、35なしでゼラチンベースのもののようなタンパク質ヒドロゲルを安定化させることができる。BioinksもUVためメタクリルポリマーを利用することができるcrosslinkinを開始し細胞適合性の様式36にヒドロゲルを有する細胞のグラム。しかしながら、我々の経験では、トランスグルタミナーゼ架橋ヒドロゲルとポリマー表面との間の改善された相互作用（以下容易に剥離）、およびポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEGDA）ヒドロゲル37に比べて細胞適合性環境に付与することが見出されました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5 ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30 G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1 mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
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