Abstract
Este manuscrito describe la introducción de características de orientación celular seguido de la entrega directa de las células de estas características en un bioink hidrogel usando un sistema de dispensación robótico automatizado. Se seleccionó la bioink particular, ya que permite que las células se sedimentan hacia y detectan las características. El sistema de distribución bioprints células viables en bioinks de hidrogel utilizando un cabezal de impresión contrapresión asistida. Sin embargo, mediante la sustitución de la cabeza de impresión con un lápiz o un bisturí afilado, el sistema de dispensación puede también ser empleado para crear señales topográficas a través de ataque químico de la superficie. El movimiento de la aguja se puede programar en pasos de 10 micras en los ejes X, Y y Z. Las ranuras estampadas fueron capaces de orientar las células madre mesenquimales, influir en ellos para adoptar una morfología alargada en alineación con la dirección de las ranuras. El patrón podría ser diseñado utilizando software de trazado de líneas rectas, círculos concéntricos, y las ondas sinusoidales. En un procedimiento posterior, fibroblastos y células madre mesenquimales se suspendieron en un bioink gelatina 2%, para bioprinting en una contrapresión impulsado cabezal de impresión de extrusión. El bioink rodamiento celular a continuación, se imprime usando las mismas coordenadas programadas utilizados para el grabado. Las células bioprinted fueron capaces de detectar y reaccionar a las características grabadas como se demuestra por su orientación alargada a lo largo de la dirección de las ranuras grabadas.
Introduction
El patrón deliberada de colocación celular permite la formación de las culturas que imitan in vivo organización celular 1. De hecho, la investigación sobre la interacción entre múltiples tipos de células puede ser asistido por la organización de su situación espacial 2,3. La mayoría de los sistemas de modelado se basan en procedimientos de modificación de superficie para promover o prevenir la adhesión celular con la deposición de células pasiva posterior. Bioprinting ofrece un control espacial y temporal sobre la distribución de la celda 1. Además de estas funciones, bioprinting ha sido descrita como un método técnicamente sencilla, rápida y rentable para la generación de andamios geométricamente complejas 4. Se utiliza el software de diseño por ordenador y permite la introducción de células en el proceso de fabricación 4.
Sistemas Bioprinting se han clasificado sobre la base de sus principios de trabajo como el láser basados, a base de inyección de tinta o de extrusión de base 4. Bioprinting de extrusión ha sido descrito como el más prometedor, ya que permite la fabricación de construcciones organizadas de tamaños clínicamente relevantes dentro de un marco de tiempo realista 4-6. Se lleva a cabo por cualquiera de presión mecánica o la parte posterior de extrusión asistida de un hidrogel bioink cojinete celular. En el método que aquí se presenta, se empleó la contrapresión. Como se ha mencionado, las células se entregan en un bioink citocompatible. Tal bioink debe apoyar la entrega de las células sin producir tensión de corte deletérea, y ser de una viscosidad suficiente para mantener la integridad de la huella impresa, sin colapsar o propagar (referido como "corrimiento de la tinta") 7-10.
La interacción de las células con su superficie adherente se sabe que influyen en el comportamiento celular. La topografía de la superficie se puede controlar la forma de la célula, la orientación 11, e incluso el fenotipo. En particular, la fabricación de ranuras y canales se han demostrado para inducirun estirado, morfología alargada en múltiples tipos de células. La adopción de esta morfología se ha encontrado para influir en el fenotipo de las células multipotentes y pluripotentes. Por ejemplo, cuando se alinea en ranuras, las células madre mesenquimales (MSC) mostrar evidencia de diferenciación hacia cardiomiocitos 12,13 y células musculares lisas vasculares adoptar el fenotipo contráctil sobre el sintético 10,14-17.
La célula de la alineación de canales o ranuras puede ser generada en una superficie polimérica a través de una serie de métodos, por ejemplo, en el fondo de ataque químico iónico reactivo, la litografía por haz de electrones, la impresión láser directa, láser de femtosegundo, fotolitografía y grabado en seco plasma 18. Estos enfoques son a menudo mucho tiempo, requieren un aparato complejo y puede ser limitante en la forma del patrón generado. Además, no se sincroniza con el patrón bioprinting y no permiten cellularization inmediata. El movimiento coordinadamente controlada de un automatizadosistema de dispensación puede seguir patrones complejos para la deposición de soluciones. Aquí demostramos cómo el movimiento microescala controlado puede ser explotada para crear canales para la orientación de la celda. Un lápiz o escalpelo afilado se encuentra junto a la cabeza de impresión en lugar de la jeringa de extrusión y el equipo se pueden grabar la superficie del polímero bajo la dirección del software de trazado. El método ofrece versatilidad en el diseño patrón y es aplicable a materiales poliméricos usados comúnmente en la bioingeniería, tales como poliestireno, PTFE, y policaprolactona. Como paso posterior al ataque químico, las células pueden bioprinted directamente a las ranuras rayados. El bioink gelatina utilizada aquí fue capaz de mantener tanto la traza y permitir que las células depositadas al sentido las características grabadas. Las células madre mesenquimales bioprinted a las ranuras grabadas se demostraron para alargar lo largo de ellos en líneas distintas.
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Protocol
NOTA: Este protocolo describe el uso de un sistema de dispensación asistida por robot (Figura 1A) de nuevo a la presión como un ataque químico de la superficie (Figura 1B) y bioprinter a base de extrusión (Figura 1C) 10.
1. Modificación de una superficie de poliestireno
- Utilice 1 hojas mm de poliestireno desde placas de cultivo tisular de poliestireno tienden a inclinarse hacia arriba en el centro, arruinando la consistencia altura tanto de grabado y de impresión.
NOTA: Como las láminas de poliestireno no se modifican para la adhesión celular, se lleva a cabo tratamiento de plasma. - tratamiento con plasma de oxígeno.
- En primer lugar, seleccionar una presión de 2 bar en el regulador del cilindro de oxígeno conectada a la máquina de plasma. A continuación, cambie la máquina de plasma y la entrada de las siguientes condiciones en el panel de mandos de la máquina: 150 W, 30 SSCM de oxígeno, 10 min (para la energía, el flujo de gas y la hora, respectivamente).
- Coloque el substrat de poliestirenoE en la cámara de plasma, sellar la puerta y pulse el botón de inicio en el panel de control. Remojar el sustrato de poliestireno tratada con plasma de oxígeno en suero bovino fetal y se incuba a 37 ° C durante 2 horas antes de lavar tres veces con fosfato 1x solución salina tamponada (PBS).
2. Programación Patrones de impresión
- Utilizar el Programa para Primera atacar la superficie con una aguja o un bisturí.
- Cuando se utiliza una aguja, insertar una aguja textil 1,5 mm de diámetro (desde el interior con gran cuidado) en la boquilla de una jeringa de dispensación (ya sea 5 o 10 ml) hasta que se aprieta y se fija. Si se utiliza un bisturí, elegir un bisturí ronda manipulado de forma tal que se puede sujetar en el mecanismo de sujeción del brazo de la impresión.
NOTA: El lápiz graba mejor que la hoja de bisturí patrones curvos. - La primera vez que se intenta crear un arreglo bioprinted, dibujar el patrón deseado en papel cuadriculado con ejes numerados para generar las coordenadas XY. Entonces yonput las coordenadas del dibujo grabado / bioprinted en el software de hoja de cálculo (Figura 2).
NOTA: El "patrón deseado" puede ser de muchas formas, tales como lineal, en forma de S, o circular. La elección depende del modelo experimental requerido, tales como líneas paralelas lineales para la diferenciación de las MSC en cardiomiocitos como se ha demostrado aquí. La función de gráfico de dispersión permite la visualización del patrón de trama propuesta. - Abra el / la dispensación de software de impresión. Seleccionar "Programa> Agregar programa" seguido de "Edición> Añadir punto" para configurar el programa. Exportar el X y la coordenada y los valores obtenidos a partir de la hoja de cálculo en la impresión / software utilizando la dispensación de "copiar y pegar" función.
- Calibrar la altura "z" del robot antes de cada ejecución con el fin de colocar la boquilla de lápiz / impresión sobre la superficie.
- En el / software de dispensación de impresión, seleccione la opción "Robot", haga clic en "Cambiar el modo y# 34; y habilitar la opción "Modo de enseñanza". Una vez seleccionado, el software permite la función "Jog" del robot.
- Para correr, primero inicializar el robot a su posición predeterminada mediante la selección de los siguientes comandos desde la barra de menú; "Robot> Inicializar Meca", a continuación, seleccione "Robot> Jog". Introducir los valores numéricos (en mm) en el "X e Y" ranuras requeridas para colocar el lápiz exactamente en el origen del patrón.
- A continuación, introduzca un valor numérico (en mm) en la ranura para "Z" para colocar la boquilla de la aguja o la impresión en contacto con la superficie, pero no la flexión o sangría a la superficie. Este punto se designa como valor inicial "Z".
NOTA: La profundidad de cada ranura se puede variar fácilmente usando el Z-altura del sistema. Las ranuras de 40, 80, y 170 micras se demuestran a cortar en la superficie de 1 mm de espesor láminas de poliestireno (Figura 4 y Tabla 1).
- Seleccione la pde instrucciones rint para cada uno de los puntos de coordenadas, es decir, "Inicio de la línea de dosificación" para definir el primer punto y el inicio de impresión, "línea de pase" para designar los puntos intermedios y "Fin de la línea de dosificación" para indicar al robot para poner fin a la tirada.
- Comunicar el programa al robot mediante la selección de los comandos de seguimiento de la barra de menú superior: "Robot> Enviar C & T de datos".
- Iniciar la marcha / impresión de grabado, cambiando el robot al modo "Run". Para ello, selecciona "Robot> Modo de Cambio> Cambiar el modo de funcionamiento" en la barra de menú superior.
- Iniciar el procedimiento de impresión pulsando el botón de "inicio" verde en la consola dispensador de robot.
- Cuando se utiliza una aguja, insertar una aguja textil 1,5 mm de diámetro (desde el interior con gran cuidado) en la boquilla de una jeringa de dispensación (ya sea 5 o 10 ml) hasta que se aprieta y se fija. Si se utiliza un bisturí, elegir un bisturí ronda manipulado de forma tal que se puede sujetar en el mecanismo de sujeción del brazo de la impresión.
3. Preparación e impresión de gelatina que contienen células Bioink
- Disolver 2% de gelatina en medio esencial mínimo alfa Medio (aMEM) (suplementado con 10% de FBS y 2% de antibiótico / antimycotic) a 60 ° C durante 2 horas para preparar las soluciones bioink.
- Precultivo la proteína roja fluorescente que expresan las células madre mesenquimales (RFP-MSC) a 70% de confluencia en 10 cm placas de cultivo de tejidos utilizando aMEM / 10% de SFB. Soltar las células unidas en suspensión eliminando el medio y el recubrimiento con una solución de 1x tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C.
- Sedimentar las células por centrifugación a 1000 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 0,5 ml de PBS 1x y contar la densidad de células usando un hemocitómetro.
- Después de permitir que la bioink se enfríe a temperatura ambiente, la mezcla suavemente en un volumen suficiente para la suspensión de RFP-MSC en el bioink para lograr una concentración final de 5 x 10 6 células ml-1.
- Verter la bioink cojinete de células en una jeringuilla de impresión con la boquilla de sellado. Enfriar la jeringa cargada a 4 ° C con el fin de alcanzar una viscosidad imprimible.
- Coloque la jeringa cargada en la automatizadasistema de dispensación robótico y conecte las líneas de presión de aire. Retire la jeringa Luer sello y adjuntar la boquilla de impresión.
- Extruir la bioinks cellularized en líneas delgadas utilizando 0,05 MPa contrapresión, a las 5 mm / seg velocidad de escritura de una jeringa de 10 ml a través de un 27 G de aguja / boquilla (apretados recomienda más cilíndrica) sobre una superficie de la película de poliestireno, después de depositar previamente programada patrón descrito en el paso 2.1 para colocar el bioink cellularized en las ranuras pre-grabadas.
- Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, añadir 10 ml de medio de crecimiento (suplementado con 10% de FBS y antibióticos) y se incuban las células durante 24 horas (para permitir que las células para detectar y reaccionar a las características grabadas al agua fuerte) antes de ver usando un microscopio de fluorescencia invertido un aumento de 10x.
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Representative Results
Los resultados representativos demuestran que el sistema de dispensación robótica asistida contrapresión se puede utilizar como un bioprinter a base de extrusión para llevar a cabo tanto de ataque químico de la superficie y la impresión bioink (Figura 1 A). Se puede utilizar para la generación de ranuras grabadas en superficies de polímero, y para imprimir posteriormente un bioink cojinete célula directamente a las características (Figura 1 B y C).
Tanto el grabado y la impresión son determinadas por las coordenadas programadas de entrada (Figura 2) en el software de impresión / distribución que permite la impresión de lineal, curvo y los patrones radiales según sea necesario para la aplicación (Figura 3 AC). La configuración del eje Z permiten el control de la profundidad de ranura grabado al agua fuerte (Figura 4 y Tabla 1).
después de reemplazarel lápiz con un cabezal de impresión de hidrogel, la programación que coordina el grabado podría ser reutilizado para permitir que el sistema de dispensación robótico para entregar el bioink cojinete célula directamente a las ranuras grabadas siguientes el mismo diseño (figura 3 D y E). Como se puede observar en la Figura 5 A y B, las células madre sembradas por bioprinting dentro de la bioink finalmente sedimentos a la superficie y el sentido y se alargan a lo largo de la dirección del grabado dentro de las líneas discretas. Las células sembradas en medio de cultivo sin bioprinting alineados en la dirección de las características, sin embargo, que cubren toda la superficie (Figura 5 C), lo que demuestra que el bioink constriñe las células a la traza impreso. Sin características grabadas al agua fuerte, las células sembradas en medios de cultivo no muestran orientación o alineación (Figura 5 D).
Figure 1:. El sistema de dispensación robótico automatizado (A) El aparato se ha personalizado con la inclusión de un estilete afilado (fijado en una jeringa) central para el cabezal de impresión que graba anillos concéntricos en un portaobjetos de poliestireno (B). El cabezal de impresión podría entonces ser convertido para extruir bioink gelatina cojinete celular, con presión de retorno asistido de extrusión, y el depósito en el patrón previamente grabado al agua fuerte (C). Esta cifra ha sido modificado a partir de Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 2: Representación gráfica xy coordenadas en un software de hoja de cálculo La captura de pantalla que se muestra aquí demuestra que el trazado xy coordenadas creó un patrón de onda sinusoidal tal como se muestra por la trama gráfico.. Estas coordenadas han sido introducidos en el software de trazado mediante el copiar / pegarfunción.
Figura 3:. Grabado patrón versatilidad Las coordenadas programados en el software de trazado fueron capaces de grabar lineal (A), sinusoidal (B) y los círculos concéntricos (C). Las ranuras grabadas en poliestireno podrían imprimirse directamente sobre la bioink hidrogel durante la etapa posterior (D) y (E). Esta cifra ha sido modificado a partir de Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 4:. Grabado profundidad de ranura La profundidad de la ranura grabada pueden ser reguladas por el control del eje z del sistema de dispensación. Imágenes (A) a (C) muestran la visión de arriba y(D) a (E) muestra la sección transversal. El robot se programó para atacar la superficie hasta una profundidad de 40 ((A) y (D)), 90 ((B) y (E)) y 180 m ((C) y (F)). La cercanía de la profundidad programada y la profundidad de grabado real se muestra en la Tabla 1. Esta cifra ha sido modificado a partir de Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 5: Bioink entregado células madre mesenquimales la RFP-MSC impresos en el bioink en los patrones grabados podían sentir las características como se ha demostrado por su morfología alargada y la alineación con las ranuras (A) y (B) en comparación con las células sembradas en el. características sin bioink (es decir, en medio de cultivo) (C </ strong>) y sobre una superficie sin patrones (D). Esta cifra ha sido modificado a partir de Bhuthalingam et al. 2015 10.
| Profundidad programada (m) | Profundidad de surco grabado (micras) |
| 40 | 35 ± 7 |
| 90 | 81 ± 6 |
| 180 | 175 ± 3 |
Tabla 1:. Comparación de los programada frente a la profundidad de grabado real sobre poliestireno Esta cifra ha sido modificado a partir de Bhuthalingam et al 2015 10..
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Discussion
El paso fundamental de este procedimiento es la entrega bioprinting real de las células madre ya que el proceso debe permitir la sedimentación de células a las características, imprimir sin bioink difusión / sangrado, entregar las células sin la muerte celular esfuerzo de corte y no desencadenar la diferenciación hacia el linaje no deseado.
Si la alineación de celdas esperado no se produce, entonces la viscosidad bioink, se debe evaluar su idoneidad para la impresión. Es importante que la bioink permite que las células se sedimentan a la superficie del polímero con patrón. La concentración del polímero bioink puede ser reducida o su temperatura aumenta (hasta un máximo de 37 ° C), para reducir la viscosidad y promover la sedimentación de células. Sin embargo, estas reducciones pueden hacer que el bioink para difundir la impresión del poste / purga. Aquí sugerimos el uso de gelatina al 2% (w / v) disuelto en PBS 1x. Si la concentración de células post-impresión aparece reducido, entonces la tensión de cizalladura inducida por la impresión puede haber comprometido laviabilidad de las células impresos 7. Compruebe las células en el bioink antes y después de la impresión usando un ensayo de viabilidad tal como la activación de la fluorescencia de resazurina 7. Además, si las células madre bioprinted en contacto con la superficie, pero no se alinean, entonces es posible el esfuerzo cortante durante la impresión disminuye su multipotencia mediante la activación de una vía de diferenciación no deseado. Publicar stemness impresión puede ser evaluado mediante análisis de fluorescencia de células activadas (FACS) utilizando marcadores de células madre tales como CD 29 10,19,20. Si se comprueba que la tensión de corte es tener efectos nocivos sobre las células, a continuación, la viscosidad de impresión bioink puede reducirse mediante la adición o sustitución de polímero bioink con una cizalla adelgazamiento de uno, tal como alginato, Pluronic F127, ácido hialurónico, goma gellan, metacrilato de gelatina o de óxido 19, 21-25 polietileno.
Finalmente, otros aspectos que se pueden optimizar incluyen la contrapresión de impresión, densidad de células bioink,y diámetro de la boquilla. La contrapresión requiere la optimización de la viscosidad de la bioink y se puede alterar para obtener una huella ininterrumpida discreta. Una alta concentración de células puede aumentar la viscosidad bioink y obstruir el cabezal de impresión. Sin embargo, este proceso de extrusión no permitir la impresión de las densidades de células relativamente más altos que otros métodos bioprinting 26,27. La selección del indicador de boquilla de impresión debe ser considerada desde boquillas de pequeño diámetro pueden producir una traza más fina pero será propenso a la obstrucción. Se han encontrado boquillas cónicas para funcionar mejor ya que el mismo caudal se puede lograr como una boquilla cilíndrica pero a un menor esfuerzo de corte, por tanto, la mejora de la viabilidad celular 28.
El método de deposición de contrapresión asistida, también referido como bioprinting extrusión, tiene una menor resolución que otros enfoques de impresión de células tales como de chorro de tinta y la metodología asistida por láser, debido a la longitud mínima de paso programable y la difusión de la emerging bioink. Sin embargo, el equipo de la contrapresión de extrusión se modifica más fácilmente para la inclusión de una aguja de grabado. Otros métodos de ranuras que producen tales como micro-patrones utilizando fotolitografía seguido de moldeo PDMS tienen significativamente más pasos que el grabado robótico y el método es menos versátil en la modificación de los patrones existentes o la producción de los nuevos 12,15,29-31.
Este método ofrece una herramienta para el estudio in vitro de la interacción de células donde la posición, la orientación y disposición de uno o más tipos de células son importantes. Se conocen varios tipos de células incluyendo las células madre mesenquimales, fibroblastos y células de músculo liso para alinear en ranuras superficiales 1,10,14,18. Los grabados al ácido, que aquí se presentan, pueden ser modificados y reimpreso muy rápidamente y con facilidad. Esto es de interés como el patrón de superficie con ranuras se ha utilizado en el estudio de la adhesión celular, la morfología, migración y diferenciación de células madre. Por otra parte, it también se ha aplicado a la ingeniería de tejidos neurales y musculoesquelético 18, 32,33. Desde las ranuras juegan un papel en la diferenciación celular o la regulación fenotipo para varios tipos de células, este método se puede utilizar para crear ranuras, para ayudar a la diferenciación y para depositar las células en filas discretas de modo que las pantallas se pueden realizar. Actualmente, estamos evaluando este método para promover la disposición de pila de anisotrópico de células para la producción de láminas de células de los cardiomiocitos, como la orientación celular es importante para la función del tejido cardiaco 12-14,34.
El enfoque ha demostrado aquí emplea un bioink soluble que finalmente se disipará. Sin embargo, si se requiere una cobertura de hidrogel más permanente, a continuación, la inclusión de transglutaminasa microbiana puede reticular y estabilizar hidrogeles de proteínas tales como los basados en gelatina sin efectos adversos sobre las células 9, 35. Bioinks también pueden utilizar polímeros metacrilado para UV inició crosslinking de hidrogeles de rodamiento de células en forma citocompatible 36. Sin embargo, en nuestra experiencia, se encontró que la reticulación transglutaminasa conferido por una interacción mejorada entre el hidrogel y la superficie del polímero (menos fácilmente deslaminado), y un medio ambiente más citocompatible en comparación con poli (etilenglicol) diacrilato (PEGDA) de hidrogel 37.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5 ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30 G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1 mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
References
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