Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Cnidarianer, og specifikt Hydra, var de første dyr vist sig at regenerere beskadigede eller afhuggede strukturer, og faktisk sådanne undersøgelser velsagtens lanceret moderne biologisk undersøgelse gennem arbejdet i Trembley mere end 250 år siden. I øjeblikket studiet af regenerering har oplevet en opblomstring ved hjælp af begge de "klassiske" regenerative organismer, såsom Hydra, Planaria og Urodeles, samt en udvidelse spektrum af arter, der spænder over intervallet Metazoa, fra svampe gennem pattedyr. Udover dens iboende interesse som et biologisk fænomen, vil forstå, hvordan regenerering arbejder i en række arter informere os om, hvorvidt regenerative processer deler fælles træk og / eller arter eller kontekst-specifikke cellulære og molekylære mekanismer. Den starlet søanemone, Nematostella vectensis, er en ny model organisme til regenerering. Ligesom Hydra, Nematostella er medlem af den gamle phylum, Cnidaria, men inden for than klasse Anthozoa, en søster clade til hydrozoa der er evolutionært mere basal. Således aspekter af regenerering i Nematostella bliver interessant at sammenligne med de Hydra og andre cnidarianer. I denne artikel præsenterer vi en metode til at gennemskære, observere og klassificere regenerering af aboral ende af Nematostella voksen, som kaldes physa. Den physa undergår naturligt fission som et middel til ukønnet formering, og enten naturlig fission eller manuel amputation af physa udløser genvækst og reformation af komplekse morfologier. Her har vi kodificeret disse enkle morfologiske ændringer i en Nematostella Regeneration Iscenesættelse System (dettes NRSS-organ). Vi bruger dettes NRSS-organ til at afprøve virkningerne af chloroquin, en inhibitor af lysosomal funktion, der blokerer autofagi. Resultaterne viser, at regenerering af polyp strukturer, især mesenteries, er unormal, når autophagy inhiberes.
Observation af regenerering i en enkelt hydra var den skelsættende begivenhed i fremkomsten af biologien som en eksperimentel videnskab 1,2. Regeneration forbliver et fænomen af ekstraordinært bred appel til biolog og lægge personen ens. Potentialet for udviklingsmæssige biologer, klinikere, biomedicinske forskere og væv ingeniører til at forstå og overvinde grænserne for menneskelig regenerering gør regenerering biologi mere end uløseligt interessant.
Nu, med brug af nye teknologier såsom genom sekventering og gevinst og tab af funktion værktøjer, er feltet klar til at drille hinanden regenerative mekanismer og i sidste ende at forstå, hvordan forskellige arter kan regenerere, mens andre ikke kan. Graden af ensartethed i molekylære, cellulære og morfologiske reaktioner mangler at blive belyst, men indtil videre ser det ud til, at de grundlæggende reaktioner blandt dyr, der kan regenerere er mere ens, end det ville have været imagiNed kun et årti siden 3.
Cnidarianer i særdeleshed er facile på regenerere næsten alle deres kropsdele midt et bredt spektrum af morfologisk mangfoldighed. Fra den ensomme ferskvand polyp, Hydra sammen med de små marine polypper, der bygger enorme koralrev, til de komplekse koloniale siphonophorer, såsom den portugisiske Man-O-War, regenerering er ofte en form for reproduktion, i tillæg til en mekanisme for reparere eller reformere beskadigede eller mistede kropsdele som følge af skade og prædation. Om de forskellige arter af Cnidaria anvender tilsvarende eller forskellige mekanismer til regenerering er et fundamentalt interessant spørgsmål 4-6.
Vi, og andre har været at udvikle anthozoan, Nematostella vectensis som en model for regenerering 7-17. Vi har for nylig udviklet en mellemstation system til at beskrive regenerering af et hele kroppen fra et morfologisk ensartet stykke væv gennemskæres fra Aboral ende af polyp 10. Mens Nematostella polypper kan regenerere, når gennemskæres på ethvert niveau, valgte vi at skære voksne på en aboral position i den mest morfologisk simple region, physa, dels fordi det er tæt på det normale plan naturlig ukønnet fission 18, og også fordi det tillader observation og molekylære analyser af, hvordan et hele kroppen samles igen fra de simpleste morfologiske komponenter.
Den Nematostella Regeneration Staging System (dettes NRSS-organ) tilvejebringer et relativt simpelt sæt af morfologiske kriterier, som kunne anvendes til at score forløbet af ethvert aspekt af regenerering af en amputeret physa under normale dyrkningsbetingelser eller eksperimentelt perturbed situationer som småmolekylære behandlinger, genetisk manipulation eller miljømæssig ændring. Som forventet, er dettes NRSS-organ bliver vedtaget som en morfologisk stillads, hvor de cellulære og molekylære begivenheder regenerering kan refereres10.
Endelig vores fremgangsmåde til skæring frembringer et gabende hul adskillige størrelsesordener større end utrolig lækker punktering anvendes i en nylig undersøgelse 17, men begge sår heler i omkring 6 timer. Dokumentere de visuelt fængslende og adskilte faser af sårlukning bør foreslå eksperimentelle metoder til at forklare den tilsyneladende uafhængighed af størrelsen af et sår, og den tid det tager at lukke. Således en dybere visuel forståelse af den aboral amputation proces, leveres af denne protokol, vil hjælpe yderligere undersøgelser i denne model regenerering systemet og udvide anvendelsen af denne iscenesættelse system ved hjælp af Nematostella vectensis.
Anvendelse af Nematostella som en model for sårheling og regenerering bliver stadig mere populære. Således er det vigtigt at være i stand til at visualisere de morfologiske mønstre af en særlig protokol, inden effektive cellulære og molekylære analyser kan tildeles og sammenlignes. Nematostella have en høj grad af regenerativ "fleksibilitet", at være i stand til at reformere næsten enhver manglende struktur amputeret på ethvert sted, på post-Planula stadier af livet. Således har…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Tilskud til GHT.
Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
#5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |