Abstract
Cnidarians ve özellikle Hydra, hasarlı veya kopmuş yapıları ve aslında belki 250'den fazla yıl önce Trembley çalışmaları sayesinde, modern biyolojik soruşturma başlattı tür çalışmaları yeniden oluşturmak için gösterilen ilk hayvanlar vardı. Halen rejenerasyon çalışması süngerler gelen memeliler aracılığıyla bu Hydra, planaria ve Urodeles hem "klasik" rejeneratif organizmaları kullanarak bir diriliş yanı sıra metazoada aralığını kapsayan türlerinin genişletme spektrumunu gördü. biyolojik bir fenomen olarak içsel ilgi yanı sıra, rejenerasyon türlerinin çeşitli nasıl çalıştığını anlamak rejeneratif süreçleri ortak özellikleri ve / veya türler veya bağlam özgü hücresel ve moleküler mekanizmaları paylaşan olup olmadığı hakkında bize bilgi verecek. Starlet deniz anemon, Nematostella vectensis, rejenerasyon için gelişmekte olan bir model organizmadır. Hydra gibi, Nematostella ama t içinde, antik filum, Cnidaria üyesidirO sınıf Anthozo'lar, evrimsel daha bazal olan Hydrozoa kardeş clade. Nematostella rejenerasyon Böylece yönlerini karşılaştırmak ve Hydra ve diğer cnidarians olanlar ile kontrast ilginç olacaktır. Bu yazıda, bisect gözlemlemek ve physa denir Nematostella yetişkin, bir aboral sonu yenilenmesini sınıflandırmak için bir yöntem mevcut. physa doğal eşeysiz üreme için bir araç olarak fisyon maruz ve doğal atom ya physa elle kesilmesi ya kompleks morfolojilerin yeniden büyüme ve bir reformasyon tetikler. Burada bir Nematostella Rejenerasyon Evreleme Sistemi (NRSS) bu basit morfolojik değişikliklere kodlanmıştır var. Biz klorokin etkilerini, lizozomal fonksiyonunun blokları otofaji inhibitörü test etmek için NRSS kullanın. Sonuçlar Otofaji inhibe edildiğinde, polip yapıların, özellikle mesenteries, rejenerasyon anormal olduğunu göstermektedir.
Introduction
Tek bir hydra rejenerasyon gözlem deneysel bilim 1,2 olarak biyoloji gelişiyle seminal olay oldu. Yenilenme biyolog olağanüstü geniş temyiz fenomen kalır ve hem kişiyi yatıyordu. İnsan rejenerasyon sınırları anlamak ve üstesinden gelmek için gelişimsel biyologlar, klinisyenler, biyomedikal bilim adamları ve doku mühendisleri için potansiyel daha içsel ilginç daha rejenerasyon biyoloji yapar.
Şimdi, böyle genom dizileme ve kazanç ve fonksiyon araçları kaybı olarak ortaya çıkan teknolojilerin kullanımı ile, alan dışında rejeneratif mekanizmaların kızdırmak için hazırlanıyor ve sonuçta yeniden nasıl çeşitli türler anlamak için diğerleri olamaz. Moleküler, hücresel ve morfolojik tepkileri ortaklık derecesi aydınlatılamamıştır gerekmektedir, ancak bugüne kadar yeniden oluşturabilirsiniz hayvanlar arasında temel tepkiler olmuştur IMAGI olurdu daha benzer olduğu görülmektedirned sadece on yıl önce 3.
Özellikle cnidarians morfolojik çeşitlilik geniş bir yelpazede ortasında neredeyse tüm vücut parçaları rejenere de kolay bulunmaktadır. yalnız tatlı su polipi itibaren, Hydra gibi Portekizli Man-O-War gibi karmaşık sömürge siphonophores, için, büyük mercan resifleri inşa minik deniz polip ile birlikte, rejenerasyon için bir mekanizmaya ek olarak, çoğu kez üreme şeklidir tamir veya yaralanma ve avlanma sonucu hasarlı ya da kayıp vücut parçaları reform. Cnidaria farklı türler rejenerasyonu için benzer veya farklı mekanizmaları kullanmak ister temelde ilginç bir soru 4-6.
Bu ve diğer Anthozoan gelişmekte olan, Nematostella rejenerasyon 7-17 için bir model olarak vectensis. Biz son zamanlarda Abora gelen bisected doku morfolojik üniforma parça bir tüm vücudun yenilenmesini açıklayan bir evreleme sistemi geliştirmiştirpolip 10 l sonu. Herhangi bir düzeyde ikiye zaman Nematostella polipler yeniden iken, biz bu doğal aseksüel fisyon 18 normal düzlemine yakın olduğu için kısmen, en morfolojik basit bölgede, physa bir aboral pozisyonda yetişkin kesmek için seçti, ve aynı zamanda çünkü izin gözlem ve bütün vücudu basit morfolojik bileşenlerden yeniden birleştirilen nasıl moleküler analizleri.
Nematostella Rejenerasyon Evreleme Sistemi (NRSS), normal kültür koşulları altında, bir kesilmiş physa rejenerasyon herhangi bir yönü ilerleme skoru kullanılabilir morfolojik kriterler nispeten basit bir dizi içerir ya da deneysel olarak, örneğin küçük molekül tedavileri, genetik manipülasyon da durumları tedirgin veya çevresel değişiklik. Beklendiği gibi, NRSS rejenerasyon hücresel ve moleküler olayların başvurulabilir hangi bir morfolojik yapı iskelesi olarak benimsenmiştir hale gelmektedir10.
Nihayet kesim bizim yöntem yakın tarihli bir çalışmada 17 kullanılan pim nokta ponksiyon daha fazla büyüklükte bir gaping delik birkaç emir üretir, ancak her ikisi de yaralar 6 saat civarında iyileşir. yara kapatma görsel tutuklama ve farklı aşamalarını belgeleyen bir yaranın büyüklüğü ve kapatmak için gereken zaman belirgin bağımsızlığını açıklamaya deneysel yaklaşımlar önermek gerekir. Böylece, bu protokolü tarafından sağlanan aboral amputasyon sürecinin daha derin bir görsel anlayış, bu model rejenerasyon sistemi içine daha fazla soruşturma yardım ve Nematostella vectensis kullanarak bu evreleme sisteminin uygulanmasını genişletecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sıcaklık, Beslenme ve aydınlık / karanlık döngüsü için Animals 1. Klima
- Dünya çapında sayısız Nematostella laboratuarlarından biri, ya da kar amacı gütmeyen bir tedarikçiden Nematostella vectensis yetişkin elde (Tablo 1)
- Olarak, karanlıkta sabit sıcaklıkta (tipik olarak 18 ve 21 ° C) Nematostella korumak "/ 3x 1" yapay deniz Suda bin (PPT) başına 12 parça bir tuzlulukta (ASW). Genellikle basit soda-kireç camı kültür tabaklarında 250 mL veya 1.5 L kapasiteli 11 kültürleri korumak.
Not: Bu basit kültür koşulları yaygın Nematostella çalışma laboratuvarlar arasında kullanılır, ancak kültür bakımı da 19 otomatik hale getirilebilir. - Haftada 4x - 2 nauplii Nematostella taze yumurtadan Artemia besleyin. Sığ bir dikdörtgen cam tabak 20 veya 30 ° C'de tam güçte (36 ppt) veya 1 / 3x ASW Hatch Artemia kistleri,küçük ölçekli, ticari veya ev yapımı tuzlu su karidesi kuluçkahanelerin herhangi biri. Bir inkübatör mevcut değilse, karides, oda sıcaklığında yumurtadan ama çok daha yavaş yapacaktır.
Not: Bu genellikle tamamlanması için 24 saatten fazla gerektirir. - Haftada en az bir kez anemon kültür suyu değiştirin. en iyi yetişkin sağlığı için, (sabun olmadan) iyice temizleyin kültür tuzak meyvelerin gıda ve atık ve hayvan dolaştırmak için ceket kase ve birikmiş mukus salgıları haftada bir kez kase.
Beslenme Klima Animals 2. Seçme ve Dinlenme
- yaklaşık aynı uzunlukta seçin boyutu uyumlu polipler (3-5 cm, ne zaman doğal olarak rahat) ve önceki amputasyon üç gün boyunca koloniden ayrılan bir kapta koyun.
Not: kesim için seçilen hayvan sayısı deney tarafından belirlenecek elbette yürütülen, ancak genel olarak altı tekrarlamalı örnek noktası başına en az beş hayvan öneriyoruz. Böylece,Tipik bir deneyde, 30 hayvan minimum önceden seçilmiş olur. Genel olarak, daha sonra puanlama etkileyebilir (aşağıya bakınız) düzensiz amputasyon beri az sayıda (30) daha fazla seçmek akıllıca olacaktır. - önce amputasyon oda ışığa inkübatör en az bir saat, seçilen hayvanların çanak çıkarın.
oda ışık ve taşıma titreşimleri maruz kalma olasılığı hayvanların büzülmesine neden olur, bu yüzden uyarlanmış veya laboratuarlarında inkübasyon tarafından "rahat" gerekir: unutmayın. Hayvanlar dokunmak refrakter ve ışığa maruz kalma olacak ve bu noktada Nazik pipetleme ile hareket ettirilebilir. - İsteğe bağlı: (1 / 3x ASW olarak)% 7.5 MgCl 2 ekleyerek hayvanların anestezisi. Yavaşça bir standart plastik 5 ml pipet ile kase MgCl2 çözüm ekleyin.
hayvanlar sonunda ışığa ve fiziksel manipülasyon için alışkanlık haline gelecek olsa da, t "düzeltmek" korumak veya hayvanların uyutmak için avantajlı olabilir Not:Onlar uzun 16,21,22 olduktan sonra o devlet rahat. - 12 ppt ASW içeren 100 mm çapında bir steril bir cam kesme çanak tabanına, kesilmiş olan havuz beş hayvan (1 / 3x ASW) aktarmak için bir çok deliğe (> 0.5 cm) plastik pipet kullanın. 40X - 10 arasında değişen büyütme ile bir stereomikroskopta sahneye çanak yerleştirin.
Not: hayvanlar anestezi ve kesmek için rahat değil, onlar hala tekrar rahat olmak için birkaç dakika gerekebilir böylece dokunun ve stereoskop aydınlatma cevap olabilir ve.
3. Amputasyon
- Steril bir neşter kullanılarak, yaklaşık sürece geniş ve hiçbir mezenter içeren olduğu gibidir physa bir bölümünü elde etmek için amacı ile, her polip gelen aboral physa kesmek.
Not: İdeal kesim sitesi mezentere sona ermesi sadece aboral olduğunu. kesme düzleminde ince l uygun mezenterinde bir geçiş vardanielaesquivel Her mesenterial ekleme (bakınız Şekil 1, oklar) karşılık gelir. O deliği 17,30 'takmayı' kolaylaştırabilir mukus üretir çünkü mezenter bulunmaması önemlidir.- amputasyon arzulanan yere hayvan ile temas neşter bıçak yerleştirin. Bu, ya yardımsız (freehand) yapmak, ya da hafifçe # 5 forseps (Dumont tarzı veya benzeri) ile hayvanın vücudunu tutarak.
- vücudun genelinde bir 'sallanan' hareket neşter kavisli bıçak yararlanarak dokusu kesti.
Not: Doku neşter sarsan olarak temiz sever ve donörden physa istenilen bölümünü serbest olmalıdır. doku küçük bir parça hala vücudu ve physa bağlayan Ancak, neşter ile kesmek. Bu physa zarar verebilir, çekerek bağlı parçalarını ayırmak için çalışmayın.
- Çanak her kesilmiş 'donör' polip çıkarın ve ÖÇK iade'Toplanmış amputees' etiketli oran kase; kase tarih ve stok kültürüne geri.
Not: Ampute polipler normal beslenebilir sonra bir gün içinde aboral yara iyileşmesi ve olacaktır. Onlar istenirse physa tekrar ampute edilebilir hangi noktada iki hafta içinde normal görünümlü physa yeniden oluşturulur. - daha sonra adı her bir 12 ppt ASW 10 mL olan bir çok-yuvalı hücre kültürü plakasının ayrı bir steril oyuğuna her physa transfer 12 ppt ASW kesme çanak kalır kesilmiş physa durulayın.
Not: Bu örnekte, her deniz suyu de tutarak, 10 ml beş eksize physa ile altı plaka kullanır. Genel deniz suyu nedeniyle kullanım ve potansiyel buharlaşma harekete havaya maruz kalmasını önlemek için yeterince physa kapsamalıdır. plakası veya kuyu bir kapak olmalıdır. - 3.3 Her deneysel tedavi için her bir kuyunun ayrılmış en az 5 physa toplamak için - Tekrar 3.1 adımları.
- prov bir sıcaklıkta physa inkübePlanlanan deneysel sorgulamaları için yenilenme en iyi oranı ide. yenilenme istenen oran olarak belirlenen, sabit bir sıcaklıkta, bir ısı ayarlı inkübatör içine physa içeren plaka koyun.
Not: physa eksik dokuların yeniden 15 ve 27 ° C arasındaki sıcaklıklarda inkübe tam polip oluşturacaktır. yenilenme hızı ilk iki aşamada dışında sıcaklığa bağlıdır. Tüm sıcaklıklar için Aşama 4 ulaşmak için ortalama gün kestikten sonra 7 D, ve bu da 21 ° C 'de rejenerasyon ile çakışmaktadır. 27 ° C 'de, Aşama 4 3 gün önce ulaşılır ve 15 ° C sıcaklıkta, Aşama 4 21 ° C (bakınız referans 10) en rejenerasyon göre yaklaşık 3 gün kadar geciktirilir.
4. Nematostella Rejenerasyon Evreleme Sistemi ile Rejenerasyon değerlendirilmesi (NRSS)
- Değişken magnific ile stereo-bileşik mikroskop kullanılarak physa Puantirme (10 - 80X). Evre 0 taze kesilmiş Nematostella physa puan ve aynı zamanda NRSS 10 kullanılarak her gün sonrası amputasyon (dpa) puanlama devam ediyor.
Not: Anahtar evreleme kriterleri ve ayrıntıları Referans 10 bakınız.- Bir taze kesilmiş physa bir sarkık balon andıran bir Kupası'na şeklinde bir kitle olarak belirirse bir açık yara site ile, Evre 0 (Açık Yara) olarak physa puanı olasılıkla görülebilir.
Not: yara kenarları da başlangıçtan itibaren birbirine yapışıyor olabilir, ancak doku yine çöktü edilecek ve sertlik yoksundur. açık yara kenarları yara iyileşene kadar radyal daralma geçiren görülebilir. - amputasyon yara kapatılır görünüyorsa Aşama 1 (Kapalı Yara) olarak physa puan.
Not: Yara yeri gelecek sözlü kutup karşılık gelecektir. Gelecekteki sözlü kutup etrafında dış yüzeyi altında yatan radyal simetrik Endodermal mesenteriumda eklemeler karşılık gelen farklı kemerler görüntülemek için başlayabilir. - skor phYSA Oral kutup yüzeyi radyal simetrik bir düzende ve oluklar ile ayrılmış sekiz kaldırdı kemerler açığa şişirilmiş görünüyorsa Aşama 2 (Radyal Kemerler) olarak. kemerlerin tepesinde küçük, yarım küre kabarcıkları dikkat edin. Onlar gibi uzun boylu kadar geniş, büyük olasılıkla geçici hakkında olacak ve başlangıçta tek bir ektodermal hücre katmanı oluşturduğu olacaktır.
Not: Bazı durumlarda çift katlı kabarcıklar stabilize olabilir. Not: Bu veya daha sonraki aşamalarda bir mukoza tabakası physa bir zar 'kılıf' (Şekil 2) saklanması görünebilir. Bu, içine alıcı malzeme puanlama kolaylaştırmak için kaldırılmalıdır. - Endodermal ve ektodermal doku katmanları içeren dokunaçlarıyla tomurcukları stabil en azından bazı radyal kemerlerin oral ucunda oluşturulan eğer Evre 3 (Tentacle) olarak physa puan.
Not: dokunaçlar de geniş ve çok az hareketli olan daha uzundur. physa artış göstermektedir, ancak mezenter esasları vis değişken enflasyon haline gelebilir, böylecevücut boşluğuna (coelenteron) içine mesenteriumda ekleme uzanan ible. - physa onlar bağlamak için görünür yerden ölçülen iki kez radyal genişliğinden daha fazla olan ağız-aboral uzunlukları ile, vücut duvarı eklemeleri gelen coelenteron içine uzanan sekiz ayrı, görünür mesenteries içeriyorsa Aşama 4 (Lineer Mesenteries) olarak physa puanı onun aboral ucunda (enterostome) de yutak için.
Not: Dört veya daha az mesenteries "pilili" iç serbest kenarları vardır. yutak görülebilir. Sekizden fazla Tentacles hareketli, görünür ve bazen vücuda sözleşme. - physa plise ile dörtten fazla mesenteries vardır ve plise Sahne hayvan neredeyse "normal" yetişkin bir görünüme sahiptir 4. En fazla dolu ve dolambaçlı ise Aşama 5 (Ağırlıklı Pileli Mesenteries) olarak physa puanı, ancak görünür vardır gonadal hücreleri.
- Bir taze kesilmiş physa bir sarkık balon andıran bir Kupası'na şeklinde bir kitle olarak belirirse bir açık yara site ile, Evre 0 (Açık Yara) olarak physa puanı olasılıkla görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kopmuş physa rejenerasyon sırasında morfolojik olayların ilerlemesi her NRSS aşamada physa temsili görüşlerini içeren Şekil 1A, gösterilmiştir. Tipik physa kesim sitesi yetişkin (ok başları) gösterilir. Şekil 1A fotoğraflar tamamen şekillenmiş polip ile taze kesilmiş physa sözlü ve vücut yapılarının ilerici rejenerasyon göstermektedir. Şekil 1B, sırasıyla, Sahne 4 ve 5. etapta da, iç septa, mesenteries düzenlemesini gösterir C. Sahne 4 bazı mesenteries "pilelenmesi" yoksun, ama çoğunluk pileler geliştirmiş gereken bir Sahne 5 olarak nitelemek için olduğunu unutmayın. Şekil 1D forseps (Şekil 1 E) ile temizlenebilir mukus bir zar içinde sarılmış physa göstermektedir. (Bu makul hayvan tuzakları sürece) rejenerasyon genellikle zararlı değildir, zar physa puanlama engelleyebilir ve yapmak mümkün olmakla birlikteBöyle biyokimyasal / moleküler analiz için mikroskopi, örnek fiksasyonu veya hasat gibi deneysel manipülasyonlar, ing. Bu en iyi Aşama 1 sonra kaldırılır, ya da daha sonra ise reformlar olduğunu.
Şekil 2, evreleme sistemi Otofaji inhibe etkisini değerlendirmek için bir deneyin sonuçlarını skoru nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Physa kesilmiş ve 10, 50 ve 100 uM klorokin ile muamele ya da physa muamele edilmemiş (kontrol) idi. Klorokuin Otofaji için gerekli olan lızozomal fonksiyonları, inhibe eder. NRSS kriterleri Şekil 2E'de çizilmiştir rejenerasyon ve sonuçların boyunca physa skoru kullanıldı. Temsili kontrol (Şekil 2A) ve klorokin tedavi physa (Şekil 2 B - D) Fotoğraf kontrolleri evre 4 ötesine ilerleme olmadı evre 5. Chloroquine tedavi hayvanlar ulaştığı yapılan ve genellikle eksik mezenter regenera sergilendiyon (en yoksun plise), kısa tentacle büyüklüğü ve bazı durumlarda kısa gövde uzunluğu.
Yenilenme 1. Özellikleri Şekil. (A) ağız ve vücut yapıları yenileyici physa örnekleri NRSS göre düzenledi. Yetişkin etiketli panel dokunaçlar (t), farenks (Ph), mesenteries (m) ve mezenter eklemeler (mi) ile olgun hayvanın özelliklerini göstermektedir. Beyaz oklar mezenter yerleştirilmeden mesenteries geçiş aboral terminaline uzanan endoderm bir sırtın pilili bölgesini gösterir. Bu bölge physa oluşturmaktadır. Sarı oklar İdeal physa ikiye bölme sitesini gösterir. Panel 0 Yarılama sonra beş physa dakika gösterir ve Panel 0 'bir Stage 0 tanımlayan, merkezde açık yara olan physa bir birinin büyütülmüş görünüşüdürNRSS. Panel 1 yaralı bir physa şimdi 2 (- 2 ağız sonu görüntüleridir 0 panelleri) Sahneye gelen Evre aşağıda şişirilmiş dokular oral kutup etrafında kaldırdı radyal kemerler ile 1. Panel 2 gösterileri physa tanımlayan, kapalı gösterir. Panel 3 görünür şimdi aşama 3. Not ilkel mezenter elemanlarında, uzun ve şişirme physa (sağ bakan), oral kutupta ortaya tentacle tomurcukları vardır gösterir ve yutak ağız sonunda karanlık bir alanda oluşturuyor. Panel 4 tanımlayan Aşama 4. Doğrusal mesenteries şişirilmiş physa görünür, ağız kutupta gerçek dokunaçlarıyla ortaya çıkması, yanı sıra geçici 'kabarcıklar' gösterir. polip içinde görünür büyük yuvarlak kitle bilinmeyen ve ağız yoluyla ihraç edilecek. Panel 5 dörtten fazla kıvrımlı mesenteries, tam oluşmuş ph ile karakterize neredeyse tam rejenerasyon gösterirSahne 5 olarak tanımlayan arynx ve sekiz veya daha fazla Tentacles. (B, C) Bireysel physa ait Aboral görüşleri mesenteries ve biradial düzenleme ve morfoloji göstermektedir. Bu görüşe göre, pilili mesenteries doku yarıda bir çıkıntı (yeşil ok ucu) olduğu görülmektedir. Bir Aşama 4 physa dört veya daha az kıvrımlı mesenteries sahiptir ve bir sahne 5 physa fazla dört (C) yer alır. veya pleating olmadan Mesenteries sırasıyla yeşil veya sarı ok uçları ile gösterilir. Radyal genişletmiştir bir pilili mezentere (C) puan siyah ok ucu. Physa bir mukoza kılıfın (D, E) çıkarılması tasvir edilmiştir. Beyaz oklar rejenerasyon atmadan önce (E) 'deki gibi çıkarılmalıdır physa (D) saran bir mukoza kılıf göstermektedir. Bazen kalan doku (sarı oklar) kılıf içinde hapsolmuş olabilir ve bu da kaldırılmalıdır. Asterisk, nerede işareti sözlü direkleri gösterirEd. Kırmızı boyut çubukları A5 (1,0 mm) dışındaki tüm panellerde 0,5 mm. Paneller B ve Şekil C Referans 10. değiştirilmiş ve izniyle edilmiş bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil İyileşmesinde klorokin 2. Etkileri. NRSS bir uygulamasını göstermek için, bir klorokuin, Otofaji inhibitörünün etkileri test edilmiştir. Physa kesilmiş ve hemen, 10% 0.1 DMSO (kontrol) ya da klorokin, 50, 100 uM ihtiva eden 1 / 3x ASW yerleştirildi. Physa NRSS kullanılarak 24 saat aralıklarla değerlendirildi. (A) onlar aşamasına 5 ulaştığı kontrollerin alınan Temsilcisi uç nokta görüntüler.
Şekil 3. ÖzetiNRSS aşamalarında temel özellikleri. Bu diyagram NRSS her aşamasını tanımlayan anahtar morfolojik değişiklikleri gösterir. hareketlerin yönü yeşil ok uçları ile kırmızı oklarla ve özellikleri ile gösterilir. Evre 0 sadece (A) ve t) kestikten sonra açık yara göstermektedir. Yara kenarları merkezi (B) doğru kapatma radyal daralma uğrarlar. Aşama 1 yara (Cı) ve oral bakan çıkıntıların (D) kemerlerin yüksekliği tam kapatılması ile karakterize edilir; Oral yüzeye (ok başı) merkezi depresif olduğunu. Aşama 2 Oral yüzeyi (ok başı, E) belirgin bir gerilmeye sahiptir; physa kemerli (ok başları) tepesinde görünür tentacle tomurcukları ve blep ile (F) uzatılmış ve dar olmak başlar. 3. Aşama H istikrarlı tentacle tomurcukları (ok ucu, G) ve yenileyici farenks, oral kutbunda bir yoğunluk olarak görülebilir (turuncu kütlesi, ok ucu vardır (I ') birleşme yerinde uzun boylu gibi olmalıdır doğrusal ve unpleated mesenteries (I)' in varlığını gösterir. Mesenteriumda filamanın (J, J ') - Dört veya daha az mesenteries kendi iç kenarında pilili olabilir. Aşama 5 en iyi ve en aboral ucunda (K ') gelen ile değerlendirilebilir fazla dört kıvrımlı mesenteries (K) ile karakterize edilir. Yeniden baskı Referans 10. izni ile bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yara iyileşmesi ve rejenerasyon bir model olarak Nematostella kullanımı giderek daha popüler hale gelmektedir. Nedenle, atanan ve mukayese edilebilir etkili hücresel ve moleküler analizler önce belirli bir protokol morfolojik kalıplarını görselleştirmek edebilmek için önemlidir. Hayatın sonrası Planula aşamalarında, hemen hemen her yerde ampute herhangi bir eksik yapısında reform edememek, rejeneratif "esneklik" yüksek derecede sahip Nematostella. Bu nedenle, çeşitli araştırmacılar farklı yaşlarda, rejenerasyon amputasyon kaynaklanan veya polipler farklı bölgelerinde yaralama incelenmiş ve 7-18 boyutları var.
Burada anlatılan evreleme sistemi sadece üreme doku eksik anatomik tam çocuk polip için bir yetişkinin aboral ucundan ampute physa bir morfolojik üniforma bölümün dönüşümünü, (bunlar yeniden gençler cinsel m olunca biz henüz belirlenmedi aşağıdadırçalıçtırdıgınızda). Bu yaklaşım yakın maksimum karmaşıklık birine doku basit bir güdük gelen rejenerasyon inceler. Minimum grup büyüklüğü, potansiyel bireysel değişkenlik ve hayatta kalma için normalleştirmek için tavsiye edilir beş physa dahil. Tabii ki, bu sayı belirli deneysel hedeflerine uygun şekilde ayarlanabilir ancak NRSS protokol hidra 23 yılında rejenerasyon etkilediği bildirilmiştir olan böyle bir potansiyel 'hacim etkisi' inkâr physa başına orta 2 mL sağlar.
Nematostella rejenerasyon çalışması için diğer yaklaşımlar yetişkin ikiye orta gövdesini kullanılan veya oral sonunda ya da çocuk 4-tentacle sahne polipler orta gövdesini 7,11-18 ikiye var. İki çalışma, doğal fisyon 16,18 tarafından serbest physa olarak rejenerasyon inceledik ve son zamanlarda NRSS 8,9 ile ortaya çıkmıştır ampute physa kullanan yaklaşımlar. bu farklı yaklaşımların her biri kendi yararları vardır ve regenerati eşsiz soruları olabilirVe farklı yaşlı hayvanlar arasında farklı amputasyon veya yaralama rejimler altında meydana gelen süreçleri ettik. Bu çalışmada gösterilen physa ampütasyon ve çizik NRSS protokolü, sistemli bir çalışmaya physa nispeten homojen kümesi oluşturur ve physa büyüklüğünün değişik doku bileşimi ve doğal enine fisyon 18,24 ile gözlemlenen rejenerasyon sonraki ilerlemesini önler. Physa amputasyon Nematostella içinde eşeysiz üreme doğal moduna biraz karşılık rağmen, moleküler farklılıklar gövde ortasında ya da physa 16,18,24 doğal fisyon ve amputasyon kaynaklanan rejenerasyon arasında dikkat edilmiştir. amputasyon burada açıklanan veya doğal fizyon gösterisi gibi farkları yöntemiyle üretilen physa belirlenecek kalır olsun.
Burada anlatılan birkaç yetiştirme amputasyon ile başarı için kritik konular ve puanlama teknikleri vardır. amputasyon shou için seçilmiş poliplerld physa boyutu, beslenme öyküsü açısından eşleştirilmiş, aynı sıcaklıkta muhafaza ve eğer mümkünse yaşı (ikincisi sistematik sahne ilerlemesinde varyasyon bir yaş etkisi olup olmadığını belirlemek için test edilmemiştir rağmen) olmak. physa şişirilir ve neşter kavisli bıçak yetişkin doku üzerinde sallandı zaman kavisli bıçak olan bir keskin steril bisturi ile bir açık yara Edinme o ampute edilir Sahne 0 ve Sahne 1 arasında yara iyileşmesi morfolojik gözlemler için önemlidir tek hareketle ve hızlı bir şekilde iyi yemeğin kesim tedaviye transfer edilebilir. mezenterin eklemek veya Amputasyonlar kapsamlı fiziksel manipülasyon sonucu atılmalıdır vardır.
Nüfusun bireysel varyasyonun bir anlamda almak için işlenmemiş physa evreleme Uygulama denenmektedir. Bireysel physa arasındaki varyasyon erken aşamalarında için en az olduğunu. Örneğin, tüm physa 0 dpa Sahne 0 vardır. Aynı şekilde tüm physa Sahne ulaşmak1 dpa de senkronize 1. Aşama 2 görünümü 'enflasyon' küçük farklılıklar ile 2 dpa, ancak, elde edilir göreceli bir durumdur, çünkü gözlemci ayırt etmek için zor olabilir. Gerçek Tentacles işaretleri ilerleme görünümünü yenileyici tentacles altında tentacle tomurcuk görselleştirme engellemektedir bir zar "koza" görünümünü tarafından gizlenmiş olabilir 3. Sahne. membranöz kaplama önce çıkarılmış değilse, bunu şimdi yapılmalıdır. ince uçlu cımbız ile membranın çıkarılması rejenere physa kurtaracak. Sahne 4 ve 5 arasındaki fark pilili mesenteries sayısıdır. Evre 4 dört veya daha az pilili mesenteries vardır ve Sahne 5 beş ila sekiz pilili mesenteries vardır. plise lateral görünümde görülmekle birlikte, kıvrımlı mesenteries tam sayı aboral görüntüsü iyi olduğu tespit edilmiştir.
Bir phy yetişkin Nematostella yenilenmeyi incelerken bir meydan okumaVe aslında, diğer amputasyon sitelerinden kesilmiş dokuları ile sa rudiment yaşayan dokuların çeşitli netlik olduğunu. physa ampul sağlam yetişkin nispeten açıktır, ama nedeniyle amputasyon sonrası doku kasılması oldukça opak hale gelir. Clarity yavaş yavaş (2. Aşama) yara kapanır kez (Aşama 1) döner ve hayvan şişirmek başlar, ama o zaman bile doku ve yapılar aktif biraz yoğun dokularda (özellikle 3. Aşama) tarafından gizlenmiş kalıntıları yenileyici olan yara site çevresinde bölgesi. Artan enflasyon genellikle Aşama 4 ve neredeyse kesinlikle ağızdan ucunda neler olduğunu çözeceğini optik açıklama ardından 5. Sabitleme eşlik ancak floresan için izlenir ve daha kolay 15 görüntülenebilir canlı dokuya özgü transgenik muhabir olabilir daha bilgilendirici, 25-30.
o (sindirim bezleri liman) dokunaçlarını, ağız ve mesenteries yoksun beri bir ampute physa Açıkçası böylece requi, yem olamazEksik vücut yapılarının halka rejenerasyon gıda dışı kaynaklardan besin rezervleri seferber ederek yerine getirilmesi. Potansiyel olarak bunu gerçekleştirmenin physa sitoplazma, organeller ve diğer hücre bileşenleri hücre sardı ve anabolik süreçler 31-33 için enerji ve bileşikler üretilmesi için bir lizozom bağımlı bir mekanizma ile işlendiği, Otofaji gereğidir. Bu lizozom inhibitörü, klorokin ile physa muamele Otofaji ağız ve vücut yapılarına normal rejenerasyonu için gerekli olduğunu göstermektedir, mesenteries ve dokunaçlarıyla anormal rejenerasyon ve genel vücut morfolojiye yol bulmak. Otofaji hücre fonksiyonlarını 34-36 kök düzenler ve planaria, Hydra rejenerasyon temel rol oynar, ve zebra balığı 37-41. Ayrıntılı analiz otofaji hücresel ve moleküler düzeyde Nematostella yenilenme nasıl etkilediğini anlamak için gerekli, ama bizim ilk geçiş deneyi NR kullanarak faydasını gösterirrejenerasyon etkileyebilecek küçük moleküller için hızlı bir tarama yöntemi olarak SS.
Nematostella içinde rejenerasyon düzenleyen, genetik, moleküler ve hücresel süreçlerin sadece anlayış ilkel bir aşamada, ama rejenerasyonu için bu acil modeli genomik ve gen ekspresyon analizi için araçlar büyüyen bir repertuara sahiptir. Onun açıklamalı genomunun, bölgesel ve doku spesifik genetik belirteçlerin bir bolluk ve transgenesis, mutajenez, histoloji ve mikroskopi için sağlam yöntemler ile Nematostella anthozoan cnidarian rejenerasyon düzenleyen mekanizmaların ortaya ve rejeneratif süreçleri cnidarians ve Metazoan'da arasında benzer veya benzersiz olup olmadığını ortaya çıkarmak için vaat Genel olarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma GHT bir New York Kök Hücre Bilim (NYSTEM C028107) Hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Glass Culture Dish, 1,500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 mL |
| Polyethylene transfer pipette, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex Petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass Petri plates |
| Sterile 6-well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12-well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24-well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000 mL | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 - 40X magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , The Boxwood Press. (1986).
- Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. , Jean & Herman Verbeek. (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
