Summary

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone<em> Nematostella vectensis</em

Published: January 14, 2017
doi:

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

Die Nesseltiere und insbesondere Hydra, waren die ersten Tiere gezeigt beschädigt oder durchtrennt Strukturen zu regenerieren, und zwar solche Studien wohl moderne biologische Untersuchung durch die Arbeit von Trembley vor mehr als 250 Jahren. Sowohl mit "klassischen" regenerative Organismen, wie die Hydra, planaria und Urodelen sowie eine Verbreiterung Artenspektrum die den Bereich von Metazoen aus Schwämmen durch Säugetiere Derzeit Studium der Regeneration hat ein Wiederaufleben gesehen. Neben dem Eigeninteresse als ein biologisches Phänomen, das Verständnis, wie die Regeneration in einer Vielzahl von Arten Werke werden uns darüber informieren, ob regenerative Prozesse teilen gemeinsame Merkmale und / oder Arten oder kontextspezifischen zellulären und molekularen Mechanismen. Das Starlet Seeanemone, Nematostella vectensis, ist ein aufstrebender Modellorganismus für die Regeneration. Wie Hydra ist Nematostella ein Mitglied der alten Stamm, Nesseltiere, aber innerhalb von ter Klasse anthozoa, eine Schwester Clade zum hydrozoa, die evolutionär basaleren ist. So Aspekte der Regeneration in Nematostella wird interessant sein , mit denen der Hydra und anderen Nesseltieren zu vergleichen und gegenüberzustellen . In diesem Artikel stellen wir eine Methode zu halbieren, zu beobachten und die Regeneration des aboral Ende des Nematostella Erwachsenen zu klassifizieren, die die Physa genannt wird. Die Physa erfährt natürlich Spaltung als Mittel zur ungeschlechtlichen Fortpflanzung, und entweder natürliche Spaltung oder manuelle Amputation des Physa löst erneute Wachstum und Rückbildung von komplexen Morphologien. Hier haben wir diese einfachen morphologischen Veränderungen in einem Nematostella Regeneration Staging – System (die NRSS) kodifiziert. Wir verwenden die NRSS die Wirkung von Chloroquin zu testen, einen Inhibitor der lysosomalen Funktion blockiert Autophagie. Die Ergebnisse zeigen, dass die Regeneration von Polyp Strukturen, insbesondere der Mesenterien, abnormal ist, wenn autophagy gehemmt wird.

Introduction

Die Beobachtung der Regeneration in einem einzigen hydra war das wegweisendes Ereignis in dem Aufkommen der Biologie als experimentelle Wissenschaft 1,2. Regeneration bleibt ein Phänomen der außerordentlich breiten Appell an Biologe und Laien gleichermaßen. Das Potenzial für die Entwicklungsbiologen, Kliniker, biomedizinische Wissenschaftler und Gewebe – Ingenieure zu verstehen und die Grenzen für die menschliche Regeneration überwinden macht mehr Regenerationsbiologie als eigen interessant.

Jetzt, mit dem Einsatz neuer Technologien wie der Genomsequenzierung und Gewinn und Verlust der Funktion Tools, wird das Feld balanciert auseinander regenerative Mechanismen zu necken und um schließlich zu verstehen, wie verschiedene Arten regenerieren kann, während andere nicht können. Der Grad der Gemeinsamkeit in der molekularen, zellulären und morphologischen Reaktionen ist noch nicht geklärt werden, aber bisher scheint es, dass die grundlegenden Reaktionen bei den Tieren, die mehr ähnlich regenerieren kann, ist als gewesen imagi hättened nur vor einem Jahrzehnt 3.

Die Nesseltiere sind vor allem leicht auf fast alle ihre Körperteile unter einem breiten Spektrum von morphologischen Vielfalt zu regenerieren. Aus dem einsamen Süßwasserpolypen, Hydra zusammen mit den winzigen Meeres Polypen, die immense Korallenriffe, auf die komplexen Kolonial Siphonophoren, wie der portugiesischen Man-O-War bauen, Regeneration ist oft eine Art der Fortpflanzung, zusätzlich zu einem Mechanismus für Reparatur oder beschädigte oder verlorene Körperteile Reformierung von Verletzungen und predation führt. Ob die verschiedenen Arten von Cnidaria verwenden ähnliche oder andere Mechanismen für die Regeneration ist eine grundsätzlich interessante Frage 4-6.

Wir und andere haben die anthozoan entwickelt, vectensis Nematostella als Modell für die Regeneration 17.07. Wir entwickelten kürzlich ein Staging-System zur Beschreibung Regeneration eines gesamten Körpers von einem morphologisch einheitlichen Stück Gewebe aus dem Abora halbiertenl Ende der Polyp 10. Während Nematostella Polypen regenerieren kann , wenn auf jeder Ebene halbierten, haben wir uns für Erwachsene in einer aboral Position in der die meisten morphologisch einfachen Region, die Physa, teilweise zu schneiden , da dies zu der normalen Ebene der natürlichen asexuelle Spaltung 18 in der Nähe ist, und weil es auch erlaubt die Beobachtung und molekulare Analysen, wie ein ganzer Körper von den einfachsten morphologischen Komponenten wieder zusammengebaut.

Die Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) bietet eine relativ einfache Reihe von morphologischen Benchmarks , die verwendet werden könnten , um den Fortschritt von jedem Aspekt der Regeneration von einem amputierten Physa unter normalen Kulturbedingungen zu punkten oder gestört experimentell Situationen wie kleine Molekül – Behandlungen, genetische Manipulation oder Umwelt Veränderung. Wie erwartet, wird immer die NRSS als morphologische Gerüst angenommen, auf dem die zellulären und molekularen Vorgänge der Regeneration verwiesen werden kann10.

Endlich ist unser Verfahren des Schneidens erzeugt ein klaffendes Loch mehrere Größenordnungen größer ist als die Einstichstift Punkt in einer aktuellen Studie verwendeten 17, doch sind beide Wunden heilen in etwa 6 Stunden. Dokumentieren der visuell Arretieren und verschiedene Phasen des Wundverschlusses sollten experimentelle Ansätze schlagen die scheinbare Unabhängigkeit der Größe einer Wunde und der Zeit, um es zu schließen nimmt zu erklären. So kann ein tieferes visuelles Verständnis des aboral Amputation Prozess, durch dieses Protokoll zur Verfügung gestellt wird, unterstützen weitere Untersuchungen in diesem Regenerationssystem Modell und erweitern die Anwendung dieses Staging – System Nematostella vectensis verwenden.

Protocol

1. Vorbereitung der Tiere für Temperatur, Ernährung und Hell / Dunkel-Zyklus Erhalten Nematostella vectensis Erwachsene aus einem der zahlreichen Nematostella Labors weltweit, oder Non-Profit – Anbieter (Tabelle 1) Aufrechterhaltung Nematostella bei konstanter Temperatur (typischerweise zwischen 18 und 21 ° C) im Dunkeln, in "1 / 3x" künstlichem Meerwasser (ASW) in einer Salinität von 12 Teilen pro Tausend (ppt). Pflegen Kulturen in einfache…

Representative Results

Der Verlauf der morphologischen Ereignisse während der Regeneration in abgeschlagene Physa ist in 1A gezeigt , die an jedem NRSS Stufe repräsentative Ansichten von Physa umfasst. Der typische Physa Schnitt Seite ist auf den Erwachsenen (Pfeilspitzen) angegeben. Die Fotografien in 1A zeigen progressive Regeneration von Mund- und Körperstrukturen von frisch geschnittenem Physa durch voll ausgebildete Polyp. 1B, C , die die Anordnung der…

Discussion

Die Verwendung von Nematostella als Modell der Wundheilung und Regeneration wird immer beliebter. Somit ist es wichtig, die morphologische Muster eines bestimmten Protokolls vor dem wirksamen zellulären und molekularen Analysen zu können, können zur Visualisierung zugeordnet und verglichen werden. Nematostella haben ein hohes Maß an regenerativen "Flexibilität", fast jedes fehlende Struktur an jeder Stelle amputiert zu reformieren , in der Lage, bei post-Planula Phasen des Lebens. So hab…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von einem New Yorker Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Grant unterstützt GHT.

Materials

Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml Carolina Biological Supply 741004 250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml Carolina Biological Supply 741006 1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml  USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter Corning  3160 can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 – 40x magnification 

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Cite This Article
Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

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