Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Cnidarians, och särskilt Hydra, var de första djuren visade att regenerera skadade eller avslitna strukturer, och faktiskt sådana undersökningar utan tvekan lanserat modern biologisk undersökning genom arbetet i Trembley mer än 250 år sedan. Närvarande studiet av regenerering har sett ett uppsving med hjälp av både "klassiska" regenerativa organismer, såsom Hydra, planaria och Urodeles, samt en breddning spektrum av arter som sträcker sig över området av metazoer, från svampar genom däggdjur. Förutom dess inneboende intresse som ett biologiskt fenomen, kommer att förstå hur regenerering fungerar i en mängd olika arter informera oss om huruvida regenerativa processer har gemensamma funktioner och / eller arter eller kontextspecifika cellulära och molekylära mekanismer. Starlet havsanemon, nematostella vectensis, är ett växande modellorganism för regenerering. Liksom Hydra, är nematostella en medlem av den gamla stammen, cnidaria, men inom than klassen Anthozoa, en syster klad till hydrozoa som är evolutionärt mer basala. Således aspekter av förnyelse i nematostella ska bli intressant att jämföra och kontrastera med de Hydra och andra nässeldjur. I den här artikeln presenterar vi en metod för att Bisect, observera och klassificera regenerering av aboral änden av nematostella vuxen, som kallas physa. Den physa undergår naturligt klyvning som ett medel för asexuell reproduktion, och antingen naturliga klyvning eller manuell amputation av physa utlöser återväxt och reformation av komplexa morfologier. Här har vi kodifierat dessa enkla morfologiska förändringar i nematostella Regeneration Staging System (den NRSS). Vi använder NRSS att testa effekterna av klorokin, en hämmare av lysosomal funktion som blockerar autophagy. Resultaten visar att regenereringen av polyp strukturer, i synnerhet de mesenteries, är onormal när autophagy inhiberas.
Observationen av förnyelse i en enda hydra var det nyskapande händelse i tillkomsten av biologi som en experimentell vetenskap 1,2. Regenerering är fortfarande ett fenomen av utomordentligt bred vädjan till biolog och lekman lika. Potentialen för utvecklings biologer, kliniker, biomedicinska analytiker och vävnads ingenjörer att förstå och övervinna gränserna för mänsklig förnyelse gör regenerering biologi mer än egen intressant.
Nu, med hjälp av ny teknik, såsom genomsekvensering och vinst och förlust av funktionsverktyg är fältet redo att retas isär regenerativa mekanismer och att slutligen förstå hur olika arter kan regenerera medan andra inte kan. Graden av gemensamhet i molekylära, cellulära och morfologiska svar återstår att klarlägga, men hittills verkar det som de grundläggande reaktioner bland djur som kan regenerera är mer lika än vad som skulle ha varit imagiNed bara ett decennium sedan tre.
Nässeldjur i synnerhet är enkel på att regenerera nästan alla sina kroppsdelar bland ett brett spektrum av morfologisk mångfald. Från den ensamma färskvatten polyp, Hydra tillsammans med de små marina polyper som bygger enorma korallrev, till de komplexa koloniala Siphonophor, såsom den portugisiska Man-O-War, är regenere ofta en form av reproduktion, förutom en mekanism för reparera eller reformera skadade eller förlorade kroppsdelar till följd av skada och predation. Om de olika arter av Cnidaria använder liknande eller olika mekanismer för regenerering är en principiellt intressant fråga 4-6.
Vi och andra har varit att utveckla den KORALLDJUR, vectensis nematostella som en modell för regenerering 7-17. Vi utvecklade nyligen en mellanstation system för att beskriva regenerering av en hela kroppen från en morfologiskt enhetlig bit vävnad tudelas från Aboral slutet av polyp 10. Medan nematostella polyper kan regenerera när tudelas på alla nivåer, valde vi att skära vuxna i en aboral position i de morfologiskt enkla regionen, physa, delvis eftersom det är nära till normalplanet av naturliga asexuell fission 18, och också eftersom det tillåter observation och molekylära analyser av hur en hel kropp ihop från de enklaste morfologiska komponenter.
Den nematostella Regeneration Staging System (NRSS) ger en relativt enkel uppsättning morfologiska riktmärken som kan användas för att göra mål utvecklingen av någon aspekt av regenerering av en amputerad physa under normala odlingsbetingelser eller experimentellt störs situationer som småmolekylära behandlingar, genmanipulation eller miljö förändring. Som väntat är NRSS bli antagen som en morfologisk byggnadsställning som de cellulära och molekylära händelser förnyelse kan refereras10.
Slutligen vår metod för skärning ger ett gapande hål flera tiopotenser större än sällade punktering som används i en nyligen genomförd studie 17, men båda sår läker i cirka 6 timmar. Dokumentera visuellt gripa och distinkta faser av sårtillslutning bör föreslå experimentella metoder för att förklara den skenbara oberoende av storleken på ett sår och den tid det tar att stänga. Således, en djupare visuell förståelse för aboral amputation processen, som tillhandahålls av detta protokoll kommer att hjälpa ytterligare undersökningar i denna modell regenereringssystem och bredda tillämpningen av denna iscensättning system med nematostella vectensis.
Användning av nematostella som en modell för sårläkning och regenerering blir alltmer populärt. Således är det viktigt att kunna visualisera de morfologiska mönster av ett särskilt protokoll före effektiva cellulära och molekylära analyser kan tilldelas och jämföras. Nematostella har en hög grad av regenerativ "flexibilitet", att kunna reformera nästan alla saknade struktur amputerad på valfri plats, vid post planula skeden av livet. Sålunda har olika forskare undersökt reg…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Bidrag till GHT.
Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
#5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |