Abstract
動脈硬化は、心血管疾患や老化の顕著な特徴のための重要な危険因子とバイオマーカーです。原子間力顕微鏡（AFM）（ 等のプラスチック、ガラス、金属、）ハードに至るまで様々な材料のための粘弾性の機械的性質を特徴付けるための多目的な分析ツールである任意の基板上のセルに表面。広く、細胞の剛性を測定するために使用されるが、あまり頻繁に大動脈の剛性を測定するために使用されてきました。本稿では、無負荷マウスの動脈のex vivoでの弾性率を測定するために、接触モードでAFMを使用するための手順について説明します。我々は、マウスの大動脈の単離のために私たちの手順を説明し、その後、AFM分析のための詳細な情報を提供します。これは、レーザービームのアライメント、ばね定数とAFMプローブの偏向感度のキャリブレーション、および力曲線を取得するためのステップバイステップの手順が含まれています。また、データANALYための詳細なプロトコルを提供します力曲線のsisの。
Protocol
この研究における動物の作業は、ペンシルバニア大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。方法は承認されたガイドラインに従って行いました。
1.マウスと大動脈の分離の準備します
- 腹腔内に - （2ミリグラム/ kgの1） - （ - 100ミリグラム/ kgを80）、キシラジン（8に10mg / kg）およびアセプロマジンケタミンでマウスを麻酔。テールピンチテストで麻酔を確認してください。マウスが完全に麻酔された後、頚椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
- その背中の上でマウスを置き、解剖ボードにマウスをピン。 70％（v / v）エタノールのワイプと腹部エリアを清掃してください。
- ミッドラインで皮膚をつまみ、腹部での中規模顕微はさみと小さな初期切開を行います。鉗子で皮膚を保持しながら、胸骨に腹部から皮膚や腹膜をカットする中規模の顕微はさみを使用しています。
- bのリブを切り取ります中規模顕微はさみとOTH側面。慎重に小型マイクロサージェリーのハサミで肺と肝臓を除去し、心臓および大動脈を残します。解剖顕微鏡にマウスや解剖ボードを転送します。
- 小さな鉗子で大動脈の周囲の脂肪をつかみ、慎重に大動脈の周りに脂肪を切り取るために、小さなはさみを使用しています。
- 優しく、鉗子で大動脈をつかむだけで腹部大動脈の上、上行大動脈と下行大動脈の終わりに別のカットの開始時に小型マイクロサージェリーハサミで1カットをします。
- （;カルシウムとマグネシウムを含まないPBS）1×リン酸緩衝生理食塩水を含む60-mmディッシュに解剖し、大動脈を転送します。
- 小型顕微はさみを使用して、大動脈から残りの脂肪組織を離れて解剖し続けます。縦方向に大動脈を開くには、小さなはさみを使用してください。
- 下行大動脈とaortiの小片（〜2×4 mm）をカットする小型顕微はさみを使用AFM分析用Cアーチ（ 図1）。 60 mmのプラスチック皿に組織を置き、PBSのドロップに湿ったそれを保ちます。
図1：マウスにおける異なる大動脈セグメントの位置を示す画像大動脈は、横隔膜に心臓から単離し、下行大動脈の小部分および大動脈弓は、弾性率を測定しました。スケールバー、1ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
AFM測定のための2の準備組織サンプル
- 慎重に大動脈に触れることなく、ラボワイプを使用してPBSを除去します。組織の管腔側が上を向いていることを必ず。
- 静かに追加することによってプレートに開かれた大動脈の各端部を接着 5る-ゲルローディングチップでシアノアクリレート接着剤を10μl（ 図2）。
注：しっかりと各端部に組織を取り付けるために必要な接着剤の量は、経験的に決定されなければなりません。大動脈が、このプロセスの間に張られていないことが重要です。 - それが折り畳まれたり、フローティングされていないことを特定するために接着され、大動脈を確認してください。大動脈に接着剤を空気が乾燥した後（30から60秒）、静かにPBSを追加し、サンプルを沈めます。
注：準備AFM（手順3 - 5）は、組織を分析のために準備されている間に行うことができます。
図2：大動脈セグメントの漫画は、シアノアクリレート接着剤を使用して、60 mmの培養皿に接着シアノアクリレート接着剤は、AFM測定の準備のために大動脈試料のエッジに適用されています。コム/ファイル/ ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3.プローブのロード
- プローブ負荷スタンド上に流体プローブホルダをマウントします。
- ピンセットを使用して、球状の先端を有する窒化シリコンAFMプローブ（0.06 N / mのカンチレバー）をスライドさせ、プローブホルダに（我々は1μmの直径のSiO 2粒子を使用しているが、より大きなサイズを使用してもよいです）。 AFMプローブがしっかりとプローブホルダに固定されていることを確認します。
- AFMヘッドのZスキャナマウント上にプローブホルダーをスライドさせ、プローブホルダーがしっかり取り付けられていることを確認。
4.プローブにレーザーを揃えます
- AFMのソフトウェアを開きます。ソフトウェア上の実験のタイプを選択し、 実験のカテゴリーは、流体中にモードを問い合わせする流体と実験でモードを問い合わせするモード、 実験グループに連絡します。 ロードEXPをクリックしますソフトウェアでeriment。これは、レーザーがオンになります。
- 50 mmのガラスボトムディッシュに、蒸留水の3ミリリットルを追加し、レーザーアライメントユニットのステージに皿を置きます。このユニットは、カンチレバーの背面にレーザビームを集束するプロセスを簡素化します。
- レーザーアライメントユニットにレーザーアライメントユニットと電源の上に直立位置にAFMヘッドをマウントします。 AFMチップ上の液滴を形成するために、蒸留水約50μlを添加。
- ジョイスティックを使用して、AFMチップが皿内の水と接触するように、AFMヘッドを下げます。接触は、皿にAFMチップと水との間で行われていない場合は接触が行われるまで、静かに皿を上げます。 AFMチップは、アライメントユニットのLCD画面上の表示になっているので、ピント、明るさとXY位置を調整します。
- AFMヘッドのレーザー位置決めノブを調整することにより、AFMプローブの先端にレーザースポットの位置を調整します。 AFMヘッドに検出器の位置ノブを使用して、仮定を調整0と-1 Vの間の値まで、フォトダイオードのイオンは、垂直偏向のために得られ、〜0Vが水平偏向のために得られます。
- レーザー和信号が最大化されているかどうかを確認してください。必要であれば、繰り返しステップ4.5は、AFMチップ上のレーザビームと、最大の和信号を得るために、フォトダイオードの位置の位置を再調整します。
注：ステップ4.5を繰り返した場合でも最大の和信号を得るために、プローブホルダのAFMプローブを再配置する必要があるかもしれません。
5.偏向感度とAFMプローブのばね定数をキャリブレーション
- 鉗子で60 mmの培養皿上のスクラッチを行い、蒸留水で皿を埋めます。試料ホルダープレート上で培養皿を置きます。この場合、倒立顕微鏡の電動式XYスキャンステージ上に皿をマウントします。
- 撮像中に固定し、それを維持するために、プレートの上に磁気プレートホルダーを置きます。
- クリック
- 顕微鏡ステージ上AFMヘッドを配置します。
- プレートの傷に集中する顕微鏡を使用してください。ジョイスティックを使用するか、ゆっくりと慎重にPBSにAFMプローブを下げるために、ナビゲーションメニューの「停止中」の矢印をクリックします。わずかプレート内のスクラッチの上に頭を置きます。
注：AFMヘッドの初期位置は、試料に近い場合、係合する時間が大幅に短縮されます。 - 係合前に、必要に応じて最大SUM信号を得るために、AFMチップおよびフォトダイオードの位置にレーザビームの位置を再調整します。
- セットアップメニューで変更プローブをクリックすることで、チップの種類を選択します。 20 nmのスキャンを1Hz〜0〜 サイズ 、 スキャンレート 、256 サンプル/ラインとたわみ設定値 ： パラメータをチェックして 、パラメータを設定する]をクリックします。エンゲージクリックしてください。プローブは、プレートの表面に接触するまでエンゲージステータス]ウィンドウが開いたままになります。プローブに係合後、 ランプをクリックします。
- スキャンツールバーメニューの拡張モード ] をクリックし、パラメータを設定します。nmおよび1〜500μmの間にランプサイズ 、 ランプ・レート 2 Hzの、256 サンプル数 、 先端半径 500 nmまで、 サンプルポアソン比を0.5にすると、（材料を前提としてい測定することが20〜100nmの間に相対的とトリガしきい値を0にヒント半角 、 トリガーモード 、）完全に非圧縮性です。
- obtaにランプツールバーメニューで連続ランプをクリックしてくださいプレート（ 図3A）に力曲線インチこのフォースカーブでは、 偏向エラーにチャンネル1を設定します。
注：これは、ソフトウェアがz位置対垂直偏向として結果をグラフ化することができます。- 力曲線の左または右の端でクリックして、力曲線（ 図3A、破線の赤線）の線形領域を包含するようにカーソルをドラッグします。直線で収まるように、傾斜領域の境界をマークするために、これらの2行を使用します。
- ツールバーのランプを選択し、Update感度 ] をクリックします。値を記録し、この手順を4回繰り返します。ツールバーのキャリブレーションを選択し、[ 検出 ] をクリックします。入力偏向感度ボックス内の 5回の測定から平均値。
- AFMヘッドを上げるために3回- 2の撤回 ]をクリックします。このステップは、防止することが重要です熱チューニングプロセス中にAFMチップと基板の間の相互作用。ツールバーの熱チューンをクリックします。
- 長方形のカンチレバーのためのV字型カンチレバーのための1.144と1.106に100 kHzの（この情報はメーカーのカタログから取得することができる）と偏向感度補正 - サーマル 1のチューニング範囲を設定します 。
- 熱チューンメニューでは、熱同調曲線（ 図3B）を取得するためにデータを取得する ]をクリックします。 AFMソフトウェアを使用して、場所の赤フィッティングのための境界を定義するために、グラフのエッジからでマウスをドラッグして（ 図3（b）に示すように ）曲線の両側に破線。 ローレンツ（空気）以上のデータをフィット応じたシンプルな高調波発振器（流体）モデルのいずれかを選択します。
- フィットデータは 、その後、 春Kを計算し、この値を保存]をクリックします。リバネ定数キャリブレーションを数回泥炭および平均値を使用します。数回の撤回 ]をクリックします。
- 顕微鏡ステージからAFMヘッドを外し、アライメントユニットの上に置きます。顕微鏡ステージから皿を取り出します。
図3：AFMプローブのキャリブレーションに使用されるAFMフォースカーブ。 （A）代表的なAFM力曲線（検量線）。垂直方向の赤との間の力の曲線の延長部は、破線カンチレバー偏向感度を決定するために使用した。（B）は、以前に 20を説明したように、カンチレバーのバネ定数を計算するために使用される単純な調和振動子フィットグラフ。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
ex vivoでの弾性率を測定します
- 顕微鏡ステージ上の大動脈組織を含む60 mmの培養皿を置き、磁気プレートホルダーにプレートを固定します。
- 顕微鏡ステージ上AFMヘッドを配置します。 AFMプローブは、大動脈と接触することなく、静かにPBSで接触し、メニスカスを形成していないことを確認してください。必要に応じて、アライメントユニットにAFMヘッドを配置し、クリックして接触を防止するのに十分な隙間があるまで撤退 、その後、顕微鏡ステージ上AFMヘッドを配置します。
- 移動をクリックします。ジョイスティックを使用して、または「停止中」の矢印をクリックすると、ゆっくりと大動脈の上にカンチレバーを配置するためにAFMプローブを下げます。必要に応じて、AFMヘッド上の検出器の位置決めノブを使用して、フォトダイオードの位置を調整します。
- カンチレバーは、大動脈との接触を行うことができるようにエンゲージクリックしてください。
- かつて大動脈が締結され、ピエゾセンターが安定していることを確認し、 ランプをクリックします。ピエゾ中心が変動している場合、これは偽の係合の結果であり得ます。プローブを撤回し、少しずつフォトダイオードにレーザーの垂直オフセットを増加させる（〜0.5 V）と再係合します。
- プローブが遠い試料表面上にある場合にも、手動近い試料表面にプローブを下げる再係合する前に。前の手順は、変動を排除していない場合は、プローブを交換してみてください。
- 3ミクロン、相対的にトリガモードと100 nmのトリガしきい値にランプのサイズを設定し、 ランプが連続 ]をクリックします。探針と試料との間の接触点がZランプ・サイクルの3/4下のほぼ中央で発生することを確認します。これは観察されない場合は、試料を必要に応じて、ランプのサイズを調整し、かつ再係合し、サンプルから外れます。
- メニューバーに顕微鏡をクリックし、[ 設定 ] をエンゲージ 。 SPMが 30μmに撤退変更します。ランプツールバーメニューのランプが連続 ]をクリックします。
- 力曲線を観察した後、メニューバーのキャプチャをクリックし、[ ファイル名をキャプチャします。エンディング「0.000」（これは追加のキャプチャしたファイルは、1により数が増加することができます）で、目的のファイル名を入力します。指定されたフォルダを選択して、データを保存します。
- 撮影ツールバー]メニューの[ キャプチャ ] をクリックします。 撤退した後、 移動します ]をクリックします。大動脈の他の領域の上にカンチレバーを配置するジョイスティックやソフトウェアのコントロールを使用します（次の当初測定点に、 図4を参照）。
- 、 ランプを エンゲージクリックして、それぞれ、 連続上昇します。力曲線を観察した後、[ 停止 ] をクリックしますキャプチャします。
- 6.10 - を繰り返して、6.9を繰り返します。 図 4に示すように、面積当たり少なくとも5回の測定をキャプチャ注：私たちは、典型的には15収集- 図4に示すように、それぞれ、各組織における5つの異なる場所- 3から25の力曲線を。
。図4：全体的の剛性を獲得するために、各動脈内- 5異なる場所（5エリア1 - ） - 3から25回カンチレバー組織へのアプローチとインデント（エリア1）の漫画のこのAFM測定は15まで繰り返します組織サンプル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
7.データ解析
- オープンフォースカーブ解析ソフトウェア。
- Cl嫌な検索とメニューバーで開くと、ファイルをダブルクリックして、分析されます。
- 偏向感度、定数春、ヒント半径、ヒント半角とポアソン比を確認するには、ツールバーメニューの変更を強制パラメータをクリックします。パラメータを変更するには、その横にあるチェックボックスをオンにして、新しい値]列に正しい値を入力します。 [ 実行 ]をクリックします。
- 力曲線はノイズが多い場合は、 ボックスカーフィルタをクリックして、0 番目に3とフィルタの順序に、 平均ポイントを拡張する方向のための入力を設定します。データを平滑化するために実行をクリックします。
- メニューバーのベースラインの修正をクリックして、強制的に、 プロット・ユニットを拡張する方向の入力を設定し、分離するタイプ 、1 回目に是正命令とベースラインソースを拡張 実行 ]をクリックします。
- ツールバーメニューでインデントをクリックして、のようなフィット変数を扱うためにポイントベース、 コンタクトポイントアルゴリズムを問い合わせするように拡張され、 フィット法にアクティブカーブの入力を設定し、Noに粘着力 、 マックスフォースフィットバウンダリ 30％に、 ミン・フォースフィット境界にを含めますヘルツ（球面）に0％とモデルのフィット 。
注：我々の測定では、先端と試料（後退曲線のカンチレバーの陰性波）との間に有意な密着性はほとんど認められませんでした。このような付着が観察される場合には、適切なモデル（DMTまたはJKR）が分析18,19のために使用されるべきです。 - ヤング率の値を保存します。 3の各々のヤング（弾性）係数を分析- 図4に示すように、5つの領域（面積あたり5の力曲線）は、互いに短い距離以内に撮影されました。
注：、アーチファクトを除去分析からヤング率> 100キロパスカル（総測定値の正常〜10％）を除外するには。 - 3のそれぞれの平均ヤング率の値を計算 - （測定された）5つの領域を、全体として大動脈の平均弾性率を計算するためにこれらの値を使用します。
注：少なくとも3、より多くの場合、4から6個々の大動脈は、動脈硬化の正確な評価を得るために使用されます。最終結果は、「n」個の独立した実験の平均±SEMとしてプロットされています。必要な大動脈の正確な数は、当然のことながら、要求される精度のレベルに依存します。
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Representative Results
図5Aは、6ヶ月齢、雄のC57BL / 6マウスから降順（胸部）大動脈の位相コントラスト画像を示しています。 AFMカンチレバーは、直接組織上記の場所にあり、インデントのための準備ができました。 図5Bおよび5Cは、コンタクトモードでのAFMインデントによって得られた代表的な力曲線を示しています。 図5B及び図5Cに示す緑色の線は、球用ヘルツモデルを用いて得られたベストフィット曲線を表します。本文中に記載されているように図5Dに、下行大動脈および大動脈弓の平均剛性は、3つの個々のマウスから決定しました。下行大動脈および大動脈弓はそれぞれ、層状と乱流の領域を表すことに注意してください。それにもかかわらず、彼らの（機械的にアンロード）弾性率は、AFMによって決定されるように似ています。
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図5：大動脈ex vivoで降順にマウスオーバーAFMカンチレバーを示す力-押込み曲線と剛性データ分析 （A）位相差顕微鏡写真。スケールバーは100μm。（BC）（B）下行大動脈および（C）大動脈弓のために取得された2つの代表的な力インデンテーション曲線のセット。（D）平均マウスの下行大動脈の剛性および大動脈弓のように決定しました。上述。エラーバーは、平均+ SEMを示します。 n = 3の独立した生物学的複製。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
AFMのインデントは、細胞および組織の剛性（弾性率）を特徴付けるために使用することができます。本稿では、マウスで下行大動脈および大動脈弓を隔離し、これらの動脈領域のex vivoでの弾性係数を決定するための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。私たちは今、要約し、この論文に記載された方法の技術的な問題と制限事項について説明します。
いくつかの技術的な問題は、彼らの小型、薄型の性質を与えられたマウスの大動脈の単離と解析で発生することができます。洗浄動脈は縦方向に開かれている場合には、注意が弾性率のデータが収集された内膜（腔面）を破壊することないように注意する必要があります。最終サンプル皿中の過剰のPBSが皿に動脈の適切な接着を防止し、これは接着の前に動脈に触れることなく、ティッシュペーパーを使用して慎重に除去する必要があります。分離された動脈が紙組織シベニクに固執することができること、しかし、注意してくださいルは、過剰なPBSを除去しようとすると、これはサンプルが損傷することがあります。培養皿に動脈を接着するが、動脈が伸びていないことは非常に重要であるとのみ接着剤の少量の動脈の両端にビット・バイ・ビット印加されます。 AFMインデンテーションを行う場合には、接着剤が塗布された動脈の端部にプロービング回避することが重要です。新たに単離した動脈は弾性率の測定のために使用されるので、最後に、時間が最小化されるべき測定を収穫からの経過しました。
本研究で用いた球状の先端が500nmの半径を有しているので、最大500nmの押し込み深さを正確ヘルツモデルを用いて分析することができます。この押し込み深さは、内膜21に位置する内皮細胞の最上層と相関するであろう。動脈血サンプルのサブ内皮層のメカニズムを調べるために、より大きなコロイドプローブ（10 - 直径20μm）を使用することができますインデントと押し込み深さと計算された剛性の変化のために22,23を決定することができます。生物学的サンプルは通常、粘弾性ではなく純粋に弾性のため、また、（一定の押し込み深さで適用される力の減衰を監視する）応力緩和の測定は、動脈の機械的特性24,25の粘性成分を決定するために使用することができます。
AFM分析の潜在的な制限は、組織の小さな領域を測定スキャンサイズ、です。動脈細胞を含むほとんどの生物学的試料は、地形的および生体力学的に均質ではなく、この不均一性は、潜在的に圧痕部位の平滑性、押し込み深さと、試料に加えられた力の量に応じて弾性率の人為大きな変動をもたらすことができます表面。全体の弾性率の代表的な平均値を得るためには、反復AFMインデンテーションAを実行することが重要です以前の研究は、鋭いピラミッド状先端を有するAFMインデンテーションは、弾性率の高い見積もりをもたらし、ソフトな損傷を受けたことを明らかにしたとして、図4に示すように、動脈を通じてトン複数のランダムな場所は、。また、我々は、適切なサイズの球状チップを使用します生物学的サンプル26,27。
動脈硬化の我々のex vivoでの AFM測定は2補強平滑筋細胞の分子マーカーとよく一致するように見えるにもかかわらず、これらの動脈サンプルを機械的にロードされないことを理解することが重要であり、機械的負荷は、全体に重要な役割を果たす可能性が高いです動脈力学。 AFM、筋運動記録法（機械的負荷との互換性のex vivo法）28とパルス波速度（動脈硬化のin vivoで測定）29によって決定されるような動脈硬化の比較は可能性が高いarterの最も包括的な理解を提供しますIAL力学。
我々は、マウスの動脈のex vivoでの剛性を測定する接触モードでAFMを記載しています。この方法は、ランダムに大動脈の複数の領域にインデントによって平均組織剛性を推定します。組織の大きな領域からの剛性の空間分布を調べるために、最近の論文は、力ボリュームモード30でAFMを使用しています。このアプローチは、同時に剛性の変化のマップおよび組織の地形表面の高解像度画像が得られます。組織サンプルの硬さを測定することに加えて、力ボリュームモードのAFMは、細胞内の剛性10,31の空間分布をモニターするために細胞内で使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioScope Catalyst AFM system | Bruker | ||
| Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Silicon nitride AFM probe | Novascan Technologies | PT.SI02.SN.1 | 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | See section 1.4 |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | See section 1.8 |
| Fine Scissors-ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | See section 1.4 (medium sized) |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | See section 1.6 (small sized) |
| 60 mm TC-treated cell culture dish | Corning | 353004 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x | Corning | 21-031-CM | Without calcium and magnesium |
| Krazy Glue instant all purpose liquid | Krazy Glue | KG58548R | See section 2.2 |
| Gel-loading tips, 1 - 200 µl | Fisher | 02-707-139 | See section 2.2 |
| Tip Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78092-CP | See section 3.2 |
| 50-mm, clear wall glass bottom dishes | TED PELLA | 14027-20 | See section 4.4 |
References
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