Abstract
Arteriell förstyvning är en betydande riskfaktor och biomarkör för kardiovaskulär sjukdom och ett kännetecken för åldrande. Atomkraftsmikroskopi (AFM) är ett mångsidigt analysverktyg för att karakterisera viskoelastiska mekaniska egenskaper för en mängd olika material, från hård (plast, glas, metall, etc.) ytor till celler på alla underlag. Det har i stor utsträckning används för att mäta styvheten hos celler, men mindre ofta används för att mäta styvheten hos artärer. I denna uppsats kommer vi att beskriva hur man använder AFM i kontakt läge för att mäta ex vivo elasticitetsmodul av obelastade mus artärer. Vi beskriver vårt förfarande för isolering av mus artärer, och sedan ge detaljerad information för AFM analys. Detta inkluderar steg-för-steg-instruktioner för inriktning av laserstrålen, kalibrering av fjäderkonstanten och böjning känslighet AFM sonden, och förvärvet av kraftkurvor. Vi tillhandahåller också ett detaljerat protokoll för data analysis av kraftkurvorna.
Protocol
Djur arbete i denna studie godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittéer University of Pennsylvania. Metoderna utfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.
1. Förbered musen och isolering av aorta
- Söva en mus med ketamin (80 till 100 mg / kg), xylazin (8-10 mg / kg) och acepromazin (1 - 2 mg / kg) intraperitonealt. Bekräfta anestesi med en svans nypa test. När musen är helt bedövad, avliva musen genom cervikal dislokation.
- Placera musen på rygg och stift musen till en dissektion kortet. Rengör buken området med 70% (volym / volym) etanol våtservetter.
- Nyp huden vid mittlinjen och göra en liten initial snitt med medelstora mikrokirurgi sax på buken. Håll huden med pincett, använder medelstora mikrokirurgi sax för att skära in i huden och bukhinnan från buken till bröstbenet.
- Skär bort revbenen på both sidor med medelstora mikrokirurgi sax. Försiktigt bort lungor och lever med små och medelstora mikrokirurgi sax och lämna hjärtat och aorta. Överför musen och dissektion styrelsen att ett dissektionsmikroskop.
- Ta tag i fett som omger aortan med små pincett och använda en liten sax för att försiktigt skära bort fettet runt aorta.
- ta försiktigt aorta med pincett, gör ett snitt med små och medelstora mikrokirurgi sax i början av den uppåtgående aorta och annan snitt i slutet av den nedåtgående aorta, strax ovanför bukaortan.
- Överföra dissekerade aortan till en 60-mm skål innehållande 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS; utan kalcium och magnesium).
- Fortsätt att dissekera bort eventuella kvarvarande fettvävnad från aorta med hjälp av små och medelstora mikrokirurgi sax. Använd en liten sax för att öppna aorta i längdled.
- Använder små mikrokirurgi sax för att klippa en liten bit (~ 2 x 4 mm) för den nedåtgående aorta och aortic båge för AFM-analys (Figur 1). Placera vävnaden i en 60-mm plastskål och hålla den fuktig i en droppe PBS.
Figur 1:. En bild som visar platsen för de olika Aorta segment i en mus Aortan isolerades från hjärtat till membranet, och en liten del av den nedåtgående aorta och aortabågen användes för att bestämma de elastiska moduler. Skala bar, en mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. förbereda vävnadsprover för AFM Mätningar
- Försiktigt bort PBS med hjälp av en labb torka utan att vidröra aorta. Var säker på att den luminala sidan av vävnaden är vänd uppåt.
- Försiktigt limma varje ände av den öppnade aorta till plattan genom add ing 5 - 10 | il av cyanoakrylat-adhesiv med en gel-laddning spets (Figur 2).
OBS: Den mängd lim behövs för att stadigt fästa vävnaden vid varje ände måste bestämmas empiriskt. Det är viktigt att aorta inte sträcks under denna process. - Kontrollera limmade aorta att försäkra sig om att det inte är vikt eller flytande. Efter lufttorkning av lim på stora kroppspulsådern (30-60 sek), försiktigt lägga PBS och dränka provet.
OBS: Förberedelser AFM (steg 3-5) kan utföras medan vävnaden förbereds för analys.
Figur 2: tecknad av en aorta Segment limmas på ett 60-mm odlingsskål med användning Cyanoakrylatlim Den cyanoakrylatlim appliceras på kanten av en aorta prov som förberedelse för AFM-mätningar..com / filer / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Ladda Probe
- Montera en vätske sond hållare på sonden last montern.
- Med hjälp av pincett, skjut en kiselnitrid AFM sond (0,06 N / m fribärande) med en sfärisk spets (vi har använt en 1-um diameter SiO 2 partikel men större storlekar kan också användas) på sondhållaren. Se till att AFM sonden stadigt fäst vid sondhållaren.
- Skjut sondhållaren på Z-scanner montera av AFM huvudet, och se till att sondhållaren sitter fast ordentligt.
4. Rikta lasern på Probe
- Öppna AFM programvara. Välj experimentet typen på programvara, Experiment Kategori att Kontakta läget Experiment koncernen Kontakta läge i vätska och experiment att Kontakta läge i vätska. Klicka Load experiment i programmet; detta kommer att slå på lasern.
- Tillsätt 3 ml destillerat vatten till en 50-mm glas nedre skålen och placera skålen på scenen av laserinriktningsenheten. Denna enhet förenklar processen att fokusera laserstrålen på baksidan av konsolen.
- Montera AFM huvudet i upprätt läge på laserinriktningsenheten och slå på laserinriktningsenheten. Tillsätt ca 50 | j, l destillerat vatten för att bilda en droppe på AFM spets.
- Med styrspaken, sänk AFM huvudet så AFM spets kommer i kontakt med vatten i skålen. Om kontakten inte sker mellan AFM spets och vatten i skålen, försiktigt lyfta skålen tills kontakt görs. Justera fokus, ljusstyrka och XY läge så AFM spets är med tanke på LCD-skärmen av inriktningsenheten.
- Positionera laserpunkten på spetsen av AFM sonden genom att justera laserpositionerings knoppar från AFM huvudet. Använda detektor positionering vreden på AFM huvudet, justera position hos fotodioden tills värden mellan 0 och -1 V erhålles för den vertikala avböjningen och ~ 0 V erhålls för den horisontella avböjningen.
- Kontrollera för att säkerställa att lasersummasignalen är maximerad. Vid behov, upprepa steg 4,5 att åter justera läget för laserstrålen på AFM spets och positionen för fotodioden för att erhålla den maximala summasignalen.
OBS: Det kan vara nödvändigt att flytta AFM sonden på sondhållaren för att få en maximal summasignal även om steg 4,5 upprepas.
5. Kalibrera Nedböjning känslighet och fjäderkonstant AFM Probe
- Gör en repa på en 60-mm odlingsskål med en forcep och fyll skålen med destillerat vatten. Placera kulturen skålen på provhållaren plattan. I det här fallet, montera skålen på motoriserade XY skanning skede av ett inverterat mikroskop.
- Placera en magnetisk hållare ovanpå plattan för att hålla det säkert under avbildning.
- Klick
- Placera AFM huvudet på mikroskop scenen.
- Använda mikroskop för att fokusera på repan på plattan. Använd joystick, eller klicka på "Down" pil i navigationsmenyn, långsamt och försiktigt sänka AFM sonden i PBS. Positionera huvudet något över repan i plattan.
OBS: Om den initiala positionen av AFM huvudet är närmare till provet, ingreppstiden kommer att minska avsevärt. - Innan engagerande, re-justera läget för laserstrålen på AFM spets och positionen för fotodioden för att erhålla den maximala SUM-signalen som behövs.
- Välj ett tips genom att klicka Ändra Probe i inställningsmenyn. Klicka på Kontrollera parametrar och ställa in parametrarna: Scan storlek till 0, Scan Rate till 1 Hz, prov / linje till 256 och Deflection Börvärde till 20 nm. Klicka Engage. Den Engage Status fönstret förblir öppen tills sonden kommer i kontakt med plattans yta. Efter ingrepp med sonden, klicka ramp.
- Klicka Expanderat läge i Scan verktygsfältet menyn och ställa in parametrarna: Ramp storlek till mellan 500 nm och 1 pm, ramphastighet till 2 Hz, antal prover som 256, spetsradie till 500 nm, prov Poissons tal till 0,5 (antar materialet som skall mätas är helt inkompressibelt), Tips halvvinkel till 0, Trigger Mode relativ och Trigger Threshold till mellan 20 och 100 nm.
- Klicka Ramp Kontinuerlig i ramp verktygsfältet menyn obtai en kraftkurva på plattan (Figur 3A). I denna kraftkurva, ställ kanal 1 till böjning fel.
OBS: Detta gör det möjligt för programmet att visa resultatet grafiskt vertikal nedböjning vs z ställning.- Klicka på vänster eller höger ändarna av kraftkurvan och dra markören till att omfatta ett linjärt område av kraftkurvan (Figur 3A, streckade röda linjer). Använda dessa två linjer för att markera gränserna för den sluttande regionen för att vara i form med en rak linje.
- Välj Ramp i verktygsfältet och klicka på Uppdatera känslighet. Anteckna värdet och upprepa detta steg fyra gånger. Välj Kalibrera i verktygsfältet och klicka sedan på Detector. Ingång ett medelvärde från de fem mätningar i Nedböjning Känslighet rutan.
- Klicka på Uttag 2 - 3 gånger för att höja AFM huvudet. Detta steg är viktigt för att förhindraväxelverkan mellan AFM spets och plattan under den termiska tune processen. Klicka Termisk Tune i verktygsfältet.
- Ställ Termisk Tune Område 1-100 kHz (Denna information kan erhållas från tillverkarens katalog) och Nedböjning Känslighet Korrigering till 1,144 för v-formade konsoler och 1.106 för rektangulära konsoler.
- I Thermal Tune menyn, klicka på Hämta data för att erhålla en värme melodi kurva (Figur 3B). Med hjälp av AFM programvara, plats röda streckade linjer på vardera sidan av kurvan (som visas i figur 3B) genom att dra musen i från kanten av diagrammet för att definiera gränserna för montering. Välj antingen Lorentz (Air) eller enkel harmonisk oscillator (Fluid) modell beroende på vilken bättre passar data.
- Klicka på Fit Data, sedan Beräkna Spring K och spara detta värde. Retorv fjäderkonstanten kalibreringar flera gånger och använda det genomsnittliga värdet. Klicka på Uttag flera gånger.
- Ta bort AFM huvudet från mikroskop scenen och placera den på inriktningsenheten. Ta skålen från mikroskop scenen.
Figur 3: AFM Force Kurvor som används i kalibreringen av AFM sonder. (A) En representant AFM kraftkurva (en kalibreringskurva). Förlängningen delen av kraftkurvan mellan den vertikala röda streckade linjer användes för att bestämma den fribärande deformationen känslighet. (B) En enkel harmonisk oscillator fit graf som används för att beräkna fjäderkonstanten av konsolen som tidigare beskrivits 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ex Vivo
- Placera 60-mm odlingsskål innehållande aortavävnaden på mikroskop scenen och säkra plattan med magnet hållare.
- Placera AFM huvudet på mikroskop scenen. Se till att AFM sonden inte gör kontakt med aortan men försiktigt i kontakt med PBS och bildar en menisk. Om det är nödvändigt, placera AFM huvudet på inriktningsenheten och klicka på Uttag tills det finns tillräckligt med utrymme för att förhindra kontakt sedan placera AFM huvudet på mikroskop scenen.
- Klicka Navigera. Med styrspaken eller klicka på "Down" pil, sakta sänka AFM sonden att lokalisera fribärande ovanför aorta. Justera fotodiod position med detektor positionering vreden på AFM huvudet om det behövs.
- Klicka på Engage för att tillåta den fribärande att få kontakt med aortan.
- Näraorta är inkopplad, se till att piezo centrum är stabil och klicka ramp. Om piezo centrum fluktuerar, kan detta vara ett resultat av ett falskt ingrepp. Dra ut sonden och öka den vertikala förskjutningen av lasern på fotodioden med små ökningar (~ 0,5 V) och återuppta.
- Även om sonden är långt över provytan, sänka manuellt sonden närmare provytan innan de engagerande. Om de tidigare stegen inte eliminera fluktuationer, försöka byta ut sonden.
- Ställ in ramp storlek till 3 pm, den Trigger Mode relativ och Trigger Threshold till 100 nm och klicka Ramp Kontinuerlig. Observera att kontaktpunkten mellan sonden och provet inträffar vid ungefär centrum till den nedre ¾ av Z rampcykel. Om detta inte följs, koppla från provet, justera ramp storlek som behövs, och återuppta provet.
- Klicka Mikroskop i menyraden och sedan Engage inställningar. Ändra SPM Överföring till 30 pm. Klicka Ramp Kontinuerlig i ramp Toolbar menyn.
- Efter att ha observerat den kraftkurva, klicka Capture i menyraden och sedan Capture Filnamn. Ange önskat filnamn med ändelsen "0,000" (detta kommer att möjliggöra ytterligare inspelade filer att öka i antal med en). Välj en utsedd mapp och spara data.
- Klicka på Capture i menyn Inspelningsverktyg. Klicka på Uttag och sedan navigera. Använd joysticken eller mjukvara kontroller för att positionera den fribärande över ett annat område av aortan (bredvid den initialt uppmätta punkten, se figur 4).
- Klicka Engage, Ramp och Ramp Kontinuerlig, respektive. Efter att ha observerat den kraftkurva, klicka på Stoppa Capture.
- Upprepa steg från 6,9 till 6,10. Fånga minst 5 mätningar per område som visas i Figur 4 OBS: Vi samlar typiskt 15 - 25 kraftkurvor från 3 - 5 olika platser i varje vävnad som visas i figur 4, respektive..
. Figur 4: Tecknad film av en Gren Närmar och indrag Tissue (område 1) Denna AFM mätning upprepas upp till 15 - 25 gånger från 3 - 5 olika platser (områden 1 - 5) i varje artär att förvärva styvhet av den totala vävnadsprov. klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. Data Analysis
- Öppna kraftkurva analysprogram.
- click Hitta och Öppna i menyraden, och dubbelklicka på en fil som ska analyseras.
- Klicka på Ändra Force parametrar i verktygsfältet för att kontrollera deformationen känslighet, fjäderkonstant, spetsradie, Tip halvvinkel och tvärkontraktionstal. För att ändra parametrar markera rutan bredvid den och ange korrekta värden i det nya värdet kolumnen. Klicka sedan på Kör.
- Om kraftkurvor är bullriga, klicka Boxcar Filter och ange ingångar för Direction att förlänga, Genomsnitt Punkter till 3 och filterordning till 0: e. Klicka Execute att jämna ut data.
- Klicka Baslinjejustering i menyraden och ange ingångar för Riktning att förlänga, tomt enheter till Force, Type till Separation, Korrigering för att 1: a och Extend Baseline Source Kör.
- Klicka Indrag i verktygsfältet och ange ingångar för Active Curve Extended, Fit metod att kontakta Point baserat, Contact Point algoritm för att behandla som Fit variabel, Inkludera adhesionskraft till Nej, Max Force Fit Boundary till 30%, Min Force Fit Boundary till 0% och Passformen modellerar till Hertz (sfärisk).
OBS: I våra mätningar har det gjorts betydande vidhäftning mellan spetsen och provet (en negativ avböjning av konsolen i indragningskurva) sällan observeras. I de fall där sådan vidhäftning observeras, bör lämplig modell (DMT eller JKR) användas för analys 18,19. - Spara värden för Youngs modul. Analysera Youngs (elastisk) modul av var och en av de tre- 5 områden (5 kraftkurvor per område) fattas inom ett litet avstånd från varandra, såsom visas i figur 4.
OBS: För att ta bort artefakter utesluta Youngs moduler> 100 kPa (normalt ~ 10% av den totala mätningar) från analysen. - Beräkna ett medelvärde Youngs modulvärde för var och en av de 3 - 5 områden (som mätts) och använder dessa värden för att beräkna en medelelasticitetsmodul för aortan som helhet.
OBS: Minst tre och oftare 4 - 6 enskilda artärer används för att få en korrekt bedömning av artärstelhet. De slutliga resultaten är inprickade som medelvärde + SEM av "n" oberoende experiment. Det exakta antalet aortan behövs kommer naturligtvis att bero på graden av noggrannhet som krävs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5A visar en fas kontrast bild av fallande (bröst) aorta från en 6-månader gammal, manlig C57BL / 6-mus. AFM fribärande är på plats direkt ovanför vävnaden och redo för indrag. Figurerna 5B och 5C visar representativa kraftkurvor som erhållits genom AFM fördjupning i kontakt läge. Gröna linjer visas i figurerna 5B och 5C representerar de bästa passningskurvor som erhållits med hjälp av Hertz-modell för en sfär. I figur 5D, var den genomsnittliga styvheten hos fallande artärer och aorta valv bestämdes från tre individuella möss som beskrivs i texten. Notera att den nedåtgående aorta och aortabågen representerar regioner av laminär och störd flöde, respektive. Ändå deras (mekaniskt obelastad) elastiska moduler är lika som bestäms av AFM.
0 / 54630fig5.jpg "/>
Figur 5: den analyserade Force-indrag Kurvor och styvhet Data (A) faskontrast mikrofotografi som visar en AFM fribärande över en mus fallande aorta ex vivo.. Skalstock, 100 | j, m. (BC) En uppsättning av två representativa kraft indrag kurvor som förvärvats för (B) den neråtgående aortan och (C) aortabågen. (D) Medelvärde styvhet av musen nedåtgående aorta och aortabågen bestämdes som beskrivits ovan. Felstaplar visar medelvärdet + SEM; n = 3 oberoende biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM indrag kan användas för att karakterisera styvhet (elasticitetsmodul) av celler och vävnader. I detta papper, vi ger detaljerade steg-för-steg-protokoll för att isolera den nedåt aorta och aortabågen i musen och bestämmer elasticitetsmodul av dessa arteriella regioner ex vivo. Vi sammanfattar nu och diskutera tekniska problem och begränsningar av den metod som beskrivs i detta dokument.
Flera tekniska problem kan uppstå i isolering och analys av mus aorta med tanke på deras små och tunna natur. När de rengjorda artärer öppnas i längdriktningen, måste man vara försiktig att inte störa intima (luminala yta) där elasticitetsmodulen data samlas in. Överskott PBS i det slutliga provet skålen förhindrar korrekt limning av artärerna på skålen, och detta måste tas bort försiktigt med en pappersnäsduk utan att vidröra artären före limning. Observera dock att den isolerade artären kan hålla sig till tissuepappers while försöker ta bort överdriven PBS, och detta kan skada provet. Medan limning artärerna till odlingsskålen, är det extremt viktigt att artären inte är sträckt och att endast en liten mängd av lim anbringas bit-för-bit i varje ände av artären. När du utför AFM-indrag, är det viktigt att undvika att sondera vid ändarna av artären där limmet har applicerats. Slutligen eftersom nyisolerade artärer används för mätning av elasticitetsmodul, förfluten tid från skörd till mätning bör minimeras.
Eftersom de sfäriska tips som används i denna studie har en radie på 500 nm, kan en inbuktning djup på upp till 500 nm vara noggrant analyseras med hjälp av Hertz-modellen. Detta indrag djup skulle korrelera med det översta lagret av endotelceller som finns i intiman 21. Att undersöka mekaniken av under endotel lager av artärprover, större kolloidala sonder (10 - 20 nm i diameter) kan användasför indrag och förändringar i den beräknade styvheten med indrag djup kunde bestämmas 22,23. Eftersom biologiska prover är vanligtvis viskoelastiska snarare än rent elastisk mätningar spänningsrelaxation (övervakar förfall inom tillämpad kraft vid en konstant indrag djup) kan användas för att bestämma den viskösa komponenten av arteriella mekaniska egenskaper 24,25.
En potentiell begränsning av AFM analys är skanningsstorlek, som endast mäter en liten region av vävnaden. De flesta biologiska prover, inklusive artärer och celler, är inte topografiskt och biomekaniskt homogen, och denna heterogenitet kan potentiellt resultera i artifactually stora variationer av elasticitetsmodulen beroende på jämnheten hos intrycknstället, indrag djup, och mängden kraft som anbringas på provet yta. För att erhålla ett representativt medelvärde av den totala elasticitetsmodulen, är det viktigt att utföra upprepad AFM-indrag ent multipla slumpmässiga platser genom artärerna, såsom visas i figur 4. Vidare använder vi en lämpligt stora sfärisk spets, som tidigare studier har visat att AFM-indrag med en vass pyramidformig spets resulterade i högre uppskattningar av elasticitetsmodulen och skadad mjuk biologiska prover 26,27.
Även om våra ex vivo AFM mätningar av artärstelhet verkar överens väl med molekylära markörer för glatta muskelceller hårdnande 2, är det viktigt att inse att dessa arteriella prover inte mekaniskt är laddade, och mekanisk belastning är sannolikt att spela en viktig roll i den övergripande arteriella mekanik. Jämförelser av artärstelhet som bestäms av AFM, myography (ett ex vivo-förfarande är förenligt med mekanisk belastning) 28 och puls-våg hastighet (en in vivo mätning av artärstelhet) 29 kommer sannolikt att ge den mest omfattande förståelse av Arterial mekanik.
Vi har beskrivit AFM i kontakt läge för att mäta ex vivo styvhet av mus artärer. Denna metod uppskattar den genomsnittliga vävnadsstyvheten genom att slumpmässigt indraget på flera områden i aorta. För att undersöka den geografiska fördelningen av styvhet från större regioner av vävnader, har en nyligen papper som används AFM gällande volymläget 30. Detta tillvägagångssätt erhålls samtidigt en karta över stelhet variationer och en högupplöst bild av topografisk yta av vävnaden. Förutom att mäta styvheten av vävnadsprover, kan AFM gällande volymläget användas i celler för att övervaka de rumsliga fördelningar av intracellulär stelhet 10,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioScope Catalyst AFM system | Bruker | ||
| Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Silicon nitride AFM probe | Novascan Technologies | PT.SI02.SN.1 | 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | See section 1.4 |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | See section 1.8 |
| Fine Scissors-ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | See section 1.4 (medium sized) |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | See section 1.6 (small sized) |
| 60 mm TC-treated cell culture dish | Corning | 353004 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x | Corning | 21-031-CM | Without calcium and magnesium |
| Krazy Glue instant all purpose liquid | Krazy Glue | KG58548R | See section 2.2 |
| Gel-loading tips, 1 - 200 µl | Fisher | 02-707-139 | See section 2.2 |
| Tip Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78092-CP | See section 3.2 |
| 50-mm, clear wall glass bottom dishes | TED PELLA | 14027-20 | See section 4.4 |
References
- Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
- Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189 (2015).
- Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
- Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
- Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585 (2011).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
- Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
- Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
- Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57 (2014).
- Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
- Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122 (2011).
- Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
- Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
- Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974 (2015).
- Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
- Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P.
- Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
- Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
- Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
- Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
- Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. , e3733 (2012).
- Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
- Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
- Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).
