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Biology

मापने की कठोरता Published: October 19, 2016 doi: 10.3791/54630
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 3, 1,2
1Program in Translational Biomechanics, Institute of Translational Medicine and Therapeutics, University of Pennsylvania, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 3Department of Physiology, University of Pennsylvania

Abstract

धमनी stiffening एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक और हृदय रोग के लिए बायोमार्कर और उम्र बढ़ने की एक बानगी है। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) हार्ड (प्लास्टिक, कांच, धातु, आदि) किसी भी सब्सट्रेट पर कोशिकाओं को सतहों से लेकर सामग्री की एक किस्म के लिए viscoelastic यांत्रिक गुणों निस्र्पक के लिए एक बहुमुखी विश्लेषणात्मक उपकरण है। यह व्यापक रूप से कोशिकाओं की कठोरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन कम बार aortas की कठोरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया। इस पत्र में, हम संपर्क मोड में AFM का उपयोग करते हुए पूर्व vivo उतार माउस धमनियों की लोचदार मापांक को मापने के लिए के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करेंगे। हम माउस aortas के अलगाव के लिए हमारे प्रक्रिया का वर्णन है, और फिर AFM विश्लेषण के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं। इस लेजर बीम के संरेखण, वसंत निरंतर और AFM जांच के विक्षेपन संवेदनशीलता की जांच, और बल घटता के अधिग्रहण के लिए कदम-दर-कदम निर्देश शामिल हैं। हम यह भी डेटा analy के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंबल घटता की बहन।

Protocol

इस अध्ययन में पशु काम पेनसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। तरीकों अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया।

1. माउस और महाधमनी के अलगाव तैयारी

  1. (- 100 मिलीग्राम / किग्रा 80), xylazine (8 - 10 मिलीग्राम / किग्रा) और acepromazine (1 - 2 मिलीग्राम / किग्रा) intraperitoneally ketamine के साथ एक माउस anesthetize। एक पूंछ चुटकी परीक्षण के साथ संज्ञाहरण की पुष्टि करें। एक बार माउस पूरी तरह से anesthetized है, ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize।
  2. अपनी पीठ पर माउस प्लेस और एक विच्छेदन बोर्ड करने के लिए माउस पिन। साफ 70% के साथ पेट क्षेत्र (v / v) इथेनॉल पोंछे।
  3. मध्य रेखा पर त्वचा चुटकी और पेट पर मध्यम आकार के microsurgery कैंची के साथ एक छोटे प्रारंभिक चीरा बनाते हैं। संदंश के साथ त्वचा पकड़े, उरोस्थि को पेट से त्वचा और पेरिटोनियम कटौती करने के लिए मध्यम आकार के microsurgery कैंची का उपयोग करें।
  4. दूर कट ख पर पसलियोंमध्यम आकार के microsurgery कैंची के साथ अन्य संगठनों के पक्षों। ध्यान से छोटे आकार microsurgery कैंची से फेफड़े और यकृत को हटाने, और दिल और महाधमनी छोड़ दें। एक विदारक माइक्रोस्कोप के लिए माउस और विच्छेदन बोर्ड स्थानांतरण।
  5. छोटे संदंश के साथ महाधमनी आसपास वसा समझ और छोटे कैंची का उपयोग सावधानी से महाधमनी के आसपास चर्बी दूर कटौती करने के लिए।
  6. धीरे, संदंश के साथ महाधमनी हड़पने सिर्फ उदर महाधमनी ऊपर आरोही महाधमनी और उतरते महाधमनी के अंत में एक और कटौती की शुरुआत में छोटे आकार के microsurgery कैंची के साथ एक कट, बनाते हैं।
  7. एक 60 मिमी 1x फॉस्फेट बफर खारा युक्त डिश के लिए विच्छेदित महाधमनी स्थानांतरण (पीबीएस, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना)।
  8. महाधमनी छोटे आकार microsurgery कैंची का उपयोग करने से किसी भी शेष वसा ऊतकों को दूर टुकड़े करना जारी रखें। longitudinally महाधमनी को खोलने के लिए छोटे कैंची का प्रयोग करें।
  9. उतरते महाधमनी और aorti का एक छोटा सा टुकड़ा (~ 2 x 4 मिमी) में कटौती करने के लिए छोटे आकार microsurgery कैंची का प्रयोग करेंAFM के विश्लेषण के लिए सी चाप (चित्रा 1)। एक 60 मिमी प्लास्टिक पकवान में ऊतक की जगह और पीबीएस की एक बूंद में यह नम रखने के लिए।

आकृति 1
चित्रा 1:। एक छवि एक माउस में विभिन्न खंडों महाधमनी के स्थान दिखा महाधमनी डायाफ्राम के लिए दिल से पृथक किया गया है, और उतरते महाधमनी के एक छोटे से हिस्से और महाधमनी चाप लोचदार moduli निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। स्केल बार, 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

AFM माप के लिए 2. तैयारी ऊतक के नमूने

  1. ध्यान से महाधमनी को छूने के बिना एक प्रयोगशाला-पोंछे का उपयोग पीबीएस को हटा दें। निश्चित है कि ऊतक के ल्यूमिनल पक्ष का सामना करना पड़ रहा है हो सकता है।
  2. धीरे ऐड से थाली करने के लिए खोला महाधमनी के प्रत्येक के अंत गोंद 5 आईएनजी - एक जेल लोडिंग टिप के साथ cyanoacrylate चिपकने के 10 μl (चित्रा 2)।
    नोट: गोंद की राशि मजबूती से प्रत्येक के अंत में ऊतक संलग्न करने की जरूरत अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि महाधमनी इस प्रक्रिया के दौरान बढ़ाकर नहीं है।
  3. निश्चित है कि यह मुड़ा हुआ या अस्थायी नहीं है चिपके महाधमनी की जाँच करें। महाधमनी पर गोंद हवा सुखाने के बाद (30 - 60 सेकंड), धीरे पीबीएस जोड़ने और नमूना डूब।
    नोट: तैयारी AFM (चरण 3 - 5) से बाहर किया जा सकता है, जबकि ऊतक विश्लेषण के लिए तैयार किया जा रहा है।

चित्र 2
चित्रा 2: एक महाधमनी खंड के कार्टून एक 60 मिमी संस्कृति cyanoacrylate चिपकने वाला का उपयोग पकवान पर चिपके cyanoacrylate चिपकने वाला AFM माप के लिए तैयार करने में एक महाधमनी नमूने के किनारे करने के लिए लागू किया जा रहा है।।com / फ़ाइलें / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. जांच लोड हो रहा है

  1. जांच लोड स्टैंड पर एक तरल पदार्थ जांच धारक माउंट।
  2. चिमटी का प्रयोग, एक गोलाकार टिप के साथ एक सिलिकॉन नाइट्राइड AFM जांच (0.06 एन / मीटर ब्रैकट) स्लाइड जांच धारक पर (हम एक 1 माइक्रोन व्यास 2 Sio कण का इस्तेमाल किया है, लेकिन बड़े आकार के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है)। सुनिश्चित करें कि AFM जांच मजबूती से जांच धारक के लिए सुरक्षित है सुनिश्चित करें।
  3. जेड-स्कैनर पर जांच धारक स्लाइड AFM सिर के माउंट, और सुनिश्चित करें कि जांच धारक सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है।

4. जांच पर लेजर संरेखित

  1. AFM सॉफ्टवेयर खोलें। सॉफ्टवेयर पर प्रयोग प्रकार चुनें; मोड, प्रयोग समूह से संपर्क करने के लिए प्रयोग श्रेणी तरल पदार्थ और प्रयोग में मोड संपर्क करने के लिए तरल पदार्थ में मोड से संपर्क करें। लोड ऍक्स्प क्लिक करेंसॉफ्टवेयर में eriment; इस लेजर पर बंद हो जाएगा।
  2. एक 50 मिमी गिलास नीचे डिश के लिए आसुत जल के 3 मिलीलीटर जोड़ें और लेजर संरेखण इकाई के मंच पर पकवान जगह है। इस इकाई ब्रैकट की पीठ पर लेजर बीम ध्यान केंद्रित करने की प्रक्रिया सरल करता है।
  3. लेजर संरेखण इकाई पर लेजर संरेखण इकाई और बिजली पर एक ईमानदार स्थिति में AFM सिर माउंट। आसुत जल के लगभग 50 μl AFM नोक पर एक छोटी बूंद के लिए फार्म जोड़ें।
  4. जॉयस्टिक का उपयोग कर, AFM सिर को कम इतनी AFM टिप डिश में पानी के साथ संपर्क में आता है। संपर्क AFM टिप और डिश में पानी के बीच नहीं किया जाता है, तो धीरे पकवान जुटाने तक संपर्क किया जाता है। फोकस, चमक और XY स्थिति को समायोजित करें, ताकि AFM टिप संरेखण इकाई की एलसीडी स्क्रीन पर देखने में है।
  5. AFM सिर के लेजर पोजीशनिंग knobs का समायोजन करके AFM जांच की नोक पर लेजर मौके की स्थिति। AFM सिर पर डिटेक्टर स्थिति knobs का उपयोग, मंज़ूर समायोजित0 और -1 वी के बीच तक मूल्यों photodiode के आयन खड़ी विक्षेपन के लिए प्राप्त कर रहे हैं और ~ 0 वी क्षैतिज विक्षेपन के लिए प्राप्त की है।
  6. यह सुनिश्चित करने के लिए लेजर राशि संकेत अधिकतम है की जाँच करें। यदि आवश्यक हो, दोहराएँ कदम 4.5 AFM नोक पर लेजर बीम और photodiode की स्थिति को अधिकतम राशि संकेत प्राप्त करने के लिए की स्थिति को फिर से समायोजित करने के लिए।
    नोट: यह जांच धारक पर AFM जांच का स्थान बदलने के लिए एक अधिकतम राशि संकेत भले ही 4.5 कदम दोहराया है प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

5. AFM जांच के विक्षेपन संवेदनशीलता और लगातार वसंत औजार

  1. एक forcep के साथ एक 60 मिमी संस्कृति डिश पर एक खरोंच बनाओ और आसुत जल के साथ पकवान भरें। नमूना धारक थाली पर संस्कृति डिश रखें। इस मामले में, एक औंधा माइक्रोस्कोप की मोटर चालित XY मंच स्कैन पर पकवान माउंट।
  2. थाली के शीर्ष पर एक चुंबकीय थाली धारक की जगह यह इमेजिंग के दौरान सुरक्षित रखने के लिए।
  3. क्लिक करें नोट: यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि यह AFM टिप तोड़ने से बचा जाता है।
  4. खुर्दबीन मंच पर AFM सिर रखें।
  5. माइक्रोस्कोप का उपयोग थाली पर खरोंच पर ध्यान केंद्रित करने के लिए। जॉयस्टिक का प्रयोग करें, या नेविगेशन मेनू में 'नीचे' तीर क्लिक करें, धीरे धीरे और सावधानी से पीबीएस में AFM जांच कम करने के लिए। थोड़ा थाली में खरोंच के ऊपर सिर स्थिति।
    नोट: AFM सिर की प्रारंभिक स्थिति नमूना के करीब है, तो समय संलग्न काफी कम हो जाएगा।
  6. मुठभेड़ से पहले, AFM नोक पर लेजर बीम और photodiode की स्थिति को अधिकतम राशि संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में की स्थिति को फिर से समायोजित।
  7. सेटअप मेनू में जांच बदलें पर क्लिक करके एक टिप प्रकार का चयन करें। मापदंडों की जांच और मानकों सेट पर क्लिक करें: 256 के लिए 1 हर्ट्ज, नमूना / लाइन के लिए 0 करने के लिए आकार के लिए स्कैन, दर स्कैन और विक्षेपन Setpoint 20 एनएम के लिए। व्यस्त हैं पर क्लिक करें। जब तक जांच की थाली की सतह के साथ संपर्क में आता है संलग्न स्थिति खिड़की खुला रहेगा। जांच से मुठभेड़ के बाद, रैंप पर क्लिक करें।
  8. स्कैन टूलबार मेनू में मोड विस्तार किया है और मानकों सेट पर क्लिक करें: 2 हर्ट्ज के लिए रैंप का आकार एनएम और 1 माइक्रोन, 500 के बीच रैंप दर से, 256 नमूनों की संख्या, टिप त्रिज्या 500 एनएम के लिए, 0.5 (के लिए नमूना पॉसों के अनुपात मानता सामग्री मापा जा करने के लिए 20 और 100 के बीच एनएम के सापेक्ष और उत्प्रेरक दहलीज को टिप आधा कोण 0 करने के लिए, ट्रिगर मोड पूरी तरह से असंपीड्य है)।
  9. obta करने के लिए रैंप टूलबार मेनू में रैंप पर सतत क्लिक करेंप्लेट (चित्रा 3 ए) पर एक बल की अवस्था में। इस बल की अवस्था में, विक्षेपन त्रुटि के चैनल 1 निर्धारित किया है।
    नोट: यह सॉफ्टवेयर खड़ी विक्षेपन बनाम Z स्थिति के रूप में परिणाम ग्राफ के लिए अनुमति देगा।
    1. बल की अवस्था के बाईं या दाईं सिरों पर क्लिक करें और बल की अवस्था (चित्रा 3 ए, धराशायी लाल लाइनों) के एक रेखीय क्षेत्र धरना कर्सर खींचें। एक सीधी रेखा के साथ फिट होना sloped क्षेत्र की सीमाओं को चिह्नित करने के लिए इन दो लाइनों का प्रयोग करें।
  10. टूलबार में रैंप का चयन करें और अद्यतन संवेदनशीलता पर क्लिक करें। मूल्य रिकॉर्ड है और इस कदम से चार बार दोहराएँ। टूलबार में जांच का चयन करें और फिर डिटेक्टर पर क्लिक करें। इनपुट विक्षेपन संवेदनशीलता बॉक्स में पांच माप से एक औसत मूल्य।
  11. 3 गुना AFM सिर उठाना - वापस ले लें 2 क्लिक करें। इस कदम को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैAFM टिप और थर्मल धुन प्रक्रिया के दौरान प्लेट के बीच बातचीत। टूलबार में थर्मल ट्यून पर क्लिक करें।
  12. आयताकार cantilevers के लिए वी के आकार का cantilevers के लिए 1.144 और 1.106 करने के लिए 100 kHz (यह जानकारी निर्माता की सूची से प्राप्त किया जा सकता है) और नीचे को झुकाव संवेदनशीलता सुधार - 1 का थर्मल ट्यून सीमा निर्धारित करें।
  13. थर्मल ट्यून मेनू में, एक थर्मल धुन वक्र (चित्रा 3 बी) प्राप्त करने के लिए डेटा प्राप्त करें। AFM सॉफ्टवेयर का प्रयोग, जगह लाल ग्राफ के किनारे से माउस खींचने फिटिंग के लिए सीमाओं को परिभाषित करने के लिए वक्र (चित्रा 3 बी में दिखाया गया है) के दोनों तरफ लाइनों धराशायी। का चयन करें या तो Lorentzian (वायु) या जिस पर बेहतर डेटा फिट बैठता है के आधार सरल हार्मोनिक थरथरानवाला (द्रव) मॉडल।
  14. क्लिक करें फिट डेटा, तो वसंत कश्मीर की गणना और यह मान बचाने के लिए। फिर सेलगातार वसंत calibrations कई बार पीट और औसत मूल्य का उपयोग करें। कई बार वापस लेने पर क्लिक करें।
  15. खुर्दबीन मंच से AFM सिर को हटाने और संरेखण इकाई पर जगह है। खुर्दबीन मंच से पकवान निकालें।

चित्र तीन
चित्रा 3: AFM बल घटता AFM जांच की कैलिब्रेशन में प्रयुक्त। (ए) एक प्रतिनिधि AFM बल वक्र (एक अंशांकन वक्र)। खड़ी लाल सेना के बीच की अवस्था के विस्तार के हिस्से को धराशायी लाइनों ब्रैकट विक्षेपन संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। (बी) के एक सरल हार्मोनिक थरथरानवाला फिट ब्रैकट की लगातार वसंत के रूप में पहले 20 में वर्णित गणना करने के लिए इस्तेमाल किया ग्राफ। देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

पूर्व विवो पर

  1. 60 मिमी संस्कृति खुर्दबीन मंच पर महाधमनी ऊतक युक्त पकवान प्लेस, और चुंबकीय थाली धारक के साथ थाली सुरक्षित।
  2. खुर्दबीन मंच पर AFM सिर रखें। निश्चित है कि AFM जांच महाधमनी के साथ संपर्क बनाने के लिए नहीं बना है, लेकिन धीरे पीबीएस के साथ संपर्क में आता है और एक meniscus रूपों। यदि आवश्यक हो, जगह संरेखण इकाई पर AFM सिर और वापस लेने क्लिक करें जब तक वहाँ से संपर्क को रोकने के लिए, तो खुर्दबीन मंच पर AFM सिर जगह पर्याप्त निकासी है।
  3. नेविगेट क्लिक करें। जॉयस्टिक का उपयोग कर या 'नीचे' तीर क्लिक करें, धीरे-धीरे कम AFM जांच महाधमनी ऊपर ब्रैकट पता लगाने के लिए। AFM सिर पर डिटेक्टर स्थिति knobs का उपयोग यदि आवश्यक हो तो photodiode स्थिति को समायोजित करें।
  4. ब्रैकट महाधमनी के साथ संपर्क बनाने के लिए अनुमति देने के लिए व्यस्त हैं पर क्लिक करें।
  5. एक बारमहाधमनी लगी हुई है, यह सुनिश्चित करें कि पीजो केंद्र स्थिर है और रैंप पर क्लिक करें। पीजो केंद्र अस्थिर है, तो यह एक झूठी सगाई का नतीजा हो सकता है। जांच वापस लेने और छोटे वेतन वृद्धि से photodiode पर खड़ी लेजर की भरपाई में वृद्धि (~ 0.5 वी) और फिर से संलग्न हैं।
    1. इसके अलावा, अगर जांच में अब तक नमूना की सतह से ऊपर है, मैन्युअल जांच नमूना की सतह के करीब कम फिर से उलझाने से पहले। पिछले चरणों में उतार-चढ़ाव को समाप्त नहीं करते हैं, तो जांच का आदान प्रदान करने की कोशिश।
  6. 3 माइक्रोन, रिश्तेदार को ट्रिगर मोड और 100 एनएम के लिए ट्रिगर दहलीज को रैंप आकार सेट और रैंप सतत क्लिक करें। ध्यान से देखें कि जांच और नमूना के बीच संपर्क की बात Z रैंप चक्र के निचले ¾ करने के लिए लगभग केंद्र पर होता है। यदि यह नहीं मनाया जाता है, नमूना से छुड़ाना जरूरत के रूप में रैंप आकार को समायोजित, और नमूना फिर से संलग्न हैं।
  7. मेनू बार में माइक्रोस्कोप क्लिक करें और फिर सेटिंग संलग्न हैं। बदले एसपीएम 30 माइक्रोन को वापस ले लें। रैंप रैंप टूलबार मेनू में सतत क्लिक करें।
  8. बल की अवस्था देखने के बाद, मेनू पट्टी में कैद क्लिक करें और फिर फ़ाइल का नाम कब्जा। अंत ".000" (इस अतिरिक्त कब्जा कर लिया फ़ाइलें 1 से संख्या में वृद्धि करने की अनुमति देगा) के साथ एक वांछित फ़ाइल नाम दर्ज करें। एक नामित-फ़ोल्डर का चयन करें और डेटा को बचाने के।
  9. कैद टूलबार मेनू में कैद क्लिक करें। वापस ले लें और फिर नेविगेट क्लिक करें। महाधमनी का एक और क्षेत्र में ब्रैकट की स्थिति के लिए जॉयस्टिक या सॉफ्टवेयर नियंत्रण का प्रयोग करें (शुरू मापा बात करने के लिए अगले, चित्रा 4 देखें)।
  10. व्यस्त हैं, रैंप क्लिक करें, और निरंतर रैंप, क्रमशः। बल की अवस्था देखने के बाद, बंद करो क्लिक करें कब्जा।
  11. 6.10 - दोहराएँ 6.9 कदम। कैद में कम से कम 5 क्षेत्र के प्रति माप चित्र में दिखाया गया के रूप में 4 नोट: हम आम तौर पर 15 इकट्ठा - 3 से 25 बल घटता - प्रत्येक ऊतक में 5 अलग अलग स्थानों के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है, क्रमशः।।

चित्रा 4
। चित्रा 4: 5 अलग अलग स्थानों (क्षेत्रों - 1 - 5) - 25 बार 3 से प्रत्येक धमनी में समग्र की कठोरता के अधिग्रहण के लिए एक ब्रैकट आ और ऊतक Indenting (एरिया 1) के कार्टून इस AFM माप अप करने के लिए 15 दोहराया है ऊतक का नमूना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. डेटा विश्लेषण

  1. ओपन बल वक्र विश्लेषण सॉफ्टवेयर।
  2. सीएलICK का पता लगाएं और मेनू पट्टी में खोलें, और एक फाइल पर डबल क्लिक करें विश्लेषण किया जा सके।
  3. नीचे को झुकाव संवेदनशीलता, लगातार वसंत, टिप त्रिज्या, टिप आधा कोण और पॉसों के अनुपात की जांच के लिए उपकरण पट्टी मेनू में संशोधित सेना पैरामीटर पर क्लिक करें। मानकों को यह करने के लिए अगले बॉक्स की जाँच करें और नया मान स्तंभ में सही मान दर्ज बदलने के लिए। तब निष्पादित क्लिक करें।
  4. बल घटता शोर कर रहे हैं, तो मालगाड़ी फ़िल्टर क्लिक करें और आदानों की स्थापना की दिशा 0 वें करने के लिए 3 और फ़िल्टर आदेश का विस्तार करने के लिए, औसत अंक। डेटा सुचारू करने के लिए निष्पादित क्लिक करें।
  5. मेनू पट्टी में आधारभूत सुधार क्लिक करें और 1 सेंट करने के लिए दिशा विस्तार करने के लिए आदानों, सेना के लिए प्लॉट इकाइयों, जुदाई के प्रकार, सुधार क्रम निर्धारित और बढ़ाएँ आधारभूत स्रोत निष्पादित क्लिक करें।
  6. उपकरण पट्टी मेनू में खरोज क्लिक करें और विस्तारित, फ़िट विधि करने के लिए सक्रिय वक्र के लिए आदानों सेट प्वाइंट के आधार पर, संपर्क बिंदु एल्गोरिथ्म संपर्क करने के लिए के रूप में फिट चर के इलाज के लिए नहीं करने के लिए आसंजन बल, 30% करने के लिए मैक्स सेना फ़िट सीमा, मिन सेना फ़िट सीमा को शामिल करें 0% और Hertzian (गोलाकार) के लिए फिट मॉडल।
    नोट: हमारी माप में, टिप और नमूना (त्याग की अवस्था में ब्रैकट की एक नकारात्मक विक्षेपन) के बीच महत्वपूर्ण आसंजन शायद ही कभी देखा गया था। मामलों में जहां इस तरह के आसंजन मनाया जाता है, उपयुक्त मॉडल (डीएमटी या JKR) विश्लेषण 18,19 के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  7. यंग मापांक के मूल्यों को बचाने के। विश्लेषण यंग (लोचदार) 3 में से प्रत्येक के मापांक- 5 क्षेत्रों (क्षेत्र के प्रति 5 बल घटता) के रूप में 4 चित्र में दिखाया एक-दूसरे की एक छोटी दूरी के भीतर ले लिया।
    नोट:, कलाकृतियों को दूर करने के लिए युवा के moduli> 100 किलो पास्कल को बाहर (सामान्य रूप से ~ कुल माप का 10%) विश्लेषण से।
  8. 3 में से प्रत्येक के लिए एक मतलब यंग मापांक मूल्य की गणना - 5 क्षेत्रों (कि मापा गया है) और एक पूरे के रूप में महाधमनी के लिए एक मतलब लोचदार मापांक गणना करने के लिए इन मूल्यों का उपयोग करें।
    नोट: कम से कम 3 और अधिक बार 4 - 6 व्यक्ति aortas धमनी कठोरता का सही आकलन प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। अंतिम परिणाम मतलब + "एन" स्वतंत्र प्रयोगों के SEM के रूप में प्लॉट किए जाते हैं। जरूरत aortas की सही संख्या, ज़ाहिर है, आवश्यक सटीकता के स्तर पर निर्भर करेगा।

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Representative Results

चित्रा 5 ए 6 महीने पुराने, पुरुष C57BL / 6 माउस से उतरते (वक्ष) महाधमनी के एक चरण विपरीत छवि को दर्शाता है। AFM ब्रैकट सीधे ऊतक ऊपर जगह में है और खरोज के लिए तैयार है। आंकड़े 5 ब और 5C संपर्क मोड में AFM खरोज द्वारा प्राप्त प्रतिनिधि बल घटता प्रदर्शित करता है। आंकड़े 5 ब और 5C में दिखाया गया ग्रीन लाइनों सबसे अच्छा फिट घटता एक क्षेत्र के लिए Hertzian मॉडल का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 5 डी में उतरते aortas और महाधमनी मेहराब का मतलब कठोरता पाठ में वर्णित के रूप में तीन अलग-अलग चूहों से निर्धारित किया गया है। ध्यान दें कि उतरते महाधमनी और महाधमनी चाप लामिना और परेशान प्रवाह के क्षेत्रों में क्रमश: प्रतिनिधित्व करते हैं। फिर भी, उनके (यंत्रवत् उतार) लोचदार moduli समान रूप AFM द्वारा निर्धारित कर रहे हैं।

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चित्रा 5: विश्लेषण बल खरोज घटता और कठोरता डेटा (एक) चरण विपरीत एक माउस उतरते महाधमनी पूर्व vivo के ऊपर एक AFM ब्रैकट दिखा माइक्रोग्राफ।। स्केल पट्टी, 100 माइक्रोन। (BC) के दो प्रतिनिधि बल खरोज (बी) के उतरते महाधमनी और (सी) महाधमनी चाप के लिए अधिग्रहीत घटता का एक सेट। (डी) मतलब माउस उतरते महाधमनी की कठोरता और महाधमनी चाप के रूप में निर्धारित किया गया था ऊपर वर्णित। त्रुटि सलाखों मतलब + SEM दिखाने; एन = 3 स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

AFM खरोज कोशिकाओं और ऊतकों की कठोरता (लोचदार मापांक) को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस पत्र में, हम विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल उतरते महाधमनी और माउस में महाधमनी चाप को अलग-थलग करने और इन क्षेत्रों धमनी पूर्व vivo की लोचदार moduli निर्धारित करने के लिए प्रदान करते हैं। अब हम संक्षेप में और तकनीकी मुद्दों और विधि इस पत्र में वर्णित की सीमाओं पर चर्चा की।

कई तकनीकी मुद्दों अलगाव और उनके छोटे और पतले प्रकृति को देखते हुए माउस aortas के विश्लेषण में पैदा कर सकते हैं। जब साफ धमनियों longitudinally खोले जा रहे हैं, देखभाल intima (ल्यूमिनल सतह) जहां लोचदार मापांक डेटा एकत्र किया जाता है को बाधित करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। अंतिम नमूना डिश में अतिरिक्त पीबीएस पकवान पर धमनियों के समुचित gluing रोकता है, और इस gluing से पहले धमनी को छूने के बिना एक कागज ऊतक का उपयोग सावधानी से हटा दिया जाना चाहिए। ध्यान दें, तथापि, कि पृथक धमनी कागज ऊतक whi के लिए छड़ी कर सकते हैंLe अत्यधिक पीबीएस दूर करने के लिए प्रयास करते हैं, और इस नमूने को नुकसान पहुंचा सकते हैं। संस्कृति डिश के लिए धमनियों gluing है, यह बेहद जरूरी है कि धमनी फैला नहीं है और वह केवल चिपकने की एक छोटी राशि के धमनी के प्रत्येक के अंत करने के लिए लागू किया जाता है थोड़ा-से-सा। जब AFM खरोज प्रदर्शन, यह धमनी जहां चिपकने वाला लागू किया गया है के सिरों पर जांच कर से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। अन्त में, क्योंकि हौसले से पृथक धमनियों लोचदार मापांक की माप के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, समय कटाई से माप के लिए गुजरे को कम से कम किया जाना चाहिए।

चूंकि गोलाकार इस अध्ययन में इस्तेमाल सुझाव के लिए 500 एनएम के एक त्रिज्या है, अप करने के लिए 500 एनएम के एक खरोज गहराई सही हो सकता है हर्ट्ज मॉडल का उपयोग कर विश्लेषण किया। यह खरोज गहराई endothelial intima 21 में स्थित कोशिकाओं के ऊपर परत के साथ संबंध स्थापित करेंगे। इस्तेमाल किया जा सकता है - धमनी नमूने के उप-endothelial परतों के यांत्रिकी, बड़ा कोलाइडयन जांच (20 माइक्रोन व्यास में 10) की जांच के लिएखरोज और खरोज गहराई के साथ गणना की कठोरता में परिवर्तन के लिए 22,23 निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, क्योंकि आम तौर पर जैविक नमूने हैं viscoelastic बजाय विशुद्ध रूप से लोचदार, तनाव छूट माप (एक निरंतर खरोज गहराई पर लागू बल में क्षय निगरानी) धमनी यांत्रिक गुणों 24,25 के चिपचिपा घटक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

AFM विश्लेषण का एक संभावित सीमा आकार स्कैन, जो केवल ऊतक के एक छोटे से क्षेत्र को मापता है। धमनियों और कोशिकाओं सहित अधिकांश जैविक नमूने, भौगोलिक विवरण के अनुसार नहीं है और biomechanically सजातीय हैं, और इस विविधता संभावित खरोज साइट, खरोज गहराई, और बल की राशि की चिकनाई के आधार पर लोचदार मापांक के artifactually बड़े बदलाव में परिणाम कर सकते हैं नमूना के लिए आवेदन किया सतह। समग्र लोचदार मापांक के एक प्रतिनिधि मतलब मूल्य प्राप्त करने के लिए, यह दोहराया AFM खरोज एक प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण हैधमनियों के माध्यम से टी कई यादृच्छिक स्थानों, चित्रा 4 में दिखाया गया है। इसके अलावा, हम एक उचित आकार गोलाकार टिप, उपयोग के रूप में पिछले अध्ययनों ने दिखाया है कि एक तेज पिरामिड टिप के साथ AFM खरोज लोचदार मापांक के उच्च अनुमान में हुई और मुलायम क्षतिग्रस्त जैविक नमूने 26,27।

हालांकि हमारे पूर्व vivo धमनी कठोरता का AFM माप 2 stiffening चिकनी पेशी सेल की आणविक मार्कर के साथ अच्छी तरह से सहमत दिखाई देते हैं, यह एहसास है कि इन धमनी नमूने यंत्रवत् लोड नहीं कर रहे हैं महत्वपूर्ण है, और यांत्रिक लोड समग्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाने की संभावना है धमनी यांत्रिकी। के रूप में AFM, myography (एक पूर्व vivo यांत्रिक लोड हो रहा है के साथ संगत विधि), 28 और नाड़ी-लहर वेग (धमनी कठोरता का इन विवो माप) द्वारा निर्धारित 29 धमनी कठोरता की तुलना की संभावना arter का सबसे व्यापक समझ प्रदान करेगाial यांत्रिकी।

हम संपर्क मोड में AFM का वर्णन किया है माउस धमनियों के पूर्व vivo कठोरता को मापने के लिए। इस विधि को बेतरतीब ढंग से महाधमनी के कई क्षेत्रों पर इंडेंट द्वारा औसत ऊतक कठोरता का अनुमान है। ऊतकों की बड़ी क्षेत्रों से कठोरता के स्थानिक वितरण की जांच करने के लिए, हाल ही में एक कागज बल मात्रा मोड में 30 AFM इस्तेमाल किया गया है। यह दृष्टिकोण एक साथ कठोरता रूपों में से एक नक्शा और ऊतक के स्थलाकृतिक सतह का एक उच्च संकल्प छवि प्राप्त की। ऊतकों के नमूनों की कठोरता को मापने के अलावा, बल-मात्रा मोड में AFM intracellular कठोरता 10,31 के स्थानिक वितरण की निगरानी के लिए कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioScope Catalyst AFM system Bruker
Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope Nikon Instruments
Silicon nitride AFM probe Novascan Technologies PT.SI02.SN.1 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-10 See section 1.4
Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 See section 1.8
Fine Scissors-ToughCut Fine Science Tools 14058-11 See section 1.4 (medium sized)
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08 See section 1.6 (small sized)
60 mm TC-treated cell culture dish Corning 353004
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x Corning 21-031-CM Without calcium and magnesium
Krazy Glue instant all purpose liquid Krazy Glue KG58548R See section 2.2
Gel-loading tips, 1 - 200 µl Fisher 02-707-139 See section 2.2
Tip Tweezers Electron Microscopy Sciences 78092-CP See section 3.2
50-mm, clear wall glass bottom dishes TED PELLA 14027-20 See section 4.4

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References

  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189 (2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585 (2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57 (2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122 (2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974 (2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. , e3733 (2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

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Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (116), e54630, doi:10.3791/54630 (2016).

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