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Environment

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

doi: 10.3791/54631 Published: October 9, 2017

Summary

범블 비 하이브 내 미생물 컨소시엄 풍부 하 고 꽃가루 꿀벌 애벌레에 대 한 유지. 살 균 제 잔류물 꽃가루 미생물, 및 궁극적으로 식민지로 이어지는 식민지 인구 통계를 변경 하는 가설을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다이 원고 실험실 및 필드 기반 실험 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 손실입니다.

Abstract

재배 자 종종 질병, 살 균 제 잔류물에 꿀벌 노출에 대 한 작물을 보호 하기 위해 꽃 동안 균 스프레이 사용 합니다. 비록 "비-안전한" 것으로 간주, 살 균 제 잔류물 꽃가루에 꿀벌 (꿀, 범블 비 종)에 대 한 감소와 관련 된 장착 증거가 있다. 메커니즘 상대적으로 알 수 없는 동안, 연구원은 비 미생물 공생 관련 된 추측 있다. 미생물 보존 또는 꽃가루는 꿀벌 애벌레에 대 한 영양 역할의 처리에서 중추적인 역할을 한다. 미생물 커뮤니티를 바꿔서 fungicides 이러한 미생물 중재 서비스를 중단 함으로써 꿀벌 건강을 손상 가능성이 높습니다. 이 원고는 간접 따라 장치를 마더보드에 있는 fungicides 식민지 감소 일으킬 수를 조사 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 케이지 실험 균 치료 꽃에 꿀벌 노출 이미 fungicides 네이티브 범블 비 (Bombus 봉)에 깊은 식민지 손실 원인 첫 번째 증거 제공. 균의 필드 관련 된 복용량을 사용 하는 일련의 실험 균 노출 꽃가루의 미생물 지역 사회 역학의 미세한 설명 개발 되었습니다. 곰 팡이 및 세균 assemblages 꽃가루 미생물 내에서 구조 구성의 변화는 다음 세대 시퀀싱 및 metagenomic 분석 조사. 실험 본 개발 fungicides 꽃가루 규정의 미생물에 미치는 영향에 대 한 기계적 이해를 제공 하기 위해 설계 되었습니다. 궁극적으로, 이러한 결과 해야 통해 fungicides 식민지 하락 일으킬 수 간접 통로에 빛을 발산 하 고 있다.

Introduction

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관리 하 고 야생 꿀벌 종 모두 자연 및 농업 시스템1에 대 한 주요 영향으로 광범위 한 하락 발생 하는. 이 문제의 원인을 이해 하 공동된 노력에도 불구 하 고 꿀 꿀벌 감소를 촉진 하는 요인 없습니다 아직도 잘 이해2,,34. 야생, 네이티브 꿀벌의 특정 종족에 대 한 상황이 긴박 한5,6되고있다. 꿀벌 인구 산업 농업과 교차, 그들의 인구가을 계속 하 고 가루 (전세계 생산7의 35%)을 요구 하는 작물을 감당할 것 이다 때 지속 될 수 없는 수확을 감소.

살충제 노출, 질병, 그리고 서식 지 손실1,4,8,,910 등 많은 잠재적인 요인 꿀 꿀벌 쇠퇴에 연루 되었습니다 동안 상대적으로 작은 네이티브 꿀벌 건강, 또는 농업 시스템 근처에 이러한 스트레스의 대화형 효과 대 한 알려져 있다. 많은 현재 연구 노력은 지난 연구는 균도 역할을 할 수 꿀벌 감소에 메모리 형성을 방해 하 여 나타냅니다 있지만 살충제, (예를 들어, neonicotinoids11,,12)에 초점을 계속합니다 후 각 리셉션13, 둥지 인식14, 효소 활동 및 신진 대사 기능15,,1617. 세계적으로, 균 꽃 중 꽃 작물에 적용 될 계속. 최근 연구는 꿀벌 일반적으로 살 균 제 잔류물 다시가지고 하이브18, 참으로, 연구 시험된 두 드러 기 포함 된 살 균 제 잔류물19,20의 큰 비율을 문서화 했다. 추가 작업은 그 살 균 제 잔류물은 꿀 꿀벌 애벌레 사망률21,,2223 의 높은 속도 식민지, 이내 "꽃가루 안치"의 존재와 관련 계시 했다는 비록 비-독성, 미생물 활동 없는 이며 영양 손상된24입니다. 살 균 제 "비 안전"에 고려 오래는 사실에도 불구 하 고 지금 증거는 혼자 살 균 제에 노출 네이티브 범블 비 종, Bombus 봉25심각한 식민지 손실을 발생할 수 있습니다.

살 균 제 노출 및 식민지 사이의 인과 관계를 설정 하려면 사망률, 이러한 화학 물질의 은 결정 될 필요가 있다. 균 류를 대상으로 토양26, 퇴적 물27, 및 수 중 환경28, 입증, fungicides 가장 가능성이 변경 곰 팡이 풍부 하 고 꽃가루-규정, 주요 지역 사회를 호출 함으로써 다양성을 이동 강력 하 게 박테리아를 선호 하는 수 있습니다. 곰 팡이 경쟁 또는 길 항 근, 없이 특정 병원 성 박테리아 상대적으로 되지 않은, 꽃가루 규정의 부패를 촉진 확산 수 있습니다. 과거의 연구 보여주었다 미생물, 효 모 및 filamentous 곰 팡이, 특히 꿀벌29,,3031영양 symbionts 역할 기생충 및 병원 균32 ,33, 꽃가루 점포의 장기 보존을 제공. 살 균 제, 따라서 수 있습니다 직접 해 하지 미 숙 꿀벌 및 기회 주의 병원 체와 기생충12민감성을 증가 하 여 이러한 서비스를 제공 하는 데 필요한 미생물 지역 사회를 방해 하 여. 식량 생산에 대 한 요구 증가 함께 전세계 작물은 되 고 살포 매년 균 같은 균 유발 효과의 정도 이해 하는 필요를 강조 하는 꽃 중.

날짜, 생태 다음과 같은 질문으로 나타낼 수 있습니다 네이티브 벌 미생물에 관한 기본 지식 간격: 어느 정도 살 균 제 변경지 않습니다 꿀벌 꽃가루-규정 내에서 미생물 커뮤니티? 뿌리깊은 변경 된 미생물 지역 사회와 함께 꽃가루를 소모의 다운스트림 영향 입니까? 이러한 생태학적으로 밀접 한 질문에, 실험 1을 공개 하는의 기본 목표와 함께 개발 되었다) 그 살 균 제 잔류물 혼자 네이티브 꿀벌 종; 가혹한 식민지 감소를 일으킬 수 있습니다 2) 꽃가루 조항에 미생물 지역 사회 살 균 제, 및 3 변경 되는 있는 정도) 어떻게 꿀벌 건강 심각 하 게 변경 된 미생물 지역 사회에 의해 영향을 받습니다. 실험 목표는 실험실 및 필드 기반 실험의 조합을 사용 하 여 위의 질문을 해결 하기 위해 정의 되었다. 의 상태--예술 metagenomic 및 현장 관찰의 전통적인 방법과 함께 분자 기술을 사용 하 여,이 연구는 꿀벌 건강에 균의 잠재적인 영향을 목표로 한다.

이 연구의 첫 번째 목적은 혼자 살 균 제 노출 네이티브 꿀벌 종 가운데 중요 한 식민지 손실을 발생할 수 있습니다 설명 하는 것입니다. 큰 필드 연습장을 포함 한 연구 Bombus 봉, (그림 1, 그림 2, 그림 3) 미국에서 유비 쿼터 스, 풍부한 네이티브 꿀벌의 식민지 성장에 살 균 제 노출의 효과 조사 하기 위해 사용 되었다. 그것은 낮은 체력과 비정형 인구 비 노출 두 드러 기에 비해 균 치료 하이브 제시는 가설 했다. 이 실험에서 얻은 데이터 꽃가루 내에서 살 균 제 잔류물 네이티브 범블 비 종25에 깊은 식민지 손실의 유일한 원인이 될 수 있습니다을 보여주는이 가설을 지원. 이 연구의 두 번째 목적은 꽃가루 미생물 살 균 제 노출에 대 한 응답을 조사 하는 것입니다. 균에 노출 되어 꽃가루 규정 내에서 미생물의 커뮤니티 구성 치료 꽃가루의 다른 것을 가정 했다. 곰 팡이 풍요로 움과 다양성은 크게 하락 예상, 박테리아 및/또는 하나의 지배적인 균 종 다른 경쟁 곰 팡이의 부재에서 선택 하지 않은 성장할 가능성이 것입니다. Vivo에서 시험의 시리즈를 통해 미생물 지역 사회 구성에 이러한 교대 metagenomics를 사용 하 여 분석 됩니다.

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Protocol

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1. 윙윙 거리 다 꿀벌 식민지 성공을 사용 하 여 필드 케이지 실험에서 살 균 제 노출의 효과 검사

필드에서
  1. 세트 10 최대 메쉬 케이지 귀리 심어 져. 각 케이지 주위에 참호를 파고 하 고 꿀벌도 주 할 수 있도록 지상으로 메쉬 케이지의 모든 4 개의 가장자리를 파고. 재고, 꽃 화분 (예: 메 밀, borage, 냉이, 코스모스와 해바라기) 꿀벌을 매력적인 것으로 알려진와 케이지 ( 그림 2).
  2. 보충에 꽃 클로버의 단일 트레이 (36 cm x 42 cm)와 감 금 소. 감 금 소, 귀리에 의해 약 2.5 m x 1 m. 단조로운 나머지 케이지 영역 공간을 점령의 한 구석에 꽃 리소스 클러스터.
  3. 무작위로 할당 범블 비 식민지, 각 포함 된 노동자와 단일 여왕, 치료 (균 현재/결 석, N = 치료 당 5 식민지, 총 10 식민지), 필드 케이지 내에서 그들을 장소 (N = 1/케이지) 29 일 (6 월 23 일 -2014 년 7 월 21 일).
  4. 동양 식민지 상자는 식민지 ' 남쪽 꿀벌 최적의 탐색 조건 제공으로 가리키도록 s 구멍. 설탕 물 방광, 과즙 가용성을 보완 하기 위해 하이브 상자 내부에 배치와 함께 식민지 보조금.
  5. 적용 균 chlorothalonil 기반 5 균 치료 장에 꽃 식물 분야 관련 수준 (20 g/L), 연구 (0, 13 일) 기간 동안 두 번 농약 분무기를 개최 손을 사용 하 여. 아니 더 액체 꽃 표면 ( 그림 3)에 고착 되도록 균일 하 게 꽃을 코트.
  6. 필드 케이지 연구의 결론에는 연습장에서 B. 봉 식민지를 손으로 제거, 20 분-20 ° C 냉장고에 배치 하 여 두 드러 기를 냉각
  7. 소독 집게를 사용 하 여 꿀벌을 제거 하 고 애벌레, 번데기, 성인 여성 수를 기록 (. e. 채집), 그리고 성인 남성. 어머니 여왕, 애벌레, pupae, 성인 여성 ( 채집), 그리고 성인 남성의 건조 중량을 기록 분석 균형을 사용 하 여.

2. 엉망으로 꿀벌 둥지를 사용 하 여 실험실 기반 Vivo에서 시험의 꽃가루 규정에 미생물 지역 사회에 살 균 제 노출의 효과 검사

  1. Pulverize 상업적으로 구입한 꽃가루는 표준을 사용 하 여 정밀한 분말에 실험실 볼-밀입니다. UV 빛 아래에서 하룻밤 증발을 70% 에탄올에 몸을 담글 하 여 가루 꽃가루를 소독. ~0.5 mg 범용 한 천 매체에 도금 하 여 꽃가루의 무 균을 확인 합니다.
    1. 건조, 소독된 꽃가루, 소독된 펫을 사용 하 여 추가 균의 필드 관련 된 복용량: 14.3%;에서 propiconazole 치료에 대 한 22.9%에서 azoxystrobin (0.74 µ L 및 0.65 µ L 각각 / 일 / 하이브). 잘 소독된 나무 막대기를 사용 하 여 혼합.
  2. 장소 6 실험 하이브 (n = 3 각 제어 및 치료에 대 한) 깨끗 하 고 위생 실험실 벤치탑 실내 온도에 유지에서. 매일 무게 꽃가루 34 , 35 (치료)에 대 한 살 균 제 또는 표준 무 균 기술을 사용 하 여 후드 안쪽 (컨트롤)에 대 한 살 균 물과 혼합의 4.27 g.
    1. 트랩 문 바깥쪽 두 드러 기, 골 판지 상자의 측에 의해 제공를 사용 하 여 두 드러 기 안에 꽃가루 소개. 매주 소독된 설탕 솔루션으로 두 드러 기를 보충 한다. 4 주 동안 정권 먹이 계속.
  3. 20 분 긁어 소독된 집게 주걱을 사용 하 여 브루 드 챔버 내에 포함 된 꽃가루 규정 밖으로-20 ° C 냉장고에 놓고 멸 균 저장 관에서 두 드러 기 연구소 기반 연구의 결론에 냉각. 스토어-80 ° C. 수 및 기록 노동자와 시작 및 실험 (단계 1.7)의 끝에 여왕 어머니의 무게.
  4. 상용 DNA 격리를 사용 하 여 꽃가루 제공 샘플에서 DNA 분리 키트 (자세한 자료 표 참조).
    1. 조항의 꽃가루-추출 0.25 g 튜브, 짧게 소용돌이를 섞어 추가.
    2. 는 Lysozyme 솔루션 50 µ L/샘플에 대 한 충분 한 이온을 제거 된 증류수에 200 mg/mL 확인합니다. 완전히 양식 솔루션을 적극적으로 악수.
    3. , 샘플 추출 관을 lysozyme 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 여러 번을 반전 하 여 잘 혼합. 물 욕조에 37 ° C에서 10 분 동안 튜브를 품 어. 침전을 형성 하는 경우 열 솔루션을 사용 하기 전에 해산 될 때까지 60 ° C.
    4. 추출 관에 수성 세포 솔루션의 추가 70 µ L 테이프, 평판 소용돌이 패드에 가로로 보안 및 30에 대 한 10000 x g에서 10 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이 관 실 온에서 s.
    5. 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브는 상쾌한 전송. 250 µ L 단백질 강 수 솔루션, 그리고 소용돌이의 얼음 욕조에 5 분 동안 4 ° C에서 5 미 품 추가.
      참고: 상쾌한의 500 µ L 400 µ L 사이 기대 합니다. 상쾌한 여전히 몇 가지 입자를 포함할 수 있습니다.
    6. 10000 x g에서 1 분 동안 실내 온도에 튜브 원심 하 고 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브에 상쾌한의 최대 600 µ L를 전송. 수성 억제제 제거 솔루션, 짧게, 소용돌이의 200 µ L을 추가 하 고 5 분 원심 분리기 10000 x g.에 1 분 동안 실내 온도에 튜브는 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브로 상쾌한의 750 µ L까지 전송 4 ° C에서 품 어.
    7. 상쾌한, 그리고 5와 동을 수성 바인딩 솔루션의 추가 1200 µ L s. 스핀 필터, 실내 온도에 1 분 동안 10000 x g에서 원심 분리기에 상쾌한의 약 675 µ L 로드. 삭제를 통해 흐름.
    8. 반복 2.4.7. 두 번.
      참고: 각 샘플 처리에 대 한 3 중의 총은 필요.
    9. 추가 500 µ L 에탄올, 및 30에 대 한 상 온에서 원심 분리기 10000 x g.에서 s, 흐름을 무시 하 고 g. 장소 스핀 필터 청소 2 mL 컬렉션 튜브에서 x 10, 000에서 1 분 동안 실내 온도에 다시 원심.
    10. 차입의 추가 100 µ L 버퍼 필터 멤브레인의 중심입니다. 30에 대 한 상 온에서 원심 분리기 s 10000 x g. 스핀 필터 삭제. 스토어-20 ° C-80 ° C 사이의 DNA 수집
  5. 사용 절연 DNA 시퀀싱.
  6. 계량,
      그리고 fluorometric 분석에 의해 고립 된 DNA 2 ng / µ L를 정상화. 각 추출 샘플 28S의 상대적 양을 비교 3 중에
      1. 준비 반응 (공장), 그 (곰 팡이), 분석 및 각 화분 제공 샘플 36의 16S (세균성) 구성 요소. 10 각 반응에 포함 되어 있는지 확인 전체 DNA, 비대칭 cyanine 염료 기반 마스터, 믹스의 2 배 및 2.5 µ L 각 정방향 및 역방향 뇌관 쌍 28KJ/28B 37 식물 및 균 dna ITS1/ITS5.8R ng 38 .
    1. 다음 매개 변수를 사용 하 여 증폭 DNA: 50 ℃, 95 ℃에서 2 분 초기 변성에서 2 분 전 변성의 40 주기 (15 98 ° C, 15에서 s s 58 ° C, 60에서 72 ° C에), 용융 곡선 뒤.
    2. 준비 16S rRNA를 대상으로 차세대 시퀀싱 라이브러리를 사용 하 여 2 단계, 중첩 된 PCR 프로토콜 v 3/V4 변수 지역 및 ITS / 5.8s rRNA 공백 지역.
      1. 5 DNA의 추가 12.5 µ L pmol 각 뇌관 및 마스터 믹스 x 2의. 각 지역 (16S 또는 ITS; 표 1 참조)에 대 한 별도 반응을 확인 합니다. 시퀀서 특정 어댑터 오버행 뉴클레오티드 순서 유전자 특정 시퀀스에 추가 하려면 앞에서 설명한 39 , 40 지역 특정 뇌관 수정.
      2. 다음 매개 변수를 사용 하 여 초기 증폭을 수행: 95 ° C에서 3 분 초기 변성, 25의 주기 (30 s 95 ° C, 30에서 55 ° C, 30에서 s s 72 ° C에서), 72에서 5 분 최종 확장 ° c.
      3. 다음 초기 증폭, 전기 이동 기동성에 의해 라이브러리 크기 및 수량을 확인 하 고 볼륨 단단한 단계의 가역 imm x 1를 사용 하 여 청소obilization 구슬 잔여 뇌관 및 반응 시 약을 제거. 수영장 16 및 양적 각 샘플에 대 한 단일 amplicon 풀을 만들려고 그 amplicons.
      4. 는 시퀀서 특정 어댑터를 추가 하 고 다음 뇌관 (표 1 참조)를 사용 하 여 특정 듀얼 인덱스 샘플. 각 뇌관 및 마스터 믹스 x 2의 5 pmol에 증폭 된 DNA의 2.5 µ L를 추가 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 라이브러리 증폭을 수행: 95 ° C에서 3 분 초기 변성, 8의 사이클 (30 s 95 ° C, 30에서 55 ° C, 30에서 s s 72 ° C에), 72에서 5 분 최종 확장 ° c.
    3. 다음 PCR, 단단한 단계의 가역 immobilization 구슬의 1 x 볼륨을 사용 하 여 깨끗 한 완성 된 라이브러리. 전기 이동 기동성, 그리고 fluorometry, 각각 사용 하 여 완성 된 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다. 2 µ M 및 시퀀싱 전에 풀 라이브러리 표준화.
    4. 전체 amplicon 41을 충당 하기 위해 적절 한 길이와 2 차 PCR에 추가 어댑터를 유사 플랫폼에서 다음-세대 시퀀싱을 수행.
  7. 주석 및 미생물 구성 분석 시퀀스.
  8. 모든 시퀀스 된 라이브러리에 대 한 단일 contigs 결합 쌍-엔드 시퀀싱 데이터 (R1 및 R2)
      . R1 및 r 2 파일을 병합, 후 각 라이브러리에 대 한 단일 fasta 파일 생성.
      참고:이 단계 고 (하지 않는 한 달리 명시) 아래에 설명 된 프로세스에서에서 수행 Mothur 버전 1.38.0 38.
    1. 모호한 기지, 예기치 않은 긴 시퀀스, 그리고 긴 homopolymers를 제거 하려면 각 fasta 파일 화면.
      참고: 심사, 그리고 시퀀스 제거에 대 한 매개 변수는 maxambig = 0, maxlength = 600, 및 maxhomop = 8 두 유전자에 대 한. 동일한 시퀀스를 제거 하지만 모든 라이브러리 (일명 수 표에 Mothur)에 대해 별도로 contingence 테이블.
    2. 123, 실바 데이터베이스 버전에 대 한 유전자 16S 도서관과 42 단결의 데이터베이스 대 한 유전자는 라이브러리의 고유한 시퀀스 정렬.
      참고: 시퀀스 수 주석 첨부 합니다 왕국 수준에서 속 수준.
      1. 클러스터 시퀀스를 정렬 하는 그 후, 비교를 사용 하 여 함수 pre.cluster = 5, 그리고 키메라 제거.
    3. 43 (16 진)에 대 한 실바와 단결의 (유전자 ITS)에 대 한 분류 파일 (컷오프 값의 80%)에 따라 메서드를 사용 하 여 시퀀스를 분류.
    4. 로드 R 44 Mothur에 분류 과정에서 생성 된 contingence 테이블 (유전자 하나씩). 미생물 커뮤니티 변경의 추가 분석을 위한 라이브러리 당 관계 되는 풍부를 얻을 각 분류학 수준.
      참고: 각 분류학 수준에서 병합 함께 분류학 그룹 관계 되는 풍부는 모든 실험 반복에 대 한 2% 미만 때.

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Representative Results

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필드 케이지 연구:

케이지 실험에서 얻은 데이터 범블 꿀벌 식민지 살 균 제 노출에 대 한 중요 한 응답 했다는 것을 보여주었다. 균 치료 두 드러 기 생산 제어 두 드러 기 보다 훨씬 적은 수의 노동자 (12.2 ± 3.8, 평균 ± SE) (43.2 ± 11.2, F1, 9= 6.8, p = 0.03) (그림 4). 또한, 균 치료 하이브 (0.91 g ± 0.15)의 비 바이오 매스는 제어 두 드러 기 (2.36 g ± 0.55; 보다 훨씬 낮은 F 1, 9 = 8.3, p = 0.02). 균 치료 두 드러 기에서 낮춘된 바이오 매스의이 패턴 또한 어머니 퀸 즈 사이에서 관찰 되었다. 균 치료 하이브 컨트롤 두 드러 기 (0.27 g ± 0.01;의 퀸 즈 보다 크게 낮은 바이오 매스 (0.14 g ± 0.04)와 제시의 퀸 즈 Z = 2.5, p = 0.01). 그러나, 살 균 제 노출 치료에서 애벌레, 번데기, 그리고 남성 숫자를 미치지 않았다. 개별 생활 단계 (유 충, 번데기, 노동자, 그리고 성인 남성)과 애벌레, 번데기, 그리고 근로자에 대 한 개별 가중치의 바이오 매스는 살 균 처리를 통해 어떤 차이 보여주지 않았다 고 제어 하이브.

연구소 기반 연구:

실험실 기반 실험에서 얻은 데이터 표시는 살 균 제 노출, 이전 제어 및 두 드러 기 살 균 제 처리 했다 통계적으로 유사한 평균 작업자 수 (두 드러 기 제어 = 28.0 ± 3.1, 살 균 제 처리 두 드러 기 = 31.67 ± 2.0, n = 3 각) 및 무게 퀸 (두 드러 기를 제어 = 0.77 g ± 0.04; 균 치료 두 드러 기 = 0.74 g ± 0.01). 그러나, 연구의 끝에, 작업자 수 했다 상당히 높은 제어 두 드러 기 (67.67 ± 4.3), 살 균 제 처리 두 드러 기 (45.33 ± 3.8)에 비해 (t4 = 3.89, p = 0.01). 노동자 인구 제어 두 드러 기 두 드러 기 살 균 처리에 ~ 45%에 비해 ~ 150%로 증가 했다. 마찬가지로, 여왕 어머니의 최종 무게 균 치료 두 드러 기 (0.49 g ± 0.16) 두 드러 기 (0.76 g ± 0.02) ~ 35%에 비해 감소 하는 컨트롤에 상대적으로 변경 되지 않은 상태로 남아 있었다. 함께 찍은, 이러한 결과 이전 게시 결과25 일치 하 고 나타내고 균 노출 적은 작업자 수에 의해 입증으로 식민지 피트 니스의 영향을 감소 대비 무게 (그림 5).

꽃가루 규정의 Metagenomic 분석 표시에서 수집 된 미생물 지역 사회 사이 뚜렷한 차이가 균 치료 및 두 드러 기 (그림 6)를 제어. 감소 (> 95%) 일반적으로 격리 된 Streptomycetales, 살 균 제 처리 두 드러 기에 Enterobacteriales의 상대적인 풍요에서. 흥미롭게도, 이들 두이 그룹 다 그들의 항진균 성 활동 및 꽃가루 보존30,45 꿀벌 하이브 환경에서 역할에 대 한 알려져 있습니다. 순서 절지동물46의 일반적인 병원 체를 포함 하는 Rickettsiales의 세균성 일원 균 치료 두 드러 기에 훨씬 더 풍부 하 게를 보였다. 균 치료 하이브 주문 Eurotiales 및 Sordariales에 속하는 곰 팡이의 더 낮은 풍부와 주문 Capnodiales 및 Ascosphaerales 컨트롤 두 드러 기 (그림 7)에 비해 더 높은 풍부 했다. 예상 했던 대로, 박테리아와 곰 팡이, 섀 넌의 다양성 색인 (H) 및 균일성 (E)은 낮은 컨트롤에 비해 균 치료 두 드러 기에 이러한 차이 통계적으로 유의 한 (박테리아: H 두 드러 기를 제어 1.25 ± 0.3, H하이브 균 치료 = 0.82 ± 0.2, 전자제어 두 드러 기 = = 0.46 ± 0.1; E균 치료 두 드러 기 = 0.31 ± 0.1; 버섯: H제어 하이브 0.99 ± 0.3, H균 치료 두 드러 기 = = 0.72 ± 0.4, 전자제어 두 드러 기 = 0.57 ± 0.2; E균 치료 두 드러 기 = 0.42 ± 0.2). 이동 같은 커뮤니티의 대사 및 기능적 의미를 자세히 설명 하는 있지만이 연구의 범위를 넘어, 식민지 수 및 무게 데이터와 결합, 이러한 결과 것이 좋습니다 살 균 제 노출 감소 식민지 건강에 의해 영향을 미칠 수 있습니다. 꿀벌과 꽃가루 미생물 간의 공생을 방해. 애벌레 survivorship에 영향을 미치는 특정 미생물 그룹의 역할에 추가 조사는 더 나은 건강 한 꿀벌 인구를 유지에 꽃가루 미생물의 역할을 평가 하는 것이 좋습니다.

Figure 1
그림 1: Bombus 봉 둥지 내부. 브루 드 셀을 노동자의 고해상도 이미지입니다. 브루 드 셀 지정된 된 시간에 여러 계란과 애벌레를 포함할 수 있습니다. 주기적으로 챔버에 도입 꽃가루 규정에 피드 애벌레를 개발. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 큰 필드 연습장 건립 꿀벌 식민지 집. 각 메쉬 케이지 (N = 10) 하나 상업적으로 구입한 방류 했다 Bombus 봉 하이브, 뿐만 아니라에서 꽃 식물 종 꿀벌을 유치 하는 것으로 알려져. 꽃 감 금 소의 한 모퉁이에서 구입 했다 그리고 나머지 지역 귀리 잔디 vegetated 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 최근 스프레이 해바라기에 살 균 제 잔류물. 균의 필드 관련 된 복용량 0과 실험의 13 날에 살포 했다. 농약 분무기를 사용 하 여, 꽃 균일 하 게 코팅 했다 살 균 제 솔루션 채집 자 벌와 직접 접촉을 피하기 위해 황혼/저녁에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 케이지 실험에서 범블 꿀벌에 살 균 제 잔류물의 영향. 식민지 크기 (reduct에에서 상당한 감소를 전시 하는 범블 꿀벌 식민지에 살 균 제 잔류물 꽃가루에 노출성인 여성에 이온) 한 달에 걸쳐. 오차 막대 대표 ± 1SE. p < 0.05. 이 그림 Bernauer 에서 수정 된 25. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 실험실 기반 실험에서 범블 꿀벌에 살 균 제 잔류물의 영향. 균 처리 꽃가루에 노출 범블 꿀벌 식민지 식민지 크기 (성인 작업자 풍부 하 게에서 감소)에 있는 상당한 감소와 대비 체중 감소 한 달 동안 전시. 오차 막대 대표 ± 1SE. p = 0.03. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 순서는 순위에 곰 팡이 및 세균 다양성의 metagenomic 분류의 원형 차트. 꽃가루 규정 샘플 () 16와 (b) ITS 기반 분류에 따라 분석 제어 및 살 균 제 처리 두 드러 기에서 수집. 제어 하이브 높은 성과 미생물 분포의 균일성을 시연 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 박테리아와 곰 팡이 살 균 제 노출에 대 한 응답에서의 순서 대로 순위 관계 되는 풍부 비율 변화. 미생물 커뮤니티를 사용 하 여 () 16의 Metagenomic 분류 및 (b) ITS 기반 프라이 머 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

뇌관 쌍 뇌관 유형 뇌관 순서
28KJ/28B 공장 GGC GGT AAA TTC CGT CC /
CGT CCG TGT TTC 아 그 ACG
ITS1 / ITS5.8 곰 팡이 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G /
개 그 ATC CGT TGT TGA 아 그 TT
앞으로 / 역방향 16s 중첩 된 박테리아 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG-3'/
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
ITS1F 뇌관 / ITS4 곰 팡이 중첩 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
어댑터 뇌관 -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [55555555] 5'
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [77777777] 5'
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3 '

표 1: 뇌관 쌍 및 DNA 증폭에 사용 되는 뇌관 시퀀스 목록. 참조에 대 한 텍스트를 참조 하십시오.

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Discussion

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꿀벌 건강에 균의 효과에 대 한 조사는 해충 관리 전략의 understudied 측면 남아 있다. 우리의 연구 명시적으로 꿀벌 감소 운전 잠재적인 요소를 분리 하는 보완 기술의 제품군을 사용 하 여이 지식 격차를 해소 하는 것을 목표로. 계획, 근거, 그리고이 실험의 렌더링 아래 자세히 나와 있습니다.

없는 꿀벌이 인구 통계학 분석을 손상 할 것입니다 이후 케이지 실험의 메쉬를 탈출 수 있도록 중요 하다. 그것은 또한 인공 둥지 비와 직접적인 햇빛에서 보호 하기 위해 충분 한 절연 있어야입니다. 살 균 제는 둥지에 직접 살포 하지 있도록 주의 한다. 식민지 설탕 물 방광 꿀 수집을 보충 하 고 탈수를 방지를 제공 한다.

실험실 먹이 실험을 기반으로, 대 한 꽃가루 식사를 준비할 때 오염을 방지 하기 위해 엄격한 무 균 조건 유지 되어야 한다. 상업적으로 구입한 화분 가루 해야 그리고 UV 사용 전에 소독. 하이브 위생 식료품 저장실 나방과 바퀴벌레 같은 외부 기생충에서 감염을 방지 하기 위해 유지 되어야 합니다. 유체 방광 탈수를 방지 하기 위해 소독된 설탕 솔루션으로 보충 한다. 치료 전 인구에 대 한 주의 해야 하지 긴장에 꿀벌 과도 한 처리 및 연장에 대 한 hived는 밖에 서 그들을 유지 하 여 기간.

DNA 수율 연령과 시작 물자의 종류에 따라 달라 집니다, DNA 추출 및 증폭에 신선한 또는 잘 고정 된 샘플만을 사용 해야 합니다. 이 DNA 수확량을 낮은 것으로 DNA 추출에 대 한 샘플 중량 0.25 gm를 넘지 말아야 한다. DNA 수율 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 정량 한다. 고립 된 DNA의 선행 전기 이동 정량화는 효율적인 증폭47되도록 정량 반응에 진행 하기 전에 중요 합니다.

Metagenomic 분석에 대 한 미생물 동적의 더 포괄적인 분석 (쾌활 차이 시퀀스의 부분 품으로) 주석된 시퀀스의 금액을 제한 하 고로 분류학 그룹의 수를 감소 하 여 얻을 수 있습니다. 뿐만 아니라 그는 관계 되는 풍부는 상당히 낮은 병합 (< 2%).

보수적인 표본 크기 (N = 5 두 균 치료와 케이지 연구 두 드러 기 치료에 대 한) 큰 복제를 사용 하 여 미래 연구에 최소화 될 것 이다 데이터에 분산 팽창 수 있습니다. 에 추가 하려면 더 큰 해상도 통계적 인 힘 결과, 꿀벌 식민지 되며 censused와 무게 전에 살 균 제 노출 후. 오랜 동안 케이지 실험 실행 추가 응답 가변으로 봉사 할 수 있는 새로운 퀸 즈의 생산을 수 있습니다. 현재 프로토콜을 이러한 수정, 미래 연구 하이브 인구 역학에 대 한 더 많은 세부 정보를 제공할 것입니다.

꽃가루의 소수 성 자연 물으로 혼합 하는 그것의 효율적인 deters. 분쇄 및 정밀한 분말에 꽃가루과 립 선별, 믹싱 과정에서 에이즈. 원하는 일관성을 달성 하기 위해 꽃가루 분말의 크기를 조정할 수 있습니다. 철저 하 게 혼합 액체 (물 또는 살 균 제) 활성 재료는 채집에도 배달의 균일 분배를 달성 하기 위해 주의 해야 합니다.

초과 DNA는 PCR 반응을 억제할 수 있는로는 샘플 0.25 g. 과도 한 vortexing이 DNA, 수익률을 낮추는 위 피해 야 한다 보다는 더 많은 무게 해야 하는 것이 좋습니다. 낮은 DNA 수율 세포의 용 해 버퍼에 장기간된 노출의 결과 영향을 수도 있습니다. 세균성 뇌관을 선호 16S rRNA의 v 7-v 9 지역에서 엽록체 DNA48의 일반적인 증폭을 최소화 하기 위해 선택 되어야 한다. 또한, 18S 리보솜 RNA 유전자와 같은 다른 유전자의 연속 살 균 제 사용 시 인구 변화 뿐 아니라 꽃가루, 미생물 다양성의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.

Mothur와 함께 처리 하는 라이브러리의 양을 감안할 때, 컴퓨팅 시간 상당히 높은 수 있습니다. 서로 대 한 시퀀스를 비교할 때 싱글톤을 제거 (컴퓨팅 리소스 제한 됩니다, 그들을 하기 전에 제거 키메라 여과) 상당히 조작 상 분류학 단위에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다.

케이지 실험 (있도록 풍경을 통해 널리 마 초), 반대로 꿀벌의 자연적인 비행 범위를 제한 하 고 그것은 분명 학위를 제한 영향을 미칠 수 응답 변수. 제어 및 치료 새 장 같은 biotic 및 abiotic 변수 범위 경험, 비록 그것 불가능 물류 각 감 금 소 내의 microenvironment에 대 한 제어를 합니다.

지역 사회 내에서 미생물 상호 작용의 진정한 범위는 너무 복잡 하 고 복잡 한 실험 예 심을 통해 복제입니다. 우리의 데이터 가능성이 꽃가루 규정 내에서 총 미생물 다양성의 일부 문서, 하는 동안 그것은 박테리아와 곰 팡이 균의 존재/부재에서 사이의 우선 수 있습니다 대화형 효과에 첫 번째 통찰력 이다.

49 시퀀스 정렬에 대 한 다른 데이터베이스를 사용 하 여 또는 꽃가루 세균성 다양성50 에 따라 기능 대사 상태를 예측 꽃가루 미생물의 더 넓은 시야를 제공할 수 있습니다. 결국, 더 나은 균 후 미생물 커뮤니티의 대사 및 기능 동적 특성, 꽃가루 미생물의 전체 게놈 시퀀싱은 필요 합니다.

상업적으로 구입한 두 드러 기를 사용 하 여 케이지 실험 반 제어 설정에서 응답 변수를 측정 하는 최상의 프레임 워크 중 하나를 제공 합니다. 꿀벌 자연 생태 (채집 효율, 사회 구조, 자손 보험)에 최소한의 변경 발생, 케이지 실험 최소화 계략과 스트레스, 인공 환경 실험실 기반 시 취급 설명서에 의해 도입 실험입니다.

우리의 지식이 최고의 아니 연구 아직 범블 꿀벌의 꽃가루 규정 내에서 미생물 지역 사회 역학에 균의 효과 평가 하기 위해 실시 되었습니다. 살 균 제에 노출 수 있습니다 하나 이상의 중요 한 종, 균 류 및 박테리아 사이 생태 휴전을 방해를 제거 하 고. 이 연구를 사용 하 여 필드 및 실험실 기반의 재판 도가니로 이러한 상호 작용에 밖으로 재생, 상주 미생물 종의 근절 타협 꿀벌 건강 차례로 수 꽃가루 미생물의 생태 균형 변 태 수 있습니다 입증 하 것을 목표로.

희석 및 표준 미디어 캡처에 도금 등 culture에 종속 된 기술주어진된 환경에서 microflora의 일부만. 이 미생물 다양성의 총 underrepresentation으로 이어질 수 있습니다 그리고 unculturable 미생물 들 키 지 않고51갈 수 있습니다. 공부 하 고 미생물의 폭, 과학자는 더 포함 하 고, 예를 들면 metagenomic 분석 및 차세대 시퀀싱에 대 한 포괄적인 문화 독립적인 기술을 의존 해야 합니다. 이러한 강력한 분자 기술에서 무 겁 게 그리기,이 연구는 제공한 전통 문화 기반 기술을 혼자 보다 꽃가루 미생물에 높은 해상도를 목표로 합니다.

이 연구에서 결과 균에 노출 범블 꿀벌 식민지 내에서 노동자의 수에 지대한 손실을 계시 했다. 성공 하려면 범블 꿀벌 식민지, 노동자 충분 한 리소스를 제공 하 고 어머니 여왕에 대 한 관심과 특히 애벌레를 개발에 대 한 필요가 있다. 궁극적으로, 식민지의 목표는 가능한 많은 딸-퀸 여름 말에 의해 생성 될 수 있다 그런 리소스 캡처 (꽃가루와 꿀)을 극대화. 건강 한 딸-퀸 즈는 식민지에 대 한 적합성의 측정. 노동자, 주요 감축, 효과적으로 식민지의 생산 능력을 퀸 즈 다음 1 년 동안 undercuts. 이 연구에서 뿐만 아니라 노동자 숫자는 크게 감소 했다, 하지만 어머니 퀸 즈는 균에서 치료 두 드러 기를 채집 하 여 부족 한 식량 공급 결과로 아마도 낮은 바이오 매스를 만납니다. 꽃가루 규정 내에서 미생물 상호 작용의 복잡성을 감안할 때, 그것 곰 팡이 및 이러한 패턴에 기여 하는 박테리아 사이 정확한 상호 작용 효과 분별 하기 어렵다. 그러나, 복제 및 반복 실험에서 파생 된 결과 여기에 설명 된 대로 제공 합니다 이러한 두 미생물 그룹 사이 변화 공생에 대 한 중요 한 통찰력 (경쟁, mutualistic, 또는 공생) 여부 xenobiotic 스트레스에 대 한 응답 그리고 꽃가루 미생물에는 다운스트림 효과입니다.

강력한 분자 도구 사용 하 여 꽃가루 미생물의 생태 복잡성 더 잘 해결할 수 있습니다. 예비 이해 자연적 사건 박테리아와 버섯, 식민지 피트 니스를 유지 하기 위해 공동으로 기여의 과다를 보여준다. 특히, 꽃가루 조항에서 고립 되었다 효 모 곰 살 균과 발효를 모두 애벌레 꿀벌의 개발에 대 한 중요 한 속성으로 알려져 있습니다. 이러한 생태 연결 있습니다 꿀벌과 그들의 꽃가루 미생물 사이 mutualism의 높은 학위의 암시. 꽃가루-규정, 따라서 핵심 기능 역할의 구성 미생물 커뮤니티의 재배에 대 한 가져온 긴급 다양성 효과를 나타냅니다. 이러한 주요 symbionts의 부재에서 꽃가루 제공 알 수 없는도 손상 될 나타납니다. 이 방향에서 계속된 일 가능성이 이러한 미생물의 기능적 다양성을 설명 하 고 정체 꿀벌 symbionts로 그들의 역할.

최근 연구는 꿀벌19,,2452,,5354에 무해 한 것으로 균의 개념을 밝혀 졌. 이 연구의 목적은 꿀벌, 따라서 살 균 제 사용과 꿀벌 감소의 원인-효과 관계를 조명에 살 균 제 영향을 운전 하는 메커니즘을 분리. 비-미생물 공생은 살 균 제 잔류물 꽃가루에 의해 크게 변경 되 고 개념 가설 센터. 궁극적으로,이 작품 어떻게 fungicides 볼 되며, 농업 및 도시 환경에서 프레임 다시 것입니다. 현재 글로벌 pollinator 위기에 비추어 제안 된 연구 농업 생산 관행에 관한 기본 꿀벌 생태에 대 한 새로운 지식을 생성 합니다. 균을 효과적으로 꽃 중 작물에 응용 프로그램을 제한 하는 규정에서 제외 될 마지막 농약 그룹 유지. 그 결과, 관리와 야생 꿀벌 fungicides에 지속적으로 노출 됩니다. 문학의 성장 시체, 살 균 제는 높은 복용량에서 접촉에 꿀벌에 치명적인 노출 높은 애벌레 사망률21 로 이어지는, 매우 해로운 이며 사실을 동작 변경 제안 합니다. 이 작업에 따라 장치를 마더보드에는 균 가루를 해치지는 밝히는 것입니다 예상 된다. 또한,이 연구 지혜롭게 해충 관리 정책의 기초를 형성 하 고 최고의 관리 관행의 재배를 알려. 이 작품 또한 농약 법률 및 규정에 영향을 미칠 수 있는 향상 된 살충제 살포에 대 한 지침을 제공 하는 수단이 될 것입니다. 더 넓게, 이러한 결과는 현 화 식물 꽃가루를 수집 하 여 방문한 모든 관리 되는 생태계와 관련이 있을 것입니다 곤충. 비 특정의 글로벌 견적 수 분 서비스는 매우 높은55,56이 작품의 꿀벌 인구 감소를 줄일 수 있습니다 되 고, 잠재적인 영향 상당한 있을 것 이다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 위스콘신 대학교의 생명 공학 센터 DNA 시퀀싱 시설을 기술 지원 확대 및 시퀀싱 시설 및 서비스, 케이 틀린 칼 슨, 제니퍼 요령, 제이크 오토, 및 최대 세 제공을 위한 감사 합니다. 분자 분석입니다. 이 작품은 미국 농 무부 농업 연구 서비스 충당 기금 (현재 연구 정보 시스템 #3655-21220-001)에 의해 지원 되었다. 추가 지원 (보조금 번호 아래 국립 과학 재단에 의해 제공 되었다 DEB-1442148), 미상 그레이트 호수 Bioenergy 연구 센터 (과학 BER 드-FC02-07ER64494의 암컷 사무실), 미국 농 무부 식품과 농업 (해치 프로젝트 1003258). C.T.H. 생물 의학에는 Alfred Toepfer 교수 동료, 퓨 자선 트러스트와 알렉산더 폰 훔볼트 재단에 의해 지원 되는 각각 퓨 학자 이다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

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Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).More

Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

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