Empiriske, Metagenomic og beregningsmæssige teknikker belyse mekanismerne af som fungicider kompromis biers sundhed

Summary

Mikrobielle konsortier i bumble bee nældefeber berige og bevare pollen til bee larver. Ved hjælp af næste generation sequencing, laboratorium og feltbaseret eksperimenter, beskriver dette manuskript protokoller, der bruges til at teste hypotesen at fungicid restkoncentrationer alter pollen microbiome og koloni demografi, i sidste ende fører til kolonien tab.

Abstract

Avlere bruger ofte fungicid sprays under flor til at beskytte afgrøderne mod sygdom, hvilket udsætter bier fungicid restprodukter. Selvom betragtes som “bee-safe”, er der montering beviser at fungicid restkoncentrationer i pollen er forbundet med bee falder (for både honning og bumble bee arter). Mekanismerne er stadig relativt ukendt, har forskere spekuleret på, at bi-mikrobe symbioser er involveret. Mikrober spiller en central rolle i bevarelsen og/eller forarbejdning af pollen, der tjener som ernæring for larver bier. Ved at ændre den mikrobielle samfund, er det sandsynligt, at fungicider forstyrre disse mikrobe-medieret tjenester, og dermed kompromittere biers sundhed. Dette manuskript beskriver de protokoller, der bruges til at undersøge de indirekte mekanismer som fungicider kan være årsag koloni tilbagegang. Bur forsøg udsætter bier til fungicid behandlet blomster har allerede givet de første beviser at fungicider forårsage dybe koloni tab i en native humlebi (Bombus impatiens). Ved hjælp af felt-relevante doser af fungicider, en serie af eksperimenter har udviklet for at give en finere beskrivelse af mikrobielle samfund dynamics fungicid-eksponerede pollen. Forskydninger i de strukturelle sammensætning af svampe- og bakterieinfektioner assemblager inden for pollen microbiome er undersøgt af næste generation sequencing og metagenomic analyse. Eksperimenter udviklet heri har været designet til at give en mekanistisk forståelse af hvordan fungicider påvirker microbiome pollen-bestemmelser. I sidste ende, disse resultater bør kaste lys over den indirekte vej hvorigennem fungicider kan være årsag koloni falder.

Introduction

Forvaltes og vilde bee arter oplever udbredt afvisninger, med store konsekvenser for både naturlige og landbrugs-systemer¹. Trods samordnet indsats for at forstå årsagerne til dette problem, er de faktorer, der styrer honey bee falder stadig ikke godt forstået^2,3,4. For visse arter af vilde, native bier, er situationen blevet dire^5,6. Hvis bibestandene ikke kan opretholdes, når de skærer hinanden med industrielt landbrug, deres befolkninger vil fortsætte med at falde, og de afgrøder, der kræver bestøvere (35% af verdensomspændende produktion⁷) vil udholde reduceret høst.

Mens mange potentielle faktorer såsom pesticider eksponering, har sygdom og habitat tab^1,4,8,9,10 været impliceret i honey bee tilbagegang, relativt er lidt kendt om interaktive effekten af disse stressfaktorer på native bier sundhed, inden for eller i nærheden af landbrugssystemer. Mange nuværende forskningsindsatsen fortsat fokusere på insekticider, (fx, neonicotinoids^11,12), selvom tidligere forskning indikerer at fungicider også kan spille en rolle i bee tilbagegang ved at forringe hukommelsen dannelse, olfaktoriske reception¹³, reden anerkendelse¹⁴, enzymaktivitet og metaboliske funktioner^15,16,17. Globalt, fortsat fungicider anvendes på blomstring afgrøder under flor. Nylige undersøgelser har dokumenteret, at bier almindeligt bringe fungicid rester tilbage til bikuben¹⁸, faktisk, undersøgelser har vist en stor del af testede nældefeber indeholdt fungicid restkoncentrationer^19,20. Yderligere arbejde har afsløret at fungicid rester er forbundet med høje priser af honey bee larve dødelighed^21,22,23 og tilstedeværelse af “entombed pollen” inden for kolonier, som selv ikke-giftige, er blottet for mikrobielle aktivitet og er ernæringsmæssigt kompromitteret²⁴. På trods af at fungicider har længe været betragtet “bee-safe”, der er nu beviser at eksponering for fungicid alene kan forårsage alvorlige koloni tab i en native bumble bee arter, Bombus impatiens²⁵.

For at fastslå kausalitet mellem fungicid eksponering og koloni dødelighed, modus operandi af disse kemikalier skal bestemmes. Som det fremgår i jord²⁶, sedimenter²⁷og vandmiljøer²⁸, ved at målrette svampe, fungicider sandsynligvis ændre svampe overflod og mangfoldighed inden for pollen-bestemmelser, hvorved påberåbe sig et større fællesskab Skift kan kraftigt favoriserer bakterier. Uden svampe konkurrenter eller antagonister, visse sygdomsfremkaldende bakterier kan formere sig relativt ukontrolleret, lette fordærv af pollen-bestemmelser. Tidligere forskning har vist, at mikroorganismer, især gær og filamentøs svampe, tjene som ernæringsmæssige symbionter for bier^29,30,31, beskytte mod parasitter og patogener^{32 ,33}, og levere langsigtet bevaring af pollen butikker. Fungicider, derfor kan indirekte skade umodne bier ved at forstyrre den mikrobielle samfund, der er nødvendige for at yde disse tjenester og/eller ved at øge modtagelighed for opportunistiske patogener og parasitter¹². Afgrøder på verdensplan ligger med stigende krav til fødevareproduktion, er der sprøjtes hvert år med fungicider under flor, hvilket understreger behovet for at forstå omfanget af sådanne fungicid-inducerede effekter.

Til dato, de primære viden huller vedrørende indfødte bee mikrobiel økologi kan være repræsenteret af følgende spørgsmål: i hvilket omfang ændrer fungicid den mikrobielle samfund i bee pollen-bestemmelserne? Hvad er downstream konsekvenserne af indtagelse af pollen med et dybt ændrede mikrobielle samfund? I overensstemmelse med disse økologisk germane spørgsmål, eksperimenter blev udviklet med de primære mål med at afsløre 1) at fungicid rester alene kan forårsage alvorlige koloni fald i en native bee arter; 2) graden som mikrobielle samfund i pollen-bestemmelser er ændret af fungicider og 3) hvordan biers sundhed påvirkes af en alvorligt ændrede mikrobielle samfund. De eksperimentelle mål blev defineret for at løse de ovenstående spørgsmål ved hjælp af en kombination af laboratorie – og felt-baserede eksperimenter. Ved hjælp af state-of-the-art metagenomic og molekylærbiologiske teknikker sammen med traditionelle metoder til feltet bemærkning, denne forskning har til formål at sammenstykke de potentielle virkninger af fungicider på biers sundhed.

Det første mål for denne undersøgelse er at vise at fungicid eksponering alene kan forårsage betydelige koloni tab blandt indfødte bee arter. En undersøgelse, der involverer store felt bure blev brugt til at undersøge virkningerne af fungicid eksponering på koloni vækst af Bombus impatiens, en allestedsnærværende, rigelige indfødte bi i USA (figur 1, figur 2, figur 3). Det var en hypotese at fungicid behandlet nældefeber ville præsentere lavere fitness og atypiske demografi i forhold til ikke-eksponerede nældefeber. Data fra dette eksperiment støttet denne hypotese, at fungicid restkoncentrationer i pollen kan være den eneste årsag til dyb koloni tab i en native bumble bee arter²⁵. Det andet formål med denne undersøgelse er at undersøge svar af pollen microbiome fungicid eksponering. Det er en hypotese, at Fællesskabet sammensætningen af mikrober i pollen-bestemmelser udsat for fungicider vil være forskellig fra ubehandlet pollen. Mens svampe overflod og mangfoldighed forventes at falde betydeligt, vil bakterier og/eller en enkelt dominerende svampe arter sandsynligvis vokse ukontrolleret i fravær af andre konkurrerende svampe. Gennem en række in vivo forsøg, vil disse forskydninger i mikrobielle samfund sammensætning blive analyseret ved hjælp af metagenomics.

Protocol

1. undersøge effekten af fungicid eksponering på Bumble Bee koloni succes ved hjælp af felt bur forsøg sæt op ti mesh bure i et felt, der er beplantet med havre. Grave en grøft omkring hvert bur, og grave alle fire kanter af trådnet bur i jorden for at sikre, at bierne ikke kan undslippe. Stock bure med potteplanter, blomstrende planter, der er kendt for at være attraktive for bier (fx boghvede, Hjulkrone, alyssum, cosmos og solsikker) ( figur 2). Supple…

Representative Results

Felt bur undersøgelse: Data fra bur forsøg viste, at bumble bee kolonier havde en betydelig reaktion på fungicid eksponering. Fungicid behandlet staderne produceret betydeligt færre arbejdstagere (12,2 ± 3.8, gennemsnit ± SE) end kontrol nældefeber (43,2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (figur 4). Derudover var bee biomasse af fungicid behandlet nældefeber (0,…

Discussion

Undersøgelser af virkningerne af fungicider på biers sundhed er forblevet et forsømt aspekt af skadedyr strategier. Vores undersøgelse har til formål at slå bro over denne videnskløft, ved hjælp af en suite af supplerende teknikker, som udtrykkeligt isolere de potentielle faktorer køre bee falder. Planlægning, rationale og gengivelse af disse eksperimenter er nærmere beskrevet nedenfor.

Det er vigtigt at sikre, at ingen bier er tilladt at undslippe mesh bur eksperimenter, da dette v…

Materials

Natupol Beehive	Koppert	USRESM1	16 hives
Propiconazole 14.3	Quali-Ppro	60207-90-1	Propiconazole 14.3%
Abound	Syngenta	4033540	Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil	Syngenta	3452	Fungicide used for trials
Pollen granules	Bee rescued	B004D5650C	3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation	Currie Lab
Yeast strains for inoculation	Hittinger lab
Primer pairs	UW Biotech Center
DNA Isolation Kit	Mo Bio	12830-50	Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851	DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX	Thermo Fisher	4472952	Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System	Bio Rad	1855196	Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,	Axygen	10159-696	Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit	Agilent	5067-1504	Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer	Illumina		Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)	VWR