Summary

Empiriske, Metagenomic og beregningsmæssige teknikker belyse mekanismerne af som fungicider kompromis biers sundhed

Published: October 09, 2017
doi:

Summary

Mikrobielle konsortier i bumble bee nældefeber berige og bevare pollen til bee larver. Ved hjælp af næste generation sequencing, laboratorium og feltbaseret eksperimenter, beskriver dette manuskript protokoller, der bruges til at teste hypotesen at fungicid restkoncentrationer alter pollen microbiome og koloni demografi, i sidste ende fører til kolonien tab.

Abstract

Avlere bruger ofte fungicid sprays under flor til at beskytte afgrøderne mod sygdom, hvilket udsætter bier fungicid restprodukter. Selvom betragtes som “bee-safe”, er der montering beviser at fungicid restkoncentrationer i pollen er forbundet med bee falder (for både honning og bumble bee arter). Mekanismerne er stadig relativt ukendt, har forskere spekuleret på, at bi-mikrobe symbioser er involveret. Mikrober spiller en central rolle i bevarelsen og/eller forarbejdning af pollen, der tjener som ernæring for larver bier. Ved at ændre den mikrobielle samfund, er det sandsynligt, at fungicider forstyrre disse mikrobe-medieret tjenester, og dermed kompromittere biers sundhed. Dette manuskript beskriver de protokoller, der bruges til at undersøge de indirekte mekanismer som fungicider kan være årsag koloni tilbagegang. Bur forsøg udsætter bier til fungicid behandlet blomster har allerede givet de første beviser at fungicider forårsage dybe koloni tab i en native humlebi (Bombus impatiens). Ved hjælp af felt-relevante doser af fungicider, en serie af eksperimenter har udviklet for at give en finere beskrivelse af mikrobielle samfund dynamics fungicid-eksponerede pollen. Forskydninger i de strukturelle sammensætning af svampe- og bakterieinfektioner assemblager inden for pollen microbiome er undersøgt af næste generation sequencing og metagenomic analyse. Eksperimenter udviklet heri har været designet til at give en mekanistisk forståelse af hvordan fungicider påvirker microbiome pollen-bestemmelser. I sidste ende, disse resultater bør kaste lys over den indirekte vej hvorigennem fungicider kan være årsag koloni falder.

Introduction

Forvaltes og vilde bee arter oplever udbredt afvisninger, med store konsekvenser for både naturlige og landbrugs-systemer1. Trods samordnet indsats for at forstå årsagerne til dette problem, er de faktorer, der styrer honey bee falder stadig ikke godt forstået2,3,4. For visse arter af vilde, native bier, er situationen blevet dire5,6. Hvis bibestandene ikke kan opretholdes, når de skærer hinanden med industrielt landbrug, deres befolkninger vil fortsætte med at falde, og de afgrøder, der kræver bestøvere (35% af verdensomspændende produktion7) vil udholde reduceret høst.

Mens mange potentielle faktorer såsom pesticider eksponering, har sygdom og habitat tab1,4,8,9,10 været impliceret i honey bee tilbagegang, relativt er lidt kendt om interaktive effekten af disse stressfaktorer på native bier sundhed, inden for eller i nærheden af landbrugssystemer. Mange nuværende forskningsindsatsen fortsat fokusere på insekticider, (fx, neonicotinoids11,12), selvom tidligere forskning indikerer at fungicider også kan spille en rolle i bee tilbagegang ved at forringe hukommelsen dannelse, olfaktoriske reception13, reden anerkendelse14, enzymaktivitet og metaboliske funktioner15,16,17. Globalt, fortsat fungicider anvendes på blomstring afgrøder under flor. Nylige undersøgelser har dokumenteret, at bier almindeligt bringe fungicid rester tilbage til bikuben18, faktisk, undersøgelser har vist en stor del af testede nældefeber indeholdt fungicid restkoncentrationer19,20. Yderligere arbejde har afsløret at fungicid rester er forbundet med høje priser af honey bee larve dødelighed21,22,23 og tilstedeværelse af “entombed pollen” inden for kolonier, som selv ikke-giftige, er blottet for mikrobielle aktivitet og er ernæringsmæssigt kompromitteret24. På trods af at fungicider har længe været betragtet “bee-safe”, der er nu beviser at eksponering for fungicid alene kan forårsage alvorlige koloni tab i en native bumble bee arter, Bombus impatiens25.

For at fastslå kausalitet mellem fungicid eksponering og koloni dødelighed, modus operandi af disse kemikalier skal bestemmes. Som det fremgår i jord26, sedimenter27og vandmiljøer28, ved at målrette svampe, fungicider sandsynligvis ændre svampe overflod og mangfoldighed inden for pollen-bestemmelser, hvorved påberåbe sig et større fællesskab Skift kan kraftigt favoriserer bakterier. Uden svampe konkurrenter eller antagonister, visse sygdomsfremkaldende bakterier kan formere sig relativt ukontrolleret, lette fordærv af pollen-bestemmelser. Tidligere forskning har vist, at mikroorganismer, især gær og filamentøs svampe, tjene som ernæringsmæssige symbionter for bier29,30,31, beskytte mod parasitter og patogener32 ,33, og levere langsigtet bevaring af pollen butikker. Fungicider, derfor kan indirekte skade umodne bier ved at forstyrre den mikrobielle samfund, der er nødvendige for at yde disse tjenester og/eller ved at øge modtagelighed for opportunistiske patogener og parasitter12. Afgrøder på verdensplan ligger med stigende krav til fødevareproduktion, er der sprøjtes hvert år med fungicider under flor, hvilket understreger behovet for at forstå omfanget af sådanne fungicid-inducerede effekter.

Til dato, de primære viden huller vedrørende indfødte bee mikrobiel økologi kan være repræsenteret af følgende spørgsmål: i hvilket omfang ændrer fungicid den mikrobielle samfund i bee pollen-bestemmelserne? Hvad er downstream konsekvenserne af indtagelse af pollen med et dybt ændrede mikrobielle samfund? I overensstemmelse med disse økologisk germane spørgsmål, eksperimenter blev udviklet med de primære mål med at afsløre 1) at fungicid rester alene kan forårsage alvorlige koloni fald i en native bee arter; 2) graden som mikrobielle samfund i pollen-bestemmelser er ændret af fungicider og 3) hvordan biers sundhed påvirkes af en alvorligt ændrede mikrobielle samfund. De eksperimentelle mål blev defineret for at løse de ovenstående spørgsmål ved hjælp af en kombination af laboratorie – og felt-baserede eksperimenter. Ved hjælp af state-of-the-art metagenomic og molekylærbiologiske teknikker sammen med traditionelle metoder til feltet bemærkning, denne forskning har til formål at sammenstykke de potentielle virkninger af fungicider på biers sundhed.

Det første mål for denne undersøgelse er at vise at fungicid eksponering alene kan forårsage betydelige koloni tab blandt indfødte bee arter. En undersøgelse, der involverer store felt bure blev brugt til at undersøge virkningerne af fungicid eksponering på koloni vækst af Bombus impatiens, en allestedsnærværende, rigelige indfødte bi i USA (figur 1, figur 2, figur 3). Det var en hypotese at fungicid behandlet nældefeber ville præsentere lavere fitness og atypiske demografi i forhold til ikke-eksponerede nældefeber. Data fra dette eksperiment støttet denne hypotese, at fungicid restkoncentrationer i pollen kan være den eneste årsag til dyb koloni tab i en native bumble bee arter25. Det andet formål med denne undersøgelse er at undersøge svar af pollen microbiome fungicid eksponering. Det er en hypotese, at Fællesskabet sammensætningen af mikrober i pollen-bestemmelser udsat for fungicider vil være forskellig fra ubehandlet pollen. Mens svampe overflod og mangfoldighed forventes at falde betydeligt, vil bakterier og/eller en enkelt dominerende svampe arter sandsynligvis vokse ukontrolleret i fravær af andre konkurrerende svampe. Gennem en række in vivo forsøg, vil disse forskydninger i mikrobielle samfund sammensætning blive analyseret ved hjælp af metagenomics.

Protocol

1. undersøge effekten af fungicid eksponering på Bumble Bee koloni succes ved hjælp af felt bur forsøg sæt op ti mesh bure i et felt, der er beplantet med havre. Grave en grøft omkring hvert bur, og grave alle fire kanter af trådnet bur i jorden for at sikre, at bierne ikke kan undslippe. Stock bure med potteplanter, blomstrende planter, der er kendt for at være attraktive for bier (fx boghvede, Hjulkrone, alyssum, cosmos og solsikker) ( figur 2). Supple…

Representative Results

Felt bur undersøgelse: Data fra bur forsøg viste, at bumble bee kolonier havde en betydelig reaktion på fungicid eksponering. Fungicid behandlet staderne produceret betydeligt færre arbejdstagere (12,2 ± 3.8, gennemsnit ± SE) end kontrol nældefeber (43,2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (figur 4). Derudover var bee biomasse af fungicid behandlet nældefeber (0,…

Discussion

Undersøgelser af virkningerne af fungicider på biers sundhed er forblevet et forsømt aspekt af skadedyr strategier. Vores undersøgelse har til formål at slå bro over denne videnskløft, ved hjælp af en suite af supplerende teknikker, som udtrykkeligt isolere de potentielle faktorer køre bee falder. Planlægning, rationale og gengivelse af disse eksperimenter er nærmere beskrevet nedenfor.

Det er vigtigt at sikre, at ingen bier er tilladt at undslippe mesh bur eksperimenter, da dette v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatter eller forfattere takke University of Wisconsin bioteknologi Center DNA-sekventering facilitet for forstærkning og sekventering faciliteter og tjenester, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto og Max Haase teknisk bistand med Molekylær analyse. Dette arbejde blev støttet af USDA-Agricultural Research Service bevilgede midler (nuværende forskning Information System #3655-21220-001). Yderligere støtte blev leveret fra National Science Foundation (under Grant nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes bioenergi Research Center (DOE kontor for videnskab BER DE-FC02-07ER64494), og USDA National Institute for fødevarer og landbrug (Hatch projekt 1003258). C.T.H. er en Pew forsker i den biomedicinske videnskaber og en Alfred Toepfer Fakultet Fellow, støttet af Pew Charitable Trusts og Alexander von Humboldt-stiftelsen, henholdsvis.

Materials

Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

References

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines?. Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -. M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? – A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. “Entombed Pollen”: A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -. Y., Ho, C. -. H., Lin, C. -. J., Lo, C. -. C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency?. Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf (2010)
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  42. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  43. Team, R. C. . R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , (2015).
  44. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  45. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  46. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  47. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  48. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  49. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  50. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  51. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  52. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  53. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  54. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  55. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals?. Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Play Video

Cite This Article
Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

View Video