Mikrobiell konsortier inom bumble bee bikupor berika och bevara pollen för bee larver. Detta manuskript med nästa generations sekvensering, tillsammans med laboratorium och fältbaserade experiment, och beskriver protokoll som används för att testa hypotesen att fungicid rester förändra pollen microbiom, och kolonin demografi, vilket slutligen leder till kolonin förlust.
Odlare använder ofta fungicid sprayer under Blom för att skydda grödor mot sjukdomen som exponerar bina att fungicid rester. Även om anses ”bee-safe”, finns det montering bevis att fungicid rester i pollen är förknippade med bee nedgång (för både honung och bumble bee arter). Medan mekanismerna är fortfarande relativt okänt, har forskare spekulerat att bee-mikrob Symbiosar är inblandade. Mikrober spelar en central roll i bevarandet eller bearbetning av pollen, som fungerar som näring för larval bin. Genom att förändra mikrobiell gemenskapen, är det troligt att fungicider störa dessa mikrob-medierad tjänster, och därmed äventyra bihälsa. Detta manuskript beskriver de protokoll som används för att undersöka de indirekta mekanismerna som fungicider som orsakar kolonin nedgång. Cage experiment utsätta bina att fungicid-behandlade blommor har redan lämnat det första beviset att fungicider orsaka djupgående kolonin förluster i en native humla (Bombus impatiens). Använder fältet-relevanta doser av fungicider, en serie experiment har utvecklats för att ge en finare Beskrivning av mikrobiell gemenskapens dynamik av fungicid-exponerade pollen. Förskjutningar i strukturella sammansättning av svamp och bakteriella konstellationer inom den pollen mikrobiomet utreds av nästa generations sekvensering och gjorts analys. Experiment som framkallade häri har utformats för att ge en mekanistisk förståelse av hur fungicider påverkar mikrobiomet pollen-bestämmelser. Slutligen, dessa fynd bör belysa den indirekta vägen genom vilken fungicider som orsakar kolonin nedgångar.
Hanteras och vilda bee arter upplever utbredda nedgångar, med stora konsekvenser för både naturliga och jordbruks system1. Trots gemensamma ansträngningar för att förstå orsakerna till problemet, är de faktorer som driver honey bee minskar fortfarande inte förstådda2,3,4. För vissa arter av vilda, inhemska bin, har situationen blivit ödesdigra5,6. Om bisamhällena inte kan upprätthållas när de skär med industriellt jordbruk, deras befolkningar kommer att fortsätta att falla och de grödor som kräver pollinatörer (35% av världsproduktionen7) kommer att uthärda minskade skördar.
Medan många potentiella faktorer såsom bekämpningsmedel exponering, sjukdom och livsmiljö förlust1,4,8,9,10 har varit inblandade i honey bee nedgång, relativt är lite känt om interaktiva effekten av dessa stressfaktorer på inhemska bin hälsa, inom eller nära jordbrukssystem. Många aktuella forskningsinsatser fortsätta att fokusera på insektsmedel, (t.ex., neonicotinoids11,12), även om tidigare forskning visar att fungicider kan också spela en roll i bee nedgång genom att försämra minnesbildning, Olfactory receptionen13, boet erkännande14, enzymaktivitet och metaboliska funktioner15,16,17. Globalt, fortsätta fungicider att tillämpas på blommande grödor under bloom. Nyare studier har dokumenterat att bina tar vanligen fungicid rester tillbaka till kupan18, i själva verket, studier har visat en stor andel av testade nässelutslag innehöll fungicid rester19,20. Ytterligare arbete har visat att fungicid rester är associerade med höga honey bee larval dödlighet21,22,23 och förekomsten av ”entombed pollen” inom kolonier, som även icke-toxisk, saknar mikrobiell aktivitet och är näringsmässigt komprometterad24. Trots att fungicider har länge ansetts vara ”bee-safe”, finns nu bevis att exponering för fungicid ensam kan orsaka svår kolonin förluster i en native bumble bee art, Bombus impatiens25.
För att fastställa orsakssamband mellan fungicid exponering och kolonin dödlighet, det modus operandi av dessa kemikalier behöver fastställas. Som framgår i jordar26, sediment27och vattenmiljöer28, genom att rikta svampar, fungicider troligen förändra svamp överflöd och mångfalden inom pollen-bestämmelser, därmed åberopa en större gemenskap SKIFT som kan starkt gynna bakterier. Utan svamp konkurrenter eller antagonister, kan vissa patogena bakterier föröka relativt oskyddad, underlätta nedbrytning av pollen-bestämmelser. Tidigare forskning har visat att mikroorganismer, särskilt jäst och filamentösa svampar, tjäna som näringsmässiga symbionter för bin29,30,31, skyddar mot parasiter och patogener32 ,33, och ger långsiktigt bevarande av pollen butiker. Fungicider, kan därför indirekt skada omogna bina genom att störa mikrobiell gemenskapen som behövs för att tillhandahålla dessa tjänster och/eller genom att öka känsligheten för opportunistiska patogener och parasiter12. Med ökande krav på livsmedelsproduktion, är grödor i världen att besprutas varje år med fungicider under Blom, vilket understryker behovet av att förstå omfattningen av sådana fungicid-inducerad effekter.
Till-datum, de primära kunskapsluckorna som avser inhemska biet mikrobiell ekologi kan representeras av följande frågor: i vilken utsträckning ändrar fungicid mikrobiell gemenskapen inom bee pollen-bestämmelser? Vad är nedströms effekterna av konsumerar pollen med en djupt förändrade mikrobiell gemenskap? I linje med dessa ekologiskt nära förbunden frågor, framkallades experiment med de primära målen för att avslöja 1) som fungicid rester ensam kan orsaka svår kolonin nedgång i en native bee arter. 2) graden som mikrobiella samhällen i pollen-bestämmelser ändras med fungicider, och 3) hur binas hälsa påverkas av en kraftigt förändrad mikrobiell gemenskap. De experimentella mål definierades för att ta itu med ovanstående frågor med en kombination av laboratorium och fält-baserade experiment. Använda state-of-the-art gjorts och molekylärbiologiska metoder parallellt med traditionella metoder för fältet observation, syftar denna forskning till att pussla ihop de potentiella effekterna av fungicider på bihälsa.
Det första syftet med denna studie är att visa att fungicid exponering ensam kan orsaka betydande kolonin förluster bland infödda bee arter. En studie på stora fältet burar användes för att undersöka effekterna av fungicid exponering på kolonin tillväxten av Bombus impatiens, en allestädes närvarande, riklig infödda bee i USA (figur 1, figur 2, figur 3). Det antogs att fungicid-behandlade bikupor skulle presentera lägre fitness och atypiska demografi jämfört med icke-exponerade nässelutslag. Data som erhållits från detta experiment stödde denna hypotes, visar att fungicid rester inom pollen kan vara den enda orsaken till djupgående kolonin förluster i en native bumble bee arter25. Det andra syftet med denna studie är att undersöka den pollen mikrobiomet svar på fungicid exponering. Det är en hypotes om att annan obehandlad pollen gemenskapen sammansättningen av mikrober inom pollen-bestämmelserna utsätts för fungicider. Medan svamp populationsstorlek och mångfald väntas minska kraftigt, bakterier eller en enda dominerande svamp art kommer sannolikt att växa okontrollerat i avsaknad av andra konkurrerande svampar. Genom en serie av in vivo – studier, kommer att dessa förskjutningar i mikrobiell gemenskapen sammansättning analyseras med metagenomik.
Undersökningar om effekterna av fungicider på bins hälsa förblivit en understudied aspekt av pest förvaltningsstrategier. Vår studie syftar till att överbrygga denna kunskap med hjälp av en uppsättning kompletterande tekniker som uttryckligen isolerar de potentiella faktorer som driver bee nedgångar. Planering, logik, och rendering av dessa experiment beskrivs nedan.
Det är viktigt att säkerställa att inga bin tillåts fly maskorna bur experimenten, eftersom detta skulle äventyra…
The authors have nothing to disclose.
Författaren tackar University of Wisconsin bioteknik Center DNA sekvensering anläggningen för förstärkning och sekvensering faciliteter och tjänster, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto och Max Haase för tekniskt stöd med Molekylär analys. Detta arbete stöds av USDA-Agricultural Research Service avsatt medel (nuvarande forskning Information System #3655-21220-001). Ytterligare stöd tillhandahölls av National Science Foundation (under Grant nr DEB-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office av vetenskap BER DE-FC02-07ER64494), och USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk (Hatch projektet 1003258). C.T.H. är en Pew lärd i biomedicinsk vetenskap och en Alfred Toepfer fakulteten Fellow, stöds av de Pew Charitable Trusts och Alexander von Humboldt-stiftelsen, respektive.
Natupol Beehive | Koppert | USRESM1 | 16 hives |
Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
Abound | Syngenta | 4033540 | Azoxystrobin 22.9% |
Chlorothalonil | Syngenta | 3452 | Fungicide used for trials |
Pollen granules | Bee rescued | B004D5650C | 3X 16oz bottles, pollen for trials |
Bacterial strains for inoculation | Currie Lab | ||
Yeast strains for inoculation | Hittinger lab | ||
Primer pairs | UW Biotech Center | ||
DNA Isolation Kit | Mo Bio | 12830-50 | Commercial DNA isolation kit |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification tool |
Select Master Mix for CFX | Thermo Fisher | 4472952 | Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye. |
Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855196 | Instrument used for PCR amplification |
PCR Clean-Up Kit, | Axygen | 10159-696 | Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes |
DNA 1000 Kit | Agilent | 5067-1504 | Used for sizing and analysis of DNA fragments |
MiSeq Sequencer | Illumina | Used for next-generation sequencing | |
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) | VWR |