Abstract
Déviations de niveaux et les modes de jeu de cisaillement des rôles importants dans la physiologie des fluides vasculaires vasculaires et physiopathologie normales en induisant adaptative ainsi que des changements pathologiques dans le phénotype endothélial et l'expression génique. En particulier, les effets dysfonctionnels de périodiques, flux unidirectionnel contrainte de cisaillement induite peuvent déclencher une variété d'effets sur plusieurs types de cellules vasculaires, en particulier les cellules endothéliales. Alors que maintenant les cellules endothéliales d'origines anatomiques diverses ont été cultivées, des analyses approfondies de leurs réponses au cisaillement de fluide ont été entravés par la complexité relative des modèles de cisaillement (par exemple, la chambre d'écoulement à plaques parallèles, le cône et le modèle d'écoulement de la plaque). Bien que ces approches représentent tous excellents, ces modèles sont techniquement complexes et des inconvénients, y compris relativement long et complexe le temps d'installation, les zones de surface faible, les exigences pour les pompes et pressurisation nécessitant souvent des produits d'étanchéité et des joints, ce qui crée des défis à both maintien de la stérilité et une incapacité à exécuter plusieurs expériences. Toutefois, si les modèles de débit plus élevés de flux et de cisaillement étaient disponibles, plus de progrès sur les réponses de cisaillement endothéliales vasculaires, la recherche de cisaillement particulièrement périodique au niveau moléculaire, peut-être plus rapidement avancé. Ici, nous décrivons la construction et l'utilisation des anneaux de cisaillement: un roman, simple à assembler, et peu coûteux modèle de culture de tissu avec une relativement grande surface qui permet facilement d'un nombre élevé de répétitions expérimentales unidirectionnels, cisaillement périodique des études de stress sur cellules endotheliales.
Introduction
La contrainte de cisaillement du fluide a été montré pour moduler les programmes de gènes endothéliaux : 1 - 5 par l' activation des éléments cis-régulateurs 6, l' activité histone acétyltransférase 7 et des éléments de réponse de contrainte de cisaillement (8 SSRE). Cisailler les influences des contraintes apports endotheliales vers la coagulation par la modulation du facteur tissulaire 9 et de l' activateur tissulaire du plasminogène (tPA) 10 l' expression. La contrainte de cisaillement influe également sur le contrôle de l' angiogenèse 11 et le remodelage vasculaire en régulant la synthèse PDGF-B et la réactivité 8. Le endothéliales dérivé des médiateurs vasoactifs adrénomédulline, endothéline-1, urotensine II et relaxine sont également réglementés par cisaillement 12. La transcription de la production d' oxyde nitrique synthase endothéliale et la production d'oxyde nitrique sont tous les deux dépendants 10 de cisaillement. Shear contrôle également endothéliale ICAM-1 expression 13. contrainte de cisaillement induite par Flow-peut donc powerfuinfluencer lly une grande variété de réponses endothéliales. Surtout, les pulsations vasculaires maintenant semblent également jouer un rôle important dans la physiopathologie de la fois le vieillissement vasculaire normal et les formes de démence vasculaire 14 et peuvent même contribuer à d' autres maladies neurodégénératives telles que la sclérose en plaques 15.
Veineuses et artérielles cellules endothéliales sont intrinsèquement exposés à divers modes d'écoulement hémodynamiques in vivo, et de nombreux différents phénotypes de cellules endotheliales peuvent être exposés 16. Selon l'ampleur et la périodicité des flux, les effets sur les cellules endothéliales peuvent inclure l' activation des cellules inflammatoires et l' apoptose, ce qui peut refléter les changements dans le gène ou l' expression des protéines 17,18. Les études sur les réponses des cellules endothéliales au cisaillement phénomènes restent donc compliquée par les difficultés dans la production des modèles in vitro qui produisent de manière adéquate ces modèles de cisaillement.
Beaucoup experime différentsprotocoles NTAL ont été développés pour appliquer une contrainte de cisaillement de fluide endothéliales monocouches de cellules. L' un des systèmes les plus couramment utilisés est la chambre d'écoulement à plaques parallèles, ce qui crée un écoulement laminaire uniforme au sein de la chambre 19 - 21. Une pompe péristaltique est généralement connecté pour créer un flux périodique, qui peut récapituler les caractéristiques d'écoulement généralement trouvés dans de nombreux endroits in vivo 22. Un autre set-up commun utilise le modèle de cône et de la plaque », où la contrainte de cisaillement du fluide est déterminée par la vitesse du cône 23 de rotation. Les deux systèmes, et d'autres arrangements semblables à elles, peuvent être fastidieux à mettre en place et nécessitent des composants qui peuvent être relativement coûteux et inaccessibles à de nombreux laboratoires.
Une autre limitation majeure de ces modèles actuels est le nombre relativement faible d'études répétées qui peuvent être exécutées simultanément, chacun avec une surface relativement faible. Cela augmente le temps et le co mplexity de telles approches. Par conséquent, un modèle idéal qui induit un cisaillement unidirectionnel et périodique pourrait être celui où un grand nombre de répétitions de l'étude peut être facilement mis en place, chacun avec une relativement grande surface. En outre, les modèles mentionnés ci-dessus nécessitent une configuration assez sophistiqué, qui peut être un coût prohibitif pour de nombreux utilisateurs. Un modèle qui peut produire des perturbations de cisaillement de fluide en utilisant des matériaux de laboratoire de base pourrait avoir plusieurs avantages.
Une méthode simple et très économique d'application unidirectionnelle contrainte de cisaillement, périodique implique le placement de plats circulaires sur un agitateur orbital 24. Ce protocole est très simple et peut être étendu pour atteindre le nombre élevé d'études se réplique, chacun avec une relativement grande surface, au besoin. Cependant, les cellules situées dans le centre du plat sont exposés à différents modèles de flux de cellules le long de la périphérie, ce qui donne des réponses phénotypiques cellulaires mixtes dans le même plat.
_content "> Dans ce rapport, nous décrivons la construction et l'utilisation des« anneaux de cisaillement », notre modèle pour la création d'une contrainte de cisaillement unidirectionnel et périodique. La conception de l'anneau de cisaillement efficacement phénotypes induits par cisaillement cellulaires« mixtes »limites en limitant le flux voie dans une boîte de culture circulaire à la périphérie par le placement d'une bague intérieure. la construction et l'exploitation de l'anneau de cisaillement est simple et économique et peut être facilement mis à l'échelle pour accueillir une large gamme de secoueurs orbitaux en utilisant largement disponibles fournitures de culture de tissus. Cette modèle peut être appliqué dans des expériences de cellules endothéliales pour fournir des modèles d'écoulement continues et périodiques à des niveaux physiologiques et physiopathologiques.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Construction de 150 mm Diamètre de cisaillement Anneaux (Figure 1)
REMARQUE: Les anneaux de cisaillement peuvent être construits de manière à créer de nombreuses dimensions différentes en faisant varier les dimensions de Petri plat extérieur et intérieur, ce qui entraîne dans des dispositifs ayant des zones de surface totale, le rendement de la cellule et mis au point des gammes de forces de cisaillement. Ce rapport décrit une boîte de 150 mm combiné à un plat interne de 100 mm pour une surface totale de 98 cm 2 (Figure 2).
Figure 1. Shear ensemble de bague. La partie supérieure de la figure montre un anneau de cisaillement partiellement assemblé. Injecter 0,5 ml de chlorure de méthylène à travers le trou de 3 mm avec une pipette de transfert si un joint d'étanchéité n'a pas complètement formé entre les boîtes intérieure et extérieure. L'anneau de cisaillement est scellé fermé en appliquant un cordon épais de 1 mm d'adhésif de caoutchouc de silicone autour de la edg intérieuree de la partie supérieure de l'anneau de cisaillement. La partie inférieure de la figure montre l'anneau de cisaillement assemblé. Le bleu représente la zone des cellules endothéliales plaquées. Les flèches rouges extérieurs et intérieurs indiquent le mouvement orbital de la bague de cisaillement et des médias à l' intérieur de l'anneau de cisaillement lorsqu'il est placé sur un agitateur orbital. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Mesures de surface pour un anneau de cisaillement de 150 mm (non dessinée à l' échelle). Le panneau supérieur montre décalage centrifuge de fluide vers anneau extérieur en réponse à la rotation orbitale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Créer un modèle de construction de l'anneau de cisaillement en générant un150 mm profil de bord extérieur dans le logiciel de présentation d'un diamètre interne de 100 mm placé au centre du cercle de 150 mm. Imprimez le modèle sur une feuille de papier blanc A4.
- Pipeter 10 ml de chlorure de méthylène (dichlorométhane) dans une boîte de Pétri de 150 mm de verre. Il est essentiel que le plat est du verre et non le polystyrène (ou autre matière plastique vinylique), tel que le chlorure de méthylène, solubilise la plupart des plastiques et est utilisé ici pour joindre des composants en plastique.
ATTENTION: Utiliser des gants pour toute construction avec une ventilation de la hotte adéquate. Le chlorure de méthylène est un irritant de contact et est hépatotoxiques. - Alignez un 150 mm plat en plastique de Pétri sur le modèle de bague de cisaillement externe.
- Percez un trou de 3 mm dans le centre d'un plat de 100 mm à l'aide d'un outil rotatif. Retirez tous les copeaux de plastique produites à partir du forage.
- Tout en tenant avec une main gantée, inverser et tremper le bord supérieur de la boîte de 100 mm de Pétri de l'étape précédente dans la piscine de chlorure de méthylène pendant environ 3 sec.
- Transfer le "mouillé" boîte de 100 mm de bord vers le bas sur le centre d'une boîte de 150 mm, en alignant soigneusement le plat de 100 mm sur le modèle marqué. Le chlorure de méthylène fondra le plastique, reliant les plats de 100 mm et 150 mm. Tournez doucement le plat de 100 mm dans le sens horaire et antihoraire quelques fois pour assurer une bonne adhérence à la boîte de 150 mm.
REMARQUE: Prenez grand soin pour assurer un bon alignement de la cuvette intérieure au centre du plat externe. alignement Excentrique peut entraîner des variations de la contrainte de cisaillement à différents endroits dans l'anneau de cisaillement. Prenez soin de ne pas laisser le chlorure de méthylène goutter accidentellement sur la partie de la piste extérieure du plat de 150 mm de Pétri pendant le placement du plat de 100 mm. Cela va faire fondre la matière plastique sur la surface inférieure dans laquelle les cellules se développent, créant une surface irrégulière qui peut provoquer des perturbations de l'écoulement. - Une fois que le chlorure de méthylène a séché, retourner les boîtes de Pétri nouvellement liés sur et inspecter soigneusement les points de contact pour veiller à ce queun joint étanche est formé entre les deux boîtes de Petri.
- Si un joint étanche n'a pas complètement formé, injecter 0,5 ml de chlorure de méthylène à travers le trou de 3 mm avec une pipette de transfert. Ramassez le plat et faites pivoter doucement pour permettre au chlorure de méthylène pour atteindre le bord.
NOTE: Si une rotation trop rapide, le chlorure de méthylène peut se répandre dans la partie extérieure de la boîte de 150 mm, la déformation de la surface où les cellules vont croître et de ruiner la bague de cisaillement. Fuites anneaux de cisaillement doivent être jetés. - Fermer hermétiquement le trou dans le plat de 100 mm en appliquant un cordon de 3 mm d'étanchéité en caoutchouc de silicone.
- L'utilisation d'un outil rotatif équipé d'une tête de coupe plat, couper la partie d'un tube de culture tissulaire en polystyrène de 15 ml conique supérieure à 3 cm, en laissant au moins 1 cm du tube en dessous du bouchon. Polonais le bord du tube de coupe jusqu'à ce que lisse et plat en utilisant le côté plat de la tête de coupe. Retirez tous les copeaux de plastique produits par broyage.
- Tracer les couper 15 ml tube conique sur lele couvercle de la boîte de 150 mm avec un marqueur, d'environ 0,5 cm à une distance du bord du plat. Percer un trou à l'intérieur du cercle tracé, laissant une marge d'environ 1-2 mm à partir du bord du cercle.
- Placez le haut du tube conique coupé sur le trou foré. En utilisant une pipette de transfert, appliquer environ 250 pi de chlorure de méthylène, sur les bords coupés du tube conique pour lier le tube conique du couvercle 150 mm.
- Sceller le 150 mm couvercle sur le plat de 150 mm en appliquant un cordon épais de 1 mm d'étanchéité en caoutchouc de silicium autour du bord intérieur de la boîte de Petri supérieure.
2. Stérilisation des Anneaux de cisaillement
- Pipet environ 10 ml de solution saline tamponnée phosphate dans l'anneau de cisaillement nouvellement formée par la 15 ml port tube conique. Agiter autour pour enlever tous les débris à l'intérieur de l'anneau de cisaillement. Retirez le tampon phosphate salin avec une pipette Pasteur / vide aspirateur.
- Répétez l'étape précédente jusqu'à ce que les débris soient enlevés.
- Pour Sterilize la bague de cisaillement, utilisez une combinaison d'un rinçage à l'éthanol à 70% avec une irradiation UV.
- Dévissez le bouchon à évent, pipette environ 10 ml d'éthanol à 70% par le port d'accès, et visser le bouchon. Tourner et retourner sur les multiples temps de sonnerie de cisaillement, veillant à ce que l'intérieur de l'anneau de cisaillement est soigneusement lavé.
- Sous une hotte, aspirer l'excès de 70% d'éthanol. Avec un flacon pulvérisateur, vaporiser soigneusement le port de plafonnement et d'accès à 70% d'éthanol.
- Placez l'anneau de cisaillement et le chapeau sous rayonnement UV dans le capot de culture de tissu jusqu'à séchage complet.
- Une fois sec, visser le bouchon sur et stocker stérilisée anneaux de cisaillement à la température ambiante jusqu'à utilisation en culture cellulaire placage.
3. Études de contrainte de cisaillement
- Plaquer les cellules endothéliales dans les anneaux de cisaillement stérilisés suivant le protocole de culture de cellules standard en utilisant typiquement un ratio de 1: 4 fendu pour des lignées de cellules endothéliales transformées.
NOTE: Rat microV rétinienneles cellules endothéliales asculaire ont été obtenus dans le commerce. cellules cellules endothéliales cérébrales humaines (hCMEC / D3) ont été fournis comme un don généreux du Dr Pierre-Oliver Couraud (Inserm, France) et ont été cultivées dans un milieu de base endothéliale complet (EBM). - Permettre aux cultures d'atteindre la confluence avant le début des études de flux. Utiliser 30 ml de milieu de culture tissulaire (10% de sérum de veau fœtal, milieu de Eagle modifié par Dulbecco avec 1% de pénicilline / streptomycine / amphotéricine). Changer le milieu de culture de cellules tous les 3 jours et maintenir les cellules à 37 ° C avec 7,5% de CO 2 et de 92,5% d' air ambiant.
- Placez l'agitateur orbital dans l'incubateur.
Note: Agitateurs orbitaux sont généralement lourds (> 10 kg). Placez l'agitateur orbital sur la tablette inférieure de l'incubateur afin de minimiser le stress et durée de vibration. - Placez les anneaux de cisaillement expérimentaux sur l'agitateur orbital. Placez statiques bagues groupe de contrôle de cisaillement dans le même incubateur.
- Estimer la contrainte de cisaillement maximale dans le shboucle d'oreille à l'équation
où 
est le rayon de rotation de l'agitateur orbital (en cm), 
est la viscosité du fluide (en poises), 
est la masse volumique du fluide (en g / ml), et 
est la fréquence de rotation (en tours / seconde) 24. - Initier le réglage de la rotation sur l'agitateur orbital à la vitesse de rotation souhaitée (par exemple 90 tours par minute), ce qui laisse les anneaux de cisaillement sur l'agitateur pendant la durée souhaitée de l' application de la contrainte de cisaillement (par exemple 72 h).
NOTE: Agitateurs orbitaux peuvent produire de la chaleur, de sorte que la température de l'incubateur doit être surveillée initialement pour assurer 37 ° C est maintenue pendant toute la durée de l'expérience. Sinon, sanneaux entendre peuvent être transférées dans les chambres environnementales (par exemple, la chambre de l' incubateur modulaire), puis placés dans un incubateur rotatif. - Après couches de cellules ont été exposées à un cisaillement pour la durée souhaitée, retirez les anneaux de cisaillement de l'incubateur. Retirez le couvercle de la bague de cisaillement et de récupérer des cellules et / ou des médias pour examiner critère souhaité analyse (par exemple, Western blot, la fluorescence tri cellulaire activé, etc.) 25.
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Representative Results
Nous présentons ici des résultats représentatifs à la fois hCMEC / D3 cellule endothéliale du cerveau et de la rétine de rat monocouches de cellules endothéliales microvasculaires, cultivées dans des anneaux de cisaillement.
Après avoir laissé hCMEC / D3 monocouches de cellules endothéliale du cerveau à croître jusqu'à la confluence dans EBM complète, les anneaux de cisaillement ont été placées sur un agitateur orbital pendant 72 heures. En utilisant l'équation de l'étape 3.5, la contrainte de cisaillement calculée maximale 
était d' environ 2,8 dynes / cm 2 (avec des paramètres 
= 0,95 cm, 
= 0,0101 équilibre, 
= 0,9973 g / ml 24, 
= 1,5 rotations / seconde ). Nous avons trouvé que ces monocouches de cellules endothéliales présentent parfois un alignement parallèle à la direction de l'écoulement périodique (figure 3), bien que cela ne soit pas uniformément observée car les couches cellulaires ont généralement une excellente adhérence à la surface de l' anneau de cisaillement tout au long de l'étude.
Après avoir laissé les rats de la rétine monocouches de cellules endothéliales microvasculaires de croître jusqu'à la confluence dans un milieu de cellules endothéliales de rat complet, y compris les suppléments de facteurs de croissance EGF / VEGF, les anneaux de cisaillement ont été placées sur un agitateur orbital pendant 72 heures. En utilisant l'équation de l'étape 3.5, la contrainte de cisaillement calculée maximale était d' environ 12 dynes / cm 2 (avec des paramètres = 0,95 cm, = 0,0101 équilibre,iles / ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg "/> = 0,9973 g / ml 24, = 4 tours / seconde). La figure 4 montre que , par rapport à la commande de chargement de β-actine, il y avait une perte importante et significative de la molécule plaquettaire endothéliale d'adhésion cellulaire (PECAM-1 / CD31) à la surface des cellules endothéliales.
PECAM-1 est une protéine membranaire intégrale qui est un membre de l'immunoglobuline (Ig) -superfamily qui contient une tyrosine-dépendante d' immunorécepteur motif inhibiteur ou «ITIM» 26. PECAM-1 est non seulement exprimé sur les cellules endothéliales, mais se retrouve également sur les cellules hématopoïétiques. PECAM-1 joue un rôle important dans l'endothélium adhésion cellule-cellule, leucocytaire jonctionnel transmigration, la signalisation cellulaire, et surtout, mécano-transduction de la contrainte de cisaillement. Le rôle de PECAM-1 à détecter la contrainte de cisaillement est critique pour les fonctions de endotheli vasculaires cellules al et homéostasie 17. Quand les monocouches endotheliales sont exposées à des contraintes de cisaillement, PECAM-1 répond directement à la force mécanique exercée sur elle en modifiant sa phosphorylation de la tyrosine, et l' activation subséquente de la ERK1 / 2 cascade de 27 signalisation. En outre, le PECAM-1-eNOS association complexe est interrompue par des perturbations dans la contrainte de cisaillement 28. Par conséquent, PECAM-1 permet aux cellules endothéliales vasculaires pour détecter les changements dans les forces de contrainte de cisaillement à fluide qui peut conduire à une dilatation réactive de la paroi de la cuve 29.
Ces données appuient ce modèle montrant que les cellules endothéliales répondent à l'exposition à périodique, cisaillement fluide unidirectionnel par régulation d'une jonctionnel importante et déterminante adhésif, qui médie le contact intercellulaire ainsi que l'échange de cellules transvasculaire.
632fig3.jpg "/>
Figure 3. Cerveau morphologie des cellules endothéliales dans un anneau de cisaillement. L'apparition des monocouches de cellules hCMEC / D3endothelial dans les anneaux de cisaillement suivant 48 heures de cisaillement de fluide périodique ou une exposition statique. L' alignement des cultures est pas toujours observée parallèlement à la direction d' écoulement (indiqué par la flèche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Réponses cellulaires à un cisaillement périodique. Rat microvasculaires de la rétine monocouches de cellules endothéliales cultivées dans des anneaux de cisaillement a montré une réduction de PECAM1 / CD31 par rapport à ß-actine (n = 3 chacun, étudiants test t apparié, * -p <0,05, les barres d'erreur se réfèrent à l'écart-type), après 72 heures de périodique fluide de karitér dans les anneaux de cisaillement.
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Discussion
La construction du système d'anneau de cisaillement pour exposer les cellules endothéliales au cisaillement est une approche simple pour effectuer des études de contrainte de cisaillement. Néanmoins, il y a quelques étapes qui sont essentielles pour l'obtention d'anneaux de cisaillement supérieurs et de meilleurs résultats. Un joint d'étanchéité complète doit être faite entre la bague intérieure et extérieure pour empêcher les médias de fuite qui pourrait créer une contrainte de cisaillement incompatibles entre échantillons. Si un joint d'étanchéité complet n'a pas été effectué, une quantité minimale de chlorure de méthylène doit être ajouté à l'arête entre la coupelle intérieure et extérieure avec une pipette de transfert à travers le trou dans la bague intérieure. tourner doucement l'anneau devrait permettre le chlorure de méthylène pour former un joint complet. En outre, les copeaux de plastique produites par inadvertance de coupe peuvent être présents sur la piste de l'anneau de cisaillement, afin de rincer l'anneau de cisaillement après la construction devrait enlever tous les débris qui pourraient nuire à la croissance cellulaire et de donner application incohérente contrainte de cisaillement.
Les sanneaux entendre les décrits dans l'article sont de taille relativement importante, conduisant à un volume élevé de production par échantillon. Cependant, des versions plus petites pourraient être construites en utilisant de plus petites boîtes de Pétri (par exemple, 100 mm boîte de Pétri avec un 60 mm insert). Construire plusieurs petits anneaux de cisaillement pourraient permettre un plus grand nombre d'études réplique tout en conservant des volumes relativement importants des fluides et des surfaces par échantillon par rapport à d'autres méthodes.
Quelques questions ont été notées lors de l'utilisation des anneaux de cisaillement. Premièrement, certains agitateurs orbitaux produisent des quantités excessives de chaleur, et certains incubateurs ne parviennent pas à contrôler cette augmentation de la température. Ceci peut être évité par la sélection appropriée des rotateurs et l'utilisation des incubateurs gainés non-eau, qui échangent de la chaleur beaucoup plus facilement. la contamination de la culture est un autre problème potentiel lors de l'utilisation des anneaux de cisaillement, en particulier après l'assemblage dans un environnement en plein air. anneaux de cisaillement doivent être stérilisés avant utilisation.
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Disclosures
J. Winny Yun a une subvention de la fondation Annette Funicello de recherche. J. Steven Alexander a le soutien de la recherche du Département de neurologie, LSUHSC-S.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier l'aide de M. Christopher Nguyen, Aaron Hunter et Shreveport Jumpstart, SMART, et les programmes de formation biostart ainsi que le département de biophysique, Shreveport, LA Centenary College of Louisiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass Petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15 ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 ml transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
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