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Immunology and Infection

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54641
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Nous rapportons un protocole utilisant les cellules activées par fluorescence de tri pour isoler les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) avec une grande pureté à partir de la moelle osseuse de souris lupus sujettes à des études fonctionnelles de pDC.

Protocol

NOTE: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) souris lupiques sujettes ont été élevés et maintenus dans un établissement exempt d'organismes pathogènes spécifiques suivant les exigences des institutions de protection des animaux et l' utilisation Commission (IACUC) au numéro de Virginia Tech (Bien - être Assurance animaux: A3208-01). Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées sous IACUC protocole # 12-062.

1. milieu de culture cellulaire et tri Buffer

  1. Préparer milieu complet de culture de cellules (C10) en utilisant du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, du pyruvate de sodium 1 mM, 1% à 100 MEM acides aminés non essentiels, Hepes 10 mM, 55 pM de 2-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine et 100 U / ml de pénicilline-streptomycine.
  2. Préparer un tampon de tri (HBSS-plein) en utilisant une solution saline équilibrée de Hank 1x (HBSS) complétée avec HEPES 10 mM, 2,5 mg / ml d'albumine de sérum bovin,0,05 mM MgCl2 et 0,2 U / ml d' ADNase I.

2. Souris Dissection

  1. Préparer deux plats de diamètre de 6 cm contenant 4 ml C10. Placez les plats sur la glace.
  2. Euthanasier la souris par inhalation de CO 2.
  3. Récolter la rate et le garder dans un plat avec C10 sur la glace.
    1. Pin de la souris vers le bas avec le ventre vers le haut sur la plaque de dissection. Stériliser le corps par pulvérisation d'éthanol à 70%.
    2. Couper la peau et séparer la peau de la paroi du muscle sous le long de la ligne médiane ventrale de la symphyse pubienne du cou.
    3. Couper la peau le long de la patte arrière de la première incision à la cheville.
    4. Epingler la peau du dos sur les côtés et couper la paroi musculaire le long des côtés de la première place de l'incision au diaphragme.
    5. Epingler la paroi musculaire de retour sur le côté droit de la tête.
    6. Repérez la rate sur le côté droit de la souris au-dessous de l'intestin grêle et à côté de l'estomac. Ramassez une extrémité de the la rate et le séparer de l'estomac.
  4. Couper les deux membres postérieurs dehors, y compris fémur et du tibia, et enlever tous les muscles autant que possible.
    1. Couper les muscles le long de la patte postérieure de l'articulation pelvienne / hanche à la cheville avec un ciseau tranchant, en essayant d'éviter les vaisseaux sanguins.
    2. Séparer la patte arrière en coupant à la pelvien / articulation de la hanche et de la cheville conjointe / pied sans l'exposition des contenus de la moelle osseuse.
    3. muscles restants propres sur les os par grattage avec une lame de rasoir à plusieurs reprises et en coupant les muscles au niveau des points communs.
  5. Gardez les os dans un plat de 6 cm contenant 4 ml C10 sur la glace. Passez à disséquer la prochaine souris.

3. splénocytes Isolation

  1. Homogénéiser la rate doucement avec un piston de la seringue contre une cellule crépine de 70 um sur le dessus du plat contenant 4 ml C10 jusqu'à ce qu'aucune pièces rouges sont visibles.
  2. Ajouter supplémentaire de 6 ml C10 dans le plat à travers le tamis ae puis transférer le 10 ml de suspension totale de cellules dans un tube de 15 ml conique.
  3. Centrifuger le tube conique à 800 g pendant 5 min, 4 ° C.
  4. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de 2 x globules rouges (RBC) du tampon de lyse. Incubation à température ambiante pendant 5 min.
  5. Après incubation, centrifuger le tube conique à 800 g pendant 5 min, 4 ° C.
  6. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de C10. Jeter toutes les grandes touffes (cellules mortes) et maintenir le tube sur la glace pour plus tard.
    NOTE: S'il y a beaucoup de petits amas, utilisez un tamis cellulaire de 70 pm pour filtrer la suspension cellulaire une fois.
  7. Comptez le nombre de cellules avec du bleu trypan en utilisant un compteur de cellules automatisé.

4. moelle osseuse de cellules d'isolement

  1. Transférer les os avec 4 ml C10 dans un mortier et ajouter 6 ml C10 pour obtenir un volume de 10 ml C10 au total.
  2. Casser les os doucement dans le mortier en utilisant apEstle.
  3. Remuer doucement avec le pilon pour libérer la moelle osseuse en C10.
  4. Transférer les 10 ml C10 contenant de la moelle osseuse dans un tube conique de 50 ml sur de la glace à travers un tamis cellulaire de 70 pm. Ajouter 10 ml C10 frais dans le mortier contenant encore les os.
    NOTE: Pipette la solution contenant de la moelle osseuse et à plusieurs reprises avant de passer à travers le tamis si touffes rouges sont visibles.
  5. Répétez les étapes deux fois 4.2 à 4.4. Après le dernier lavage, les os doivent apparaître blanc.
  6. Centrifuger le 50 ml tube conique à 800 g pendant 5 min, 4 ° C. Pendant ce temps, préparer 5 ml de milieu de gradient de densité prête à être utilisée dans un tube à centrifuger conique de 15 ml à température ambiante.
  7. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de C10.
  8. couche lentement la suspension de 10 ml de cellules au-dessus du milieu de gradient de densité de 5 ml, en maintenant une interface claire entre les deux phases. Puis centrifuger le tube de 15 ml conique à 1363 g pendant 30 min àRT (20 ° C) avec jeu d'accélération et de décélération 9 défini comme 0 (ou frein OFF).
  9. Après centrifugation, enlever le haut 8 ml de solution soigneusement et recueillir la couche 2 ml de buffy à l'interface (une couche de cellules mononucléaires) dans un nouveau tube de 15 ml conique.
  10. Ajouter 12 ml C10 glacé aux 15 ml tube conique contenant des cellules mononucléées de la moelle osseuse, capuchon et inverser plusieurs fois pour bien mélanger, puis centrifuger le tube à 800 g pendant 10 min, 4 ° C.

5. Cellule Coloration de surface pour FACS

  1. Coloration de l' échantillon
    1. Préparer anti-souris CD16 / 32 solution d'anticorps (1 à 100 de dilution dans du HBSS-plein, 5 ug / ml de concentration finale).
    2. Après centrifugation à l'étape 4.10, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de solution d'anticorps anti-souris CD16 / 32 pour bloquer les récepteurs Fc sur les cellules mononucléaires. Laisser incuber sur de la glace pendant 10 min.
    3. Préparer le mélange d'anticorps par fluorescence conjugué (anti-souris CD11c-PE dilution 1:40, anti-souris CD11b-APC-Cy7 1:80 dilution, anti-souris PDCA-1-FITC dilution 1:40 et anti-souris B220-V500 dilution 1:40 dans HBSS complet, tel que recommandé par le fabricant à 100 volume final ul par échantillon).
      NOTE: Il est important de titrer les anticorps avant utilisation.
    4. Après 10 minutes d'incubation à l'étape 5.1.2, ajouter 4 ml glacée HBSS complet et centrifuger à 800 g pendant 5 min, 4 ° C pour éliminer non liée anti-souris CD16 / 32.
    5. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 mélange d'anticorps par fluorescence conjugué ul. Incuber sur la glace pendant 15 min dans l'obscurité.
    6. Après 15 minutes d'incubation, ajouter 4 ml glacée HBSS complet et centrifuger à 800 g pendant 5 min, 4 ° C pour éliminer les anticorps de fluorescence conjugué non lié.
    7. Préparer la solution de chargement FACS (500 ng / ml de DAPI dans HBSS-plein).
    8. Après centrifugation à l'étape 5.1.6, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 μ; L FACS solution de chargement. Transférer la suspension cellulaire dans un 12 x 75 mm tube de fond rond (FACS tube) et maintenir le tube sur la glace dans l'obscurité jusqu'à ce que le tri dans les 1 h.
  2. Coloration pour l' indemnisation
    1. Étiquette 6 FACS tubes comme PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI ou souillures. Splénocytes aliquotes à 1 x 10 6 cellules / tube dans les tubes FACS, et laver avec 4 ml de HBSS-plein à 800 xg pendant 5 min, 4 ° C.
      REMARQUE: Utiliser DNA-binding colorant fluorescent, DAPI, de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. DAPI peut passer à travers la membrane plasmique des cellules mortes (mais pas de cellules vivantes) et de l'ADN chromosomique se lient.
    2. Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 100 pi de HBSS-plein.
    3. Dans chaque tube FACS correspondant, ajouter l'un des anticorps suivants: anti-souris CD19-PE dilution à 1:40, anti-souris CD11b-APC-Cy7 dilution 1:80, anti-souris PDCA-1-FITC ou dilution 1:40 B220-V500 anti-souris dilution 1:40 comme recommandé par le manufacturer. Laissez le 5 e (DAPI) et 6 e (souillures) FACS tubes comme ils sont. Bien mélanger en secouant et incuber tous les tubes FACS sur la glace dans l'obscurité pendant 15 min.
    4. Après incubation, ajouter 4 ml de glace froide HBSS complet dans chaque tube et centrifuger les tubes FACS à 800 xg pendant 5 min, 4 ° C.
    5. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de la glace froide HBSS-plein à l'exception de la pastille dans le tube marqué DAPI, qui est remis en suspension dans 500 pi de solution de charge FACS. Garder les 6 tubes sur la glace dans l'obscurité jusqu'à ce que le tri.

6. Tri sur le Cell Sorter

REMARQUE: L'opération de tri procédure sur le cytomètre et le logiciel est standardisé avec une instruction détaillée fournie par la société. En bref, nous utilisons 100 buse de microns à 20 psi, régler la concentration de la cellule cible entre 5-10000000 par ml, et d' ajuster l' efficacité à 70% ou plus (c. -à- conflits maintenus sous 30%).

  1. Préparer la collecte des tubes FACS avec 500 ul de FBS / tube contenant 100 U / ml de pénicilline-streptomycine.
  2. Régler les paramètres de compensation de la trieuse de cellules en utilisant des tubes de compensation unique tache de l'étape 5.2.
    1. Enregistrez 10.000 cellules dans le tube unstained pour régler la porte négative pour chaque intensité de fluorescence.
    2. Enregistrez 10.000 cellules dans d'autres tubes de compensation unique tache de mettre en porte positive pour chaque intensité de fluorescence.
      REMARQUE: Le logiciel calcule automatiquement les paramètres de compensation.
  3. Utilisez un échantillon de l'étape 5.1 pour définir les portes de populations de cellules triées en enregistrant 3.000 cellules. En utilisant l'intensité de fluorescence en tant que paramètres de X et où l'axe Y, la population de cellules de grille cible manuellement en tant que groupe de points apparemment séparés des autres points.
    NOTE: Cet ensemble de déclenchement est flexible et arbitraire sur la base des besoins des chercheurs. Si les chercheurs attendent une plus grande pureté à base d'un ou plusieurs marqueurs, déplacer la portesupérieur en fonction de l'intensité de fluorescence correspondante.
  4. Chargez un tube de collecte et de commencer à trier la population de cellules cibles.
  5. Gardez le tube de prélèvement sur la glace après le tri jusqu'à ce que tous les tubes échantillons sont effectués.
  6. Ajouter de la glace froide C10 au tube de collecte jusqu'à 4 ml, capuchon et mélanger par inversion.
  7. Centrifuger le tube de collecte à 800 g pendant 5 min, 4 ° C, puis aspirer le surnageant, ce qui laisse environ 200 ul avec du culot cellulaire intacte.
  8. Ajouter 1 ml de glace froide C10 à remettre en suspension le culot cellulaire et transférer toute la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml.
  9. Centrifuger le tube de 1,5 ml à 800 g pendant 5 min, 4 ° C et à aspirer le surnageant, en laissant 100 pi avec le culot de cellules intactes.
  10. Conserver les populations de cellules triées sur la glace jusqu'à utilisation.

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Representative Results

Nous avons cherché à enrichir la moelle osseuse pDC avec une grande pureté, et sans l'influence d'autres types de cellules, de MRL / lpr lupus-prone souris des jeunes et des personnes âgées pour étudier les changements fonctionnels de pDC quant à leur capacité à produire de l'IFNa. La première stratégie de purification a été utilisée PMM, qui, comme le montre la figure 1, a conduit à seulement 7,75% de pureté après l'enrichissement. Par rapport à MCS, FACS enrichi pDC avec une pureté aussi élevé que 96,4%. Pour assurer une grande pureté, une stratégie étape par étape de déclenchement a été réalisée. Comme le montre la figure 2, les cellules mononucléaires ont été bloqués et séparés des débris par diffusion vers l' avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC) paramètres. Utilisation de FSC-largeur (FSC-W) vs. FSC-hauteur (FSC-H) et SSC-W vs. SSC-H, des cellules individuelles ont été bloqués pour éviter les faux signaux positifs produits par des agrégats. Cellules individuelles vivantes ont ensuite été gated comme DAPI - population (cellules DAPI + sont morts ou apoptotique).De simples cellules vivantes, CD11c + CD11b - population a été fermée, à partir de laquelle B220 + PDCA-1 + population a encore été fermée comme pDC. Le pDC triés étaient non seulement d'une grande pureté, mais aussi fonctionnellement normal. Ils avaient la capacité de produire IFNa in vitro sur CpG stimulation comme le montre la Figure 3 (Re-print avec la permission de notre publication précédente 17.

Figure 1
Figure 1. La pureté de pDC Classé soit par MCS et méthode FACS de flux représentant cytométrie chiffres indiquant le pourcentage de pDC (CD11c + CD11b - B220 + PDCA-1 +). Dans les cellules triées par MCS ( en haut) et FACS ( en bas), respectivement. Le CD11c + CD11b - population a été fermée à partir de cellules totales en direct ( à gauche), puis pDC comme B220 + PDCA-1 Cellules + ont été bloqués dans le CD11c + CD11b -. Population ( à droite) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Stratégie Gating pour pDC Enrichissement par FACS Une stratégie étape par étape de déclenchement dans l'ordre suivant:. Les cellules mononucléaires à des cellules individuelles FSC, à des cellules individuelles SSC, à DAPI - cellules vivantes, à CD11c + CD11b -, et B220 + PDCA-1 + comme en direct pDC. pDC dans des cellules individuelles au total est de 2,95 ± 1,42%; nombre de pDC triés est de 0,88 ± 0,28 x 10 5 par souris avec un taux de récupération d' environ 50%. (N = 12 MRL / lpr, les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type de 95% CI de la moyenne). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
. Figure 3. IFNa production par FACS triés pDC os Classé moelle pDC ont été traités avec la classe A CpG (ODN1585; 5 uM) pendant 6 heures in vitro. Dans la figure, "y" représente les souris plus jeunes, 6 semaines d'âge; "O" signifie, les souris de 16 semaines d'âge plus âgés. LMR signifie souris MRL des souris de contrôle comme en bonne santé; lpr signifie souris MRL / lpr comme souris lupiques sujettes. La concentration d'IFNa dans le surnageant de culture a été mesurée par ELISA. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, ANOVA à sens unique. Les données sont présentées en tant que moyenne ± écart-type de la moyenne (n = 3 souris par groupe). Ce chiffre est tiré de notre publication dans le Journal of Immunology avec la permission. 17pload / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum HyClone SH30396.03
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine  gibco by life technologies 25030-164
Penicillin-Streptomycin gibco by life technologies 15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution  gibco by life technologies 14175-079
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MgCl2 SIGMA M8266
DNase I SIGMA D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer  eBioscience 00-4300-54
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Ficoll-Paque Plus 
anti-mouse CD19-PE BD Pharmingen 553786
anti-mouse CD11c-PE eBioscience 12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7 BD Pharmingen 557657
anti-mouse PDCA-1-FITC eBioscience 11-3172-81
anti-mouse B220-V500  BD Pharmingen 561226
DAPI invitrogen D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotec 130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer  BD Biosciences 643178
BD FACS Diva version 6 BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  2. Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  3. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  4. Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
  5. Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
  6. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).
  7. Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
  8. Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
  9. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
  10. Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
  11. Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
  12. Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
  13. Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
  14. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
  15. Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
  16. Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
  17. Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).

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Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (117), e54641, doi:10.3791/54641 (2016).

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