从血细胞使用仙台病毒和离心诱导多能干细胞代
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
最近的人类诱导多能干细胞（iPS细胞）的发展证明，成熟的体细胞可以返回到未分化，多能状态。角质形成细胞，尿细胞，成纤维等早期实验一般用真皮成纤维细胞进行：现在，重新编程各种类型成年体细胞进行。然而，这需要侵入性手术，以获得从病人的成纤维细胞。因此，悬浮细胞，例如血液和尿液细胞，分别因为得到原代细胞的方便的认为是理想的重新编程。这里，我们报告从外周血单核细胞（PBMC）对的iPSC产生一个有效的协议。通过串联电镀转导的PBMC到一个新的，包衣基质使用板离心，该协议可以很容易地提供的iPSC集落。这种方法也适用于脐带血单核细胞（CBMCs）。这项研究提出了一个简单而有效的PROTocol的外周血单个核细胞和CBMCs的重新编程。
Introduction
干细胞一直是最有吸引力的材料在临床治疗在过去几十年1中的一个。干细胞的吸引人的特性是多能性和能力的自我更新。在1981年，第一个胚胎干细胞（ESCs）从小鼠胚胎2隔离。然而，当该技术被应用到人的胚胎，它面临几个伦理问题。
在2006年，当山博士和他的团队重新编程小鼠体细胞第一多能细胞，干细胞领域恢复了可能性和兴趣再次被点燃3。通过提供几个限定的因素，多能干细胞成功地从成年体细胞“诱导”，并由此命名为“诱导多能干细胞（iPS细胞）。”在2007年，该技术被应用到人类细胞4，得到具有胚胎干细胞的确切特征的细胞，但没有伦理争论。从理论上讲，IPS铯可以从任何个体或患者获得的任何细胞类型中产生。患者特异性iPSCs的上升作为能够模拟疾病表型和每个个体患者的后生条件的潜在工具。使用基因的编辑或可逆转的致病条件的其它方法，患者专用的iPSC也可在个性化用药5中使用。此外，iPS细胞较少与免疫排斥反应相关的，因为他们有相同的免疫标识作为供体，使得自动移植更为可行6。因此，iPSCs的已成为疾病建模，药物筛选，并再生疗法的最有希望的平台。考虑到这些好处，改善了协议，可以从最小的细胞来源给予纯净和较高的收益率在最短的时间内量都在不断发展之中。发现为将来应用的最有效的协议中的一个重要的考虑是主要的细胞类型。大多数早期的iPSC产生的原COLS是为贴壁细胞，因为原来的iPSC系从皮肤成纤维细胞诱导4优化。然而，这些细胞的分离和制备是劳动密集型的。此外，皮肤成纤维细胞的隔离包括微创手术过程，可以成为更广泛应用的一大缺憾。
因此，对于进一步使用的iPSC的，则需要用采集方便的细胞来源。由于它是通过一个相当微创手术7-9获得的血液被视为理想的细胞来源。在这项研究中，我们开发了一个简单的修改协议产生外周血单个核细胞（PBMC）iPS细胞。没有特定的细胞类型，例如CD34 +细胞的困难扩张过程中，全血细胞或外周血单个核细胞中连续通过离心用含有山因子的仙台病毒转导之后镀上涂覆基质的平板。这种方法减少了所需的时间转导的漂浮细胞的附着和重编程的细胞是不能够自己附加的损失减少。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于胚胎干细胞（ESCs）显示若干缺点，需要一种替代的工具的需要。因此，诱导多能干细胞由山开发（iPS细胞）在国际聚光灯下的来。它已经将近十年，因为山中发现多能性可以通过添加只有四个基因导入成年体细胞被诱导。由于iPS细胞是由成熟的体细胞“诱导”，他们可以逃避那个曾经是与胚胎干细胞的关注伦理问题。不像胚胎干细胞，可以从每个生成的iPSC。因此，它们可以在个性化医学研?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
References
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
