Summary
El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.
Abstract
insuficiencia límbica (SIL) es un estado de mal funcionamiento o pérdida de las células madre epiteliales del limbo, después de lo cual el epitelio corneal se reemplaza con la conjuntiva. Los pacientes que sufren de defectos corneales recurrentes, dolor, inflamación y pérdida de la visión.
Anteriormente, se ha descrito un modelo murino de SIL y se comparó con otros dos modelos. El objetivo era producir un modelo de ratón consistente de SIL que tanto imita el fenotipo en los seres humanos y dura el tiempo suficiente para que sea posible estudiar la fisiopatología de la enfermedad y evaluar nuevos tratamientos. Aquí, la técnica se describe en más detalle.
Una herramienta motorizada con una fresa rotativa ha sido diseñado para eliminar los anillos de óxido de la superficie de la córnea o para alisar la cama pterigión en los pacientes. Es un dispositivo adecuado para crear el modelo SIL deseado. Se trata de una herramienta de fácil de usar fácilmente disponible con una punta fina que la hace apropiada para trabajar en pequeños ojos, comoen ratones. Su aplicación evita trauma innecesario a la vista y que no da lugar a lesiones no deseados, como a menudo es el caso de modelos de lesión química. A diferencia de un raspador romo, que elimina el epitelio con la membrana basal. En este protocolo, la zona del limbo fue pulida dos veces, y luego todo el epitelio corneal se afeitó de limbo a limbo. Para evitar lesiones estroma, se tuvo cuidado de no rozar la superficie de la córnea una vez que el epitelio ya se había eliminado.
Introduction
Se requiere que el epitelio de la córnea para mantener la claridad y la integridad de la córnea. Se renueva constantemente durante toda la vida de las células madre epiteliales que residen en el limbo-una zona estrecha en la unión de la córnea y la conjuntiva. Estas células madre limbares auto-renovación juegan un papel crucial en la regeneración del epitelio corneal, tanto normalmente y después de la lesión. agotamiento parcial o completa de estas células madre dará lugar a erosiones corneales recurrentes, dolor, cicatrización de la córnea y la neovascularización, la apariencia de las células caliciformes, y si se deja sin tratar la ceguera, la córnea. Esta condición se conoce como insuficiencia límbica (SIL) y puede ser idiopática; hereditario; o adquirida debido a las lesiones químicas o térmicas, lentes de contacto a largo plazo desgaste, y la inflamación crónica 1-6.
La investigación sobre SIL requiere un modelo animal adecuado que no sólo imita la enfermedad en los seres humanos, pero es reproducible y sostenible, con el mínimo de unamonte de lesiones en otras estructuras de la córnea y oculares. Este modelo es necesaria para evaluar los tratamientos y para aclarar los mecanismos de la enfermedad a nivel molecular y celular. Como se ha descrito antes de 1, con el uso de una fresa giratoria, se puede desarrollar fácilmente un modelo de ratón de LSCD que cuenta con las ventajas antes mencionadas y persiste durante al menos tres meses. El objetivo de este estudio es presentar un modelo simple, reproducible y sostenible del ratón de SIL.
La fresa de rotación es una práctica herramienta que elimina de manera uniforme el epitelio sin dañar el estroma subyacente 1. Se ha utilizado para inducir la erosión corneal central 7, 8 en los estudios de cicatrización de heridas. La técnica de la presente-presentado para crear LSCD en un ratón no se ha informado antes. Anteriormente introducido métodos de raspar el epitelio con un resultado espátula roma en una lesión menos uniforme, particularmente en el limbo y un fenotipo más variable 1, 9, con más o restauraciónf epitelio corneal normal de 1. A diferencia del raspador romo, la rebaba giratorio elimina la membrana basal epitelial, así 7, 8, 10. Otros métodos reportados por separar las células madre implican el uso de productos químicos, tales como hidróxido de sodio, n-heptanol, y cloruro de benzalconio, que no sólo puede inducir lesión no deseado a las estructuras del ojo subyacentes, sino que también puede conducir a la inflamación significativa y posterior opacificación corneal o epitelial metaplasia escamosa 11-15. La rebaba de rotación no está asociado con estas complicaciones graves. La extirpación quirúrgica del epitelio limbal, solo o con el uso de productos químicos 10, 11, 16, es más difícil de realizar y no es la mejor opción en los animales con ojos pequeños y una epitelio limbar delgada (como ratones). Además, sorprendentemente, limbectomy todavía puede dejar un poco del epitelio limbal detrás 10.
La técnica descrita a continuación resultará en LSCD con una neovascularizaciónd conjuntivalización que imita la presentación del SIL completa en los pacientes y tiene una duración de al menos tres meses 1. Es adecuado para aquellos que tienen como objetivo estudiar la fisiopatología SIL o la cicatrización de heridas, la inmunología, y los tratamientos potenciales en ratones. Posiblemente, con algunas modificaciones, este procedimiento puede llevarse a cabo en ratas o conejos 10. Como la rebaba giratorio elimina eficazmente el epitelio, que se puede utilizar en cualquier investigación perteneciente a la abrasión corneal epitelial / herida y en cualquier tratamiento relacionado o estudios de biología molecular.
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Protocol
Todos los procedimientos realizados en animales cumplen con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaraciones para el uso de animales en la investigación de la visión. Se utilizaron cuatro a catorce 6J de seis meses de edad, macho / hembra C57BL / tipo salvaje: diez ratones para el modelo de lesión y cuatro como animales de control (córneas no heridos).
1. Preparación de los animales
- Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de una 100 mg / kg de ketamina y 5 mg mezcla de xilazina / kg. Después de la anestesia ha hecho efecto, pellizcar el dedo para confirmar la profundidad de la anestesia; el animal no debe reaccionar.
- Inspeccionar el ojo bajo una lámpara de hendidura antes de realizar los experimentos para comprobar la ausencia de cualquier lesión en la córnea anterior.
- Inculcar una gota de clorhidrato de tetracaína 1% sobre el ojo. Después de 60 - 90 segundos, probar el reflejo corneal para confirmar la ausencia de sensación. Proparacaína clorhidrato de 0,5% se puede usar en su lugar.
- Cuando la pérdida de sensación corneal escierto, coloque suavemente una gota de 5% de povidona-yodo en el ojo y en el cabello alrededor del ojo. Limpie la gota después de 1 min o difundirlo en el pelo alrededor de los ojos para evitar que el pelo interfiera con la punta de la herramienta.
2. Dispositivo de abrasión del epitelio corneal
- Use guantes quirúrgicos y una bata. Preparar las herramientas necesarias: una fresa rotativa estéril y un par de pinzas estériles. Para un mejor control, utilizar pinzas dobladas. Coloque las herramientas en una hoja estéril durante el procedimiento.
- Usando las pinzas dobladas, estabilizar el ojo por el acaparamiento de las tapas desde el lado nasal y proptosing suavemente el ojo. Evitar el uso de demasiada presión.
- Bajo un microscopio quirúrgico, afeitarse 360 ° alrededor de la zona del limbo dos veces utilizando la fresa rotativa estéril. Ir alrededor del limbo con una velocidad de 5-6 seg por ronda.
NOTA: La rebaba tiene una velocidad fija. Sin embargo, para que gire a la velocidad establecida, la "tuerca del extremo" debe estar completamente apretado. - Retire todo el epitelio de la córnea de limbo a limbo con la rebaba rotatoria. Para obtener mejores resultados, mueva la herramienta en forma circular y mantenga un tanto paralela a la superficie de la córnea para trabajar con la parte lateral de la punta. Tenga cuidado de no dañar el estroma por no vuelve a cepillar las áreas donde el epitelio ya ha sido retirado. No aplicar ninguna presión en el ojo. Limpiar la punta del pincel según sea necesario.
- Inculcar una gota de solución salina tamponada con fosfato estéril sobre la córnea y limpie las hojas epiteliales independiente con un tejido suave de limpieza.
- Afeitarse el epitelio restante, en su caso.
- Prestar atención a la cola del ratón durante la cirugía.
NOTA: Si se produce cualquier movimiento, la profundidad de la anestesia se ha desvanecido y se requiere aún más la inyección. Un tercio a dos tercios del volumen inyectado primario debe ser suficiente. No exceder la dosis al animal con la medicación anestésica. - Esterilizar todas las herramientas antes de utilizarlas en otro ojo.
3. Confirmar la eliminación completa epitelial
- Aplicar una gota de 1 mg / ml de fluoresceína de sodio en la córnea. Limpiar la córnea después de 30 segundos y examinarla bajo el microscopio con un filtro azul de cobalto para verificar la eliminación completa del epitelio.
NOTA: Las áreas de la córnea con defectos epiteliales se visualizan en verde.
4. Después de la operación de atención
- El sacrificio del animal en una manta de calefacción y guardarlo en un lugar seguro (por ejemplo, en su jaula), mientras que bajo la recuperación. No mantenga un animal inconsciente en compañía de los conscientes.
- Aplicar 1% pomada oftálmica de eritromicina. Esto también evitará que la sequedad del ojo. Continuar la aplicación del antibiótico diaria durante una semana.
- Inyectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea después del procedimiento y de nuevo después de 12 hr. Continuar la inyección dos veces al día durante dos días.
- Observe que el animal de 30 - 45 minutos, hasta que la recuperación completa de la anestesia.
NOTA: Leve movimiento de los músculos respiratorios en la superficie ventral indica el bienestar de los animales, mientras que bajo la recuperación.
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Representative Results
Dentro de un mes después de realizar esta técnica, el 100% de las corneas desarrolló neovascularización superficial (Figura 1A. Las fotografías fueron tomadas con una cámara conectada a una lámpara de hendidura bajo un campo brillante y cobalto filtro azul). En 18/20 (90%) de los ojos, la neovascularización implicada toda la superficie corneal (Figura 1A). En 2/20 (10%), se observó neovascularización en tres de los cuatro cuadrantes de la córnea, pero aún alcanzó el centro de la córnea.
Para validar el desarrollo de SIL, toda la inmunotinción se realizó montaje 1. Este paso no es una parte del protocolo y puede ser alterado en función de los objetivos e intereses. Tres variaciones se consideran como indicadores de LSCD: ausencia de citoqueratina (CK) 12, un filamento intermedio específico para células epiteliales corneales normales 17, 18; aparición de CK8, un simple marcador de epitelios
Córneas normales no lesionadas, expresa CK12-un marcador específico de las células epiteliales de la córnea maduras 17, 18 -A lo largo de la superficie de la córnea, pero que carezcan de CK8 o células caliciformes (MUC5AC) por parte de la córnea de todo el montaje muestras (Figura 1B) . En comparación con los ojos normales, la expresión de CK12 está casi ausente en injur Y córneas modelo, mientras que muestran significativamente tinción positiva para CK8 y células caliciformes (Figura 1B). Estas observaciones indican el desarrollo de LSCD.
Si está interesado en la cuantificación de los resultados de inmunotinción, utilice la imagen-J para cuantificar por separado 20 densidades de inmunotinción en las imágenes originales, sin alterar tomadas por el microscopio bajo los mismos parámetros. En pocas palabras, seleccionar la parte de la córnea de la muestra de montaje, medir la densidad y el área integrada para esa región, y calcular la densidad corregida por el fondo 20. La relación de CK12 a densidades Ck8 se presentaron anteriormente en un mayor número de muestras 1. La relación reducida en comparación con los controles (córneas normales) y la aparición de células caliciformes en la superficie corneal demuestran el desarrollo de LSCD.
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Figura 1: Fenotipo de la córnea después de crear SIL en ratones. Examen con lámpara de hendidura muestra que todas las córneas desarrollan algún grado de neovascularización en un mes (A, barra de escala: 0,5 mm). Una córnea normal expresa CK12 todo la córnea, pero está desprovisto de cualquier CK8 o células caliciformes (MUC5AC). CK12 está ausente en el modelo SIL, mientras CK8 y células caliciformes aparecen en la córnea (B, barra de escala: 200 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo se describe una técnica reproducible y relativamente sencillo para crear un modelo de ratón de LSCD. Hay varios aspectos importantes de este modelo que vale la pena destacar. En primer lugar, a diferencia de los modelos que utilizan productos químicos 11, 12, la lesión implica principalmente el epitelio de la superficie (y la membrana basal), con un daño mínimo al estroma corneal subyacente o a otras estructuras intraoculares. Por lo tanto, no hay más que la inflamación y la cicatrización limitada, los cuales pueden complicar el procedimiento y hacerlo más difícil evaluar el resultado de las intervenciones dirigidas a las células madre del limbo. Un estudio reciente interesante por Li et al. 10, que compara el uso de la fresa que gira con diferentes combinaciones de tratamientos quirúrgicos y químicos, también encontró la rebaba que es más seguro y más eficaz en la creación de SIL en conejos. En segundo lugar, el modelo parece ser estable durante al menos tres meses hasta 1. La creación de este modelo implica el uso dela rebaba de rotación, un instrumento que es familiar para los médicos que trabajan con la córnea, así como a aquellos que lo hacen los estudios hirientes ratón. Su ventaja sobre el uso de una espátula roma es que la lesión es más uniforme y reproducible 1.
Para destruir las células mejor madre del limbo, el área límbica se trató dos veces. Basado en la experiencia de trabajo en los ojos del ratón, el tratamiento de más de dos rondas menudo desgasta los vasos sanguíneos del limbo y causa hemorragia. En el caso de la técnica se utiliza en otros animales, este paso podría modificarse en función del espesor del epitelio corneal. En este estudio, se utilizó una herramienta motorizada con una punta de rebabas 0,5 mm; consejos de rebabas en otras formas y tamaños también están disponibles y se pueden utilizar en lugar, dependiendo de las especificaciones de la córnea y en el tamaño del ojo. Li et al. 10 informaron de la fresa de 2,5 mm para ser adecuado para eliminar sistemáticamente la córnea de conejo y el epitelio limbar.
Para obtener la óptimade resultados, los epitelios del limbo de la córnea y se afeitaron en forma circular y se utilizó el lado lateral de la rebaba. Para evitar que el pelo de los animales de interferir con la punta de la herramienta, la caída de la povidona yodada se extendió sobre el cabello alrededor del ojo, en lugar de ser borrados. La herramienta no debe ser operado de forma estática en un punto, ya que esto puede causar perforación. El tratamiento del limbo a un ritmo muy lento puede provocar una hemorragia; una velocidad de casi 6 segundos por vuelta es adecuado para un ojo de ratón C57BL / 6J. Es de suma importancia para evitar la re-cepillado del estroma desnudo, ya que esto inducirá a más inflamación y la opacificación de la estroma. La presión no debe ser aplicado al ojo mientras abrasión del epitelio. Después del procedimiento, la córnea se tiñó con fluoresceína para asegurarse de extracción epitelial completa. Es importante evitar la sequedad del ojo durante la recuperación de los animales. Las limitaciones son que esta técnica no puede eliminar el 100% de las células madre. También es algo que depende del operador y requiere de práctica para dar a consistent resultados.
Cuando se estudia el fenotipo epitelial corneal, toda la tinción de montaje es la mejor manera de evaluar el resultado de este modelo. Esto se debe a que permite que todo el epitelio corneal a ser evaluada a la vez, mientras que las secciones transversales sólo se dará información sobre cada sección particular.
Esta técnica controlable puede inducir SIL en ratones, y probablemente en otros animales también. Proporciona un modelo adecuado de SIL para estudiar nuevos tratamientos y descubrir los aspectos más amplios de la fisiopatología de la enfermedad. Con algunas modificaciones, puede ser útil en el estudio de la cicatrización corneal de heridas, la angiogénesis, y linfangiogénesis también.
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Acknowledgments
Los autores agradecen a Ruth Zelkha, MS, por su generosa ayuda en la formación de imágenes. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Desarrollo Clínico Científico Premio K12EY021475 a mí, conceder R01 EY024349-01A1 de ARD, el núcleo EY01792 subvención del Instituto Nacional del Ojo, NIH, y una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera. ARD es el destinatario de un Premio desarrollo de la carrera de investigación para prevenir la ceguera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
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