Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón
17 de noviembre de 2016
El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.
El objetivo general de este procedimiento es crear un modelo murino reproducible, sostenible y persistente de deficiencia de células madre limbales. Esta técnica sencilla proporciona un modelo animal consistente de deficiencia de células madre limbales, sin inducir lesiones no deseadas en el ojo, lo cual es difícil de lograr con los modelos estándar de lesión química. Este modelo es útil para estudiar el proceso de la enfermedad a largo plazo a nivel celular y molecular.
Y para probar o comparar la eficacia de tratamientos novedosos. Después de anestesiar al ratón, pellizque el dedo del pie para asegurar una profundidad adecuada de anestesia. Inspeccione el ojo bajo una lámpara de hendidura para verificar la ausencia de cualquier lesión corneal previa.
Instile una gota de hidrocloruro de tetracaína al 1% en el ojo y espere 60 segundos. A continuación, aplique suavemente povidona yodada al 5% en el ojo y en el pelo que lo rodea. Después de un minuto, limpie la gota o extiéndala sobre el pelo alrededor del ojo para evitar que el pelo interfiera con la punta de la herramienta.
Prepare una fresa rotatoria estéril y un par de pinzas estériles dobladas, y manténgalas sobre una hoja estéril durante el procedimiento. Ahora, estabilice el ojo sujetando los párpados desde el lado nasal con las pinzas dobladas, y protuzca suavemente el ojo. Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión.
Bajo un microscopio quirúrgico, rasúquese alrededor del área limbar dos veces utilizando la fresa rotatoria estéril. Retírese todo el epitelio corneal de limbo a limbo con la fresa rotatoria de forma circular, trabajando con el lado lateral de su punta. Para evitar lesiones del estroma, no vuelva a cepillar las partes corneales de las que ya se ha eliminado el epitelio.
No aplique presión sobre el ojo. Limpie la punta del pincel según sea necesario. Aplique una gota de PBS estéril sobre la córnea y retire con un tejido suave de limpieza cualquier lámina epitelial desprendida.
Luego, afeite el epitelio restante, si lo hay. Preste atención a la cola del ratón para asegurar una profundidad adecuada de anestesia durante la cirugía. Aplique una gota de fluoresceína sódica sobre la córnea.
Limpie la córnea después de 30 segundos y examínela bajo un microscopio con un filtro de luz azul cobalto para verificar la eliminación completa del epitelio. Después del procedimiento, coloque al animal en su jaula sobre una manta térmica y obsérvelo durante 30-45 minutos hasta que se recupere completamente de la anestesia. Mientras tanto, aplique una pomada oftálmica de eritromicina al 1 % en el ojo y continúe aplicando el antibiótico diariamente durante una semana.
Además, inyecte 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea inmediatamente y 12 horas después del procedimiento, y continúe con la inyección dos veces al día durante dos días. Este es el fenotipo de la córnea un mes después del procedimiento. Puede observarse una neovascularización extensa, que es una característica de la deficiencia de células madre limbales.
Una córnea normal expresa la citoqueratina 12, pero carece de citoqueratina 8 o células caliciformes. En la deficiencia de células madre limbales, aparecen la citoqueratina 8 y células caliciformes en la córnea, mientras que se pierde la citoqueratina 12. Una vez dominada, esta técnica provocará neovascularización corneal que cubrirá casi toda la superficie corneal del ratón en un mes, y permanecerá estable hasta tres meses.
Es importante evitar repasar las partes corneales de las que ya se ha eliminado el epitelio. Esto puede provocar inflamación y opacificación indeseadas del estroma. Tras el desarrollo de deficiencia de células madre limbales, se pueden probar y comparar métodos experimentales de tratamiento.
Alternativamente, los tratamientos pueden iniciarse poco después de la lesión. Este video mostró cómo eliminar eficazmente el epitelio limbar y corneal para inducir deficiencia de células madre limbares en ratón. Con algunas modificaciones, también puede realizarse en otros animales.
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Resumen
Este artículo presenta una técnica reproducible para crear un modelo sostenible en ratón de deficiencia de las células madre limbales (LSCD). Este modelo es esencial para estudiar el proceso de la enfermedad y probar tratamientos novedosos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Oftalmología
Antecedentes
- La deficiencia de células madre limbales afecta la salud corneal y la visión.
- Los modelos actuales a menudo inducen lesiones no deseadas, lo que complica la investigación.
- Se necesita un modelo sostenible para estudios a largo plazo.
- Esta técnica tiene como objetivo llenar ese vacío.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo murino consistente de LSCD.
- Facilitar el estudio de los procesos celulares y moleculares de la enfermedad.
- Evaluar la eficacia de tratamientos potenciales.
Métodos Utilizados
- Se administra anestesia al ratón.
- Se inspecciona el ojo bajo una lámpara de hendidura en busca de lesiones previas.
- Se emplea una técnica específica para inducir la DCEL sin daño adicional.
- Se realiza un monitoreo a largo plazo del modelo.
Resultados principales
- El modelo imita con éxito la DLEC sin provocar lesiones oculares no deseadas.
- Permite estudios celulares y moleculares a largo plazo.
- Los tratamientos novedosos pueden evaluarse de manera efectiva mediante este modelo.
- Los resultados indican un método confiable para investigaciones futuras.
Conclusiones
- Esta técnica proporciona una herramienta valiosa para la investigación de la deficiencia de células madre limbales (LSCD).
- Mejora la comprensión de las enfermedades de las células madre limbales.
- Estudios futuros pueden basarse en este modelo para mejorar las opciones de tratamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de un modelo de ratón reproducible de deficiencia de las células madre limbales (LSCD) aborda una necesidad crítica de sistemas relevantes para la enfermedad en el descubrimiento de fármacos oftálmicos. Este modelo permite la reducción de riesgos mecanicistas y una mayor confianza predictiva en la evaluación preclínica de terapias regenerativas y antiinflamatorias dirigidas a trastornos corneales. Su fenotipo sostenido y su alineación traslacional apoyan el avance robusto de la línea de investigación y la comparabilidad entre programas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la función de las células madre limbales y las vías de regeneración corneal.
- Apoya la desestimación biológica de riesgos al proporcionar un modelo de enfermedad consistente y controlado mediante lesión.
- Facilita la validación funcional de dianas terapéuticas candidatas para abordar la deficiencia de células madre limbales (LSCD).
- Mejora la confianza predictiva sobre la relevancia traslacional en la investigación de enfermedades de la superficie ocular.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona una plataforma in vivo validada para la evaluación cuantitativa de la eficacia terapéutica.
- Permite la evaluación estandarizada de parámetros celulares y moleculares, como la expresión de citokeratina y la neovascularización.
- Posibilita el cribado reproducible y escalable de compuestos o biológicos novedosos para la reparación corneal.
- Facilita la comparación fiable de modalidades de tratamiento en un entorno controlado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con la patología humana de DLEC, favoreciendo el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de estrategias regenerativas.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo para terapias oculares dirigidas a la deficiencia de células madre.
- Proporciona información mecanicista sobre la progresión de la enfermedad y la respuesta terapéutica.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este modelo de DCLS se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, la identificación de compuestos prometedores y la validación traslacional de terapias para la superficie ocular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la investigación basada en hipótesis sobre la pérdida de células madre limbales y los mecanismos de reparación corneal.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para la evaluación de la eficacia y seguridad de intervenciones candidatas.
- Análisis: Permite la medición de marcadores moleculares (por ejemplo, perfiles de citoqueratinas) y de neovascularización para análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos preclínicos con relevancia clínica mediante la modelización de fenotipos sostenidos de deficiencia de células madre limbales (LSCD).
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y adaptable para la evaluación transversal de terapéuticos oculares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el desarrollo de fármacos oculares.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad de los estudios preclínicos de DLEO.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en carteras oftálmicas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos regenerativos y antiinflamatorios.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía oftálmica en pequeños animales y en el cuidado postoperatorio.
- Necesita acceso a microscopios quirúrgicos, fresas motorizadas y herramientas analíticas moleculares.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos para la inducción de lesiones y la evaluación fenotípica.
- Adaptable a otros modelos de pequeños animales con modificaciones del procedimiento.
- Una técnica cuidadosa es esencial para evitar lesiones estromales y garantizar la consistencia del modelo.
