Abstract
생체 재료의 개발은 췌장 β 세포를 포함한 세포 및 조직 유형의 다양한 표적 약물 전달의 가능성을 증가 현저했다. 또한, 생체 재료 입자, 하이드로 겔 및 비계는 독특한 기회를 제공하는 것은 유지 관리하려면 제어 약물 전달은 β 세포를하는 문화와 이식 조직 모델에서. 이러한 기술은 본래 섬과 병진 관련 시스템을 이용하여 후보 β 세포 증식 인자에 대한 연구를 허용한다. 또한, 배양 시스템에서 β 세포 증식을 자극 후보 인자의 효과 및 타당성을 결정하는 것은 생체 내 모델 전진 전에 중요하다. 여기서 우리가 관심있는 생분해 성 화합물 (COI) -loaded 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 인 시츄 이형 O에서 유지의 효과를 평가하기위한 목적으로 (PLGA) 마이크로 스피어와 본래 마우스 아일렛 배양 공동하는 방법을 서술β 세포 증식에 F 분열 촉진 인자. 이 기술은 상업적으로 입수 가능한 시약을 사용하여 원하는화물을 함유하는 PLGA 미립자를 생성하는 방법에 대해 상세히 설명한다. 설명 된 기술은 예를 들어 재조합 인간 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF)를 사용하지만, COI 다양한 용이하게 사용될 수있다. 또한,이 방법은 β 세포 증식을 평가하는 데 필요한 시약의 양을 최소화하기 위하여 96 웰 플레이트를 사용한다. 이 프로토콜은 용이하게 다른 생체 물질 및 세포 생존 및 분화 상태와 같은 다른 내분비 세포의 특성을 이용하도록 구성 될 수있다.
Introduction
췌장 β 세포는 몸의 유일한 인슐린 생산 세포이며 혈당 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 건강한 사람이 충분한 β 세포 질량을 적절히 혈당을 조절하는 역할을하지만, 당뇨병을 가진 개인이 불충분 β 세포 질량 및 / 또는 1,2- 기능을 특징으로한다. 이 β 세포 증식을 유도하여 궁극적으로 β 세포 질량을 증가시키고 당뇨병 3 개인 글루코스 항상성을 복원 할 수 있도록 제안되어있다. 효과적인 치료법이 개발되기 전에 그러나, 평가, 그대로 섬에 잠재적 인 β 세포 증식 화합물의 확인이 필요합니다. 당뇨병을 가진 개인에 사체 인간의 독도의 이식은 몇 시간 동안 혈당 항상성을 복원되지만 가용성이 실험 절차의 성공은 섬의 후방에 이식 가능한 인간 섬의 부족에 의해 베타 세포 사멸에 의해 방해된다어 이식 4. 에도 인슐린 생성 세포의 증식을 유도하는 인자를 발견하여, 주요 문제는 여전히 생체 관련 사이트에 이들 인자를 전달 존재한다. β 세포 증식 화합물의 지속 로컬 배달을 위해 하나의 전략은 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜) 산 (PLGA)입니다. PLGA는 FDA에서 사용의 역사는 높은 안전성, 생분해 성 및 확장 릴리스 역학 5 때문에 약물 전달 제품을 승인했다. 즉, PLGA는 생체 내에서 자연적으로 또는 체내에서 대사를 발생하는 젖산 및 글리콜 산으로 배양 중 물로 가수 분해를 통해 락 타이드와 글리콜 라이드의 공중 합체이다. 캡슐화 된 약물 화합물의 확산 및 / 또는 변형 - 방출 조절기구 모두 주위 환경에 방출 될 수있다. COI의 캡슐화 unencapsula 비교 시약의 생체 이용률을 개선 효소 분해에 대한 보호를 제공테드 COI 5. 우리는 PLGA 미세 문화에 그대로 섬에 후보 화합물을 관리하는 데 사용 될 수 있으며, 궁극적으로 생체 내에서하는 것이 좋습니다. 이식 프로토콜을 탐험하기 전에 생체을 섬에 β 세포 분열 촉진 물질을 관리하는 PLGA의 효능을 테스트하는 것은 매우 중요하다.
현재 살아있는 동물의 β 세포 증식을 측정하는 기술도 없다. 실험 따라서 immunolabeling에 대한 pancreata의 다음 해부 및 가공과, 동물을 사는 이들 화합물의 투여를 필요로 생체 내에서 잠재적 인 증식 성 화합물의 효과를 평가합니다. 이러한 프로토콜은 비싸고 힘들고, 그리고 그들이 아일렛 도달 할 어떤 보장없이 전신적으로 투여되는 화합물을 필요로한다. 반대로, 여러 β 불멸화 세포주 배양 인슐린 생성 세포의 연구에 사용할 수 있지만, 이들 세포주는 섬 구조와 environmen 부족t는 유기체 (6) 생활에서 발견. β 불멸화 세포주는, 따라서, 생체 내에서 내인성 β 세포 복제보다 훨씬 높은 수준을 갖는 증식을 유도하는 화합물의 분석이 복잡 특징으로한다. 이 연구에서 우리는 성인 쥐에서 분리 된 그대로 독도를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. β 세포주 달리 그대로 섬 정상 섬 구조를 유지한다. 마찬가지로, 직접 배양 그대로 섬에 증식 화합물을 투여하는, 생체 내에서 실시한 실험 달리 상당히 정확하게 β 세포 증식을 측정하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시킨다.
현재의 연구는이 예에서는, COI를 관리 할 PLGA를 활용, 재조합 인간의 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF). 이 일에 화합물의 지속적인 방출을 허용 여기에 기술 된 방법은 배양 섬에 원료 화합물의 관리를 통해 상당한 이점을 부여E 매질. 특히,이 시험은 단백질이 그대로 섬에 관심 항체의 다양한 관리하도록 변형 될 수있다. α 세포를 포함하는 다른 내분비 세포 유형에 효과가 또한 분석 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 절차가 승인 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행 하였다.
형광 1. 레이블 COI (선택 사항)
- 미세화물을 시각화와 같은 숙신 이미 딜 에스테르 또는 플루오 레세 인 유도체 (단백질에서 예) 자유 급 아민과 반응하여 형광 염료를 선택. 디메틸 술폭 시드 200 ㎕의 (DMSO)에 형광 물질 (COI의 몰에 대해) 8 배 몰 과량을 녹인다.
- 재현 탁 차량 용액 800 μL의 최종 부피 (62.5 NG / μL의 최종 농도)까지 COI 50mg을. 차량 용액 COI의 소스에 따라 달라진다.
참고 : 일반 차량 솔루션은 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 DMSO를 포함한다. - 단계 1.1에서 형광 / DMSO 용액을 모두 추가하고 COI를 재현 탁. 소용돌이 밤새 4 ° C에서. 대안 적으로, 반응 혼합물에 실온에서 와동4 시간 동안 (RT).
- 라벨 반응에 따라, 탈염 컬럼을 사용하여 여분의 형광을 제거합니다.
- 탈염 칼럼으로부터 축적 버퍼 드레인 증류수 16 ㎖로 헹군다. 를 통해 모든 흐름을 폐기하십시오.
- 탈염 컬럼에 형광 표지 된 COI를 추가합니다. 탈 이온수 120 ㎖로 용출하고 통한 흐름을 수집한다.
- 용출 단계를 반복하여 추가로 네 번마다 탈 이온수 1.2 ㎖에 첨가하고, 별도의 샘플 등을 통해 유동을 수집.
- -80 ° C에서 샘플을 통해 수집 된 모든 흐름을 정지하고 24 시간 동안 제조업체의 지침에 따라 동결 건조.
2. 물 -에 - 중유 에멀젼 용매 증발 방법을 통해 마이크로 스피어 준비 COI로드
- 제 수상 (W1)을 형성 증류수 100 ㎕의 1 mg의 형광 표지 COI 추가.
- 폴리 65 mg을 용해 (락트산 - 코 - 글리콜 ACI라) (50 : 50 락 티드 : 글리콜, 분자량 54,000 - 미세 원심 관에 디클로로 메탄 750 μL에서 69,000). 10 초음파 처리 - (160 W에서) 30 초 완전히 PLGA를 용해한다. 이 유상 (O)를 형성한다.
- 드롭 현명한 방식으로 O 단계로 단계 2.1에서 생성 된 W1 단계의 모든를 추가합니다. W1 / O 상을 형성하기 위해 30 초 동안 20,000 rpm에서 휴대용 균질기를 사용하여 유화시킨다.
- 30 초 동안 20,000 rpm에서 1 %의 15 ㎖ (중량 / 부피) 수성 폴리 (비닐 알콜) (PVA) 용액에 적가 방식으로 W1 / O상의 모든 추가 휴대용 균질화기를 사용하여 유화 .
- 용매를 제거하고, 수성 상을 생성하기 위해 1 시간 동안 회전 증발기를 사용하여 635 mmHg의 진공을 200 ml의 둥근 바닥 플라스크 피사체 단계 2.4에서 생성 된 에멀젼의 모든 전송.
- 수성 단계의 나누어지는 1 ml의 단계 2.5 열네에의 microcentrifuge 튜브에서 발생. 7500에서 마이크로 원심 튜브의 수용액을 원심8 분 XG.
주 :이 단계에서, 미소 나머지 수용액에 존재하고 microcentrifuge 관의 바닥에 집중된다. - microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다.
- 각 microcentrifuge 관에 물을 탈 1ml를 추가하여 초과 PVA의 미소를 씻으십시오. microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 8 분 동안 7,500 XG에 원심 분리기, 다시 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다.
참고 : 나머지 100 ㎕의 수용액이 생성 된 마이크로 스피어가 포함되어 있습니다.
- 각 microcentrifuge 관에 물을 탈 1ml를 추가하여 초과 PVA의 미소를 씻으십시오. microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 8 분 동안 7,500 XG에 원심 분리기, 다시 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다.
- -80 ° C에서 270 단계에서 생성 된 미세 수성 용액을 동결.
- 에 따른 동결 건조기를 사용하여 동결 건조 된 마이크로 스피어의 제조-20 ° C에서 지침 및 저장.
주 : 완전히 PLGA 미립자를 용해시키고 유리 단백질 (7)의 표준 곡선의 단백질 농도를 상대적으로 판단하여 COI의 적재 효율을 측정한다. - 네거티브 대조군으로서, (이하 제어 미립자라고도 함) "빈"미소의 배치를 생성한다.
주 : 제어 미립자의 생성 단계 1.2 비히클 용액 800 μL없이 COI 첨가 친수성 COI로드 미립자의 생성과 동일하다. β 세포 미토 겐 분석을위한 COI 로딩 된 PLGA 미립자에 PLGA의 질량 농도 대전 조정 입자.
작은 섬 문화 미디어와 사전 분석 미디어 3. 준비
- 본래 마우스 아일렛의 배양에 200㎖의 용지를 준비 : RPMI 11 mM의 글루코오스, 10 % 말 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 보충 1640 미디어 것은 ml의 스트렙토 마이신 (이하이다라고 /) 문화 미디어를 할 수 있습니다.
주 1 : 소 태아 혈청 (FBS)과 달리, 말 혈청 태반 락토 겐, 증식 분석에서 분석을 교란 β 세포 증식의 유도 없다.
주 2 : PLGA 미립자가 사용 전에 멸균되어 있지 않으므로, 배양액을 항생제 첨가가 미생물 오염을 방지하기 위해 중요하다. - 50 ML 원뿔 튜브의 전자 피펫과 장소와 섬 문화 매체의 25ml를 제거합니다. 예비 분석 미디어를 생성하기 위해 0.2 mM의 EGTA의 최종 농도로 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 섬 배양 배지의 25 ㎖를 보완.
주 : EGTA의 추가는 약간 섬 아키텍처를 변경하지 않고 섬에서 세포 - 세포 연락처를 풀어. 이 섬의 내부 세포에 도달 할 수 COI을 보장하고 중앙 섬의 괴사를 방지하는 데 도움이됩니다.
본래 마우스 독도 4. 배양
- 미리 선택된 균주, 성별, AG에 그대로 섬 격리췌장의 8,9의 일상 콜라게나 소화 다음 마우스의 전자 및 유전자형. 풀 함께 샘플 등으로부터 섬.
- 분취 아일렛 배양액 200 μL의 96 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 40 아일렛. 물론 당 시각적으로 크기 일치 섬 (샘플 사이의 섬 상당 (IEQ)의 정확한 평가는 필요하지 않습니다). 증발 버퍼를 제공하는 200 ㎕의 멸균 수와 섬에 우물 바로 옆에 빈 우물을 입력합니다. 배양은 95 % 공기 및 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 하룻밤 미디어 아일렛.
COI로드 및 제어 PLGA 미소 구의 제 다시 현탁
- 밤새 섬 복구 후 동결 건조 COI 로딩 된 PLGA 미립자의 하나의 분취 량을 사전에 분석 배지를 첨가하여 재현 탁 미립자 등의 microcentrifuge 튜브 COI의 최종 농도가 10 ng의 / μL (주어진 양 COI 존재 량이라고 생성 된 마이크로pheres 단계 2.9)에서 산출 된 것입니다. 4 ℃에서 10 초의 긴 펄스를 W (160)에서 10 분 동안 빙수 욕에서 재현 탁 COI로드 미세 초음파 처리.
- 동결 건조 제어 PLGA 미립자의 동일한 질량을 사전에 분석 배지의 동일한 양을 첨가함으로써 재현 탁 제어 PLGA 미립자. 4 ℃에서 10 초의 긴 펄스를 W (160)에서 10 분 동안 빙수 욕에서 재 부유 제어 PLGA 미립자 초음파 처리.
- 시각 미소가 두 커버 글라스 사이에 재현 탁 미소의 2 μl를 피펫 팅에 의해 분산 확인합니다. 표면 형광 또는 시야 현미경에 40X 목표를 사용하여 미소를 시각화합니다.
- 미소 구체의 현저한 응집이 여전히 보이면 4 ° C에서 10 초의 긴 펄스 및 재 부유 미립자의 반복 시각화 W (160)에서 추가로 10 분 동안 빙수 조에서 초음파 처리.
COI로드 또는 제어 PLGA 마이크로 스피어와 독도 6. 치료 </ P>
- 각 웰은 COI로드 미세 처리 될 때까지 100 ㎕의 최종 부피 및 소정의 최종 농도 미리 분석 미디어 재현 탁 COI 미소 구의 10 NG / μL 희석 분석 매체를 준비한다.
참고 : 단백질의 최적의 최종 농도는이 분석에 사용되는 각각의 COI에 따라 다를 것입니다. 이상적으로는, 최종 농도 범위는 시험된다. - 웰 각각은 대조군으로 사용되기 위해서는, 단계 6.1에서 COI로드 미립자를 희석하기 위해 사용한 것과 동일한 희석 부피 단계 5.2에서 생성 된 재 부유 제어 PLGA 미립자를 희석하여 제어 분석 매체를 준비한다.
참고 : 제어 분석 매체로 처리 독도는 빈 미소가 실험 결과에 미칠 수있는 영향의 탐지를 가능하게하는 음성 대조군 될 것입니다. - 조심스럽게에는 독도가 우물에서 빠질 수없는되도록 마이크로 피펫으로 각 우물에서 섬 배양 배지 100 μl를 제거합니다. 조심스럽게 100 μ를 추가분석 매체 또는 각 웰에 제어 분석 배지 100 ㎕의 L.
- 사흘 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션을 섬.
7. 현미경 슬라이드 상에 본래 독도 분산제
- 삼일 후, 섬을 제거하지 않도록주의 깊게 우물에서 분석 미디어를 제거하고 폐기 마이크로 피펫을 사용합니다. 조심스럽게 분석 미디어 그들을 씻어 독도에 PBS μL (200)를 추가합니다. 조심스럽게 제거하고 마이크로 피펫으로 PBS를 무시하고 부드럽게 추가 200 μl의 PBS 다시 섬을 씻는다.
- 제거하고 마이크로 피펫으로 PBS를 버리고 0.025 % 트립신 100 ㎕, 2 mM의 EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 3 분 동안 실온에서 품어. 피펫은 트립신 EDTA 용액 위로 독도가 육안으로 단일 세포로 분산 확인 될 때까지 아래로 매 2 분에 독도 광학 현미경을 사용하여 (세포의 일부 작은 덩어리가 여전히 존재할 수 있습니다). 각각의 웰에 개개의 전체 볼륨을 전송LY labeled-의 microcentrifuge 튜브로.
- 트립신 매개 세포 분리를 중지 각 microcentrifuge 관에 섬 문화 매체의 400 μl를 추가합니다.
- 4 ° C에서 100 XG에 5 분 원심 분리기 샘플의 microcentrifuge 튜브의 바닥에 작은 섬 세포 펠렛합니다.
- 부드럽게 200 μL 신선한 섬 문화 매체에 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액과에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
- 사이토 원심 분리기를 사용하여, 원심 분리기 청구 현미경 슬라이드에 3 분 140 XG에 독도 해리.
- 실온에서 공기 건조 슬라이드는 10 분 동안, 다음 소수성 마킹 펜으로 해리 섬 주위에 상자를 그립니다.
- 실온에서 10 분 동안 75 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다. 4 % PFA를 제거하고 부드럽게 PBS 75 μL에 두 번 세포를 씻으십시오. 세정 후, 75 ㎕의 0.2 % 트리톤 X-100의 PBS에서 10 분간 세포와 Permeabilize 하시려면. 그런 다음, 75 μl의 PBS로 세포를 씻어.
주의 : PFA는 알레르기 발암 및 독성 것으로 알려져있다. 8. 면역 형광 인슐린에 대한 해리 독도 라벨링 및 세포 증식 마커, 사료된다 - 100 슬라이드 용량 현미경 슬라이드 상자의 바닥이 젖은 종이 타월을 배치하여 습기 챔버를 준비합니다.
- 장소는 습기 챔버에서 아래로 평면 (위를 향 세포)를 슬라이드. 마이크로 피펫을 이용하여 이전의 세척 단계에서 PBS를 흡입 및 차단 용액 75 μl를 첨가하여 표지 용 시료 준비 (5 % 정상 당나귀 혈청 PBS에서 (NDS)) 시료에 대한 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 각 슬라이드. RT에서 1 시간 동안 차단 용액에 슬라이드를 부화.
- 부드럽게 흡 마이크로 피펫을 사용하여 기니아 피그 인슐린과 항 토끼 항 사료된다 항체를 포함하는 차 항체 용액 75 μL를 추가 차단 용액, PBS에서 5 % 1 μg의 NDS / mL로 희석 하였다. 1 시간 동안 실온에서 품어.
참고 : 세포 증식의 대안 마커는 세포 핵 항원 (PCNA)과 phosph 증식 포함ohistone H3 (PH3), - 부드럽게 마이크로 피펫 차 항체 용액을 흡인하고 75 ㎕의 PBS로 세포를 헹군다. 대기음 PBS는 마이크로 피펫을 사용하여 세포를 두 번 이상, 75 μL PBS와 각 시간을 씻어. 실온에서 1 시간 동안 차단 솔루션 2 μg의 / ㎖로 희석 75 μl를 방지 기니 돼지 Cy5에 차 항체 및 항 - 토끼를 Cy3 차 항체와 각 샘플을 품어.
참고 : 이미 미소를 라벨에 사용 된 동일하거나 스펙트럼 중복 형광으로 표지 된 이차 항체를 사용하지 마십시오. - 마이크로 피펫을 사용하여 실온에서 3 분 동안 PBS에서 300 nm의 DAPI의 75 μL에 품어 대기음 이차 항체 솔루션입니다. 대기음 DAPI는 마이크로 피펫을 사용하여 5 분 동안 탈 이온수로 헹군다.
- 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 샘플에서 물을 대기음. 드롭 유리 커버 슬립에 antifade 시약을 포함하는 빠른 건조 장착 용액 (약 100 μl를) 발견. 오, 아래 현미경 슬라이드 샘플 측 전환장착 솔루션 NTO. 부드럽게 거품을 제거하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 물기를 닦아 피펫 팁을 사용하여 슬라이드에 대해 커버 슬립을 누릅니다. 커버 슬립 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다.
- 이미지 획득을위한 부착 된 카메라와 함께 표면 형광 현미경을 사용합니다. 각 형광의 경우, 최적의 노출 시간 (- 사료된다 인슐린 80 밀리, 250 밀리 초 DAPI에 대한 일반적으로 20 밀리 초 40)을 결정한다. 이미지 수집 매개 변수를 모든 샘플에 대해 동일해야합니다.
- 각 샘플의 경우, 수동으로 3,000 인슐린 양성 세포 수를 계산하고 그의 또한 사료된다 양성 얼마나 많은 계산합니다. 만 잘 정의하고 명확하게 보이는 핵이 인슐린 양성 세포를 계산합니다. 인슐린 양성 세포의 총 수에 의해 사료된다 양성 / 인슐린 양성 세포의 수를 나누고 100을 곱하여 샘플마다 β 세포 증식의 비율을 계산한다.
- D 후,β 세포의 증식에 유의 한 차이는 제어 및 일방향 ANOVA 시판 통계 소프트웨어를 사용과 결과를 분석함으로써 실험 샘플 사이에 존재하는 경우, 각 샘플은 β 세포 증식의 비율 etermining 결정.
9. 이미지 수집 및 분석
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1은 위의 프로토콜을 사용하여 생성 된 마이크로 스피어의 시각적 표현이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다양한 크기의 rhCTGF로드 미소를 산출한다. 약간의 미소가 더 큰 (그림 2)있을 수 있지만 마이크로의 가장 큰 부분은 직경이 1 ㎛ 내지 10이됩니다. 원하는 경우, 미세 크기 조정 및 균질화 속도 및 시간, 사용되는 계면 활성제의 농도는, 각각 물 / 오일 / 물 (10)의 상대적인 위상 볼륨으로 제조 파라미터에 기초하여 최적화 될 수있다.
PLGA 미세 및 후속 immunolabeling으로 처리 그대로 섬의 분산에 따라, 세포 (그림 3) 사이에있는 라벨없는 샘플의 영역을 참조하는 것이 일반적입니다. 배양 치료 기간 후에도 그대로 미세 대부분이지만아일렛은 현미경 슬라이드 상에 방사 된 후 세척 단계에서 제거되고, 일부는 남아있다. 이러한 미소 구체는 촬상 중에 가시화 구멍 형 구조를 야기한다. 이 잔류 미립자는 일반적으로 후속 정량과 간섭하지 않는다.
촬상 후 사료된다 양성 / 인슐린 양성 세포의 비율은 직접 표지 된 세포의 수를 세고, 소프트웨어 이미지 분석을 이용하여 정량화 할 수있다. 이전에, 우리는 재조합 인간의 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF)이 생체 (11) 그대로 섬에 마우스 β 세포 증식을 자극 할 수 있음을 증명하고있다. 상기 프로토콜을 사용하여, 우리는 rhCTGF (rhCTGF-PLGA)를 포함 PLGA 마이크로 스피어를 생성합니다. 삼일은 단백질이 싸다하지 않았다 것으로 보여, 이전에 원시 단백질과보고 된 β 세포 증식에 유사한 증가의 결과에 대한 rhCTGF-PLGA의 미소와 함께 그대로 섬 치료 마이크로 스피어 생성 (그림 4) 중에 기능을 SE는.
그림 1 :. PLGA 마이크로 스피어의 시각적 표현 제조 프로토콜에 형광 염료를 통합함으로써이 PLGA 마이크로 스피어는 epifluorescent 현미경을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 크기 분포는 다르지만 PLGA 미소 구의 크기 분포 대부분 미소 직경 10㎛ 미만이어야한다.arget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 분산은 β 세포 증식의 면역 형광 시각화 분산 된 섬은 β 세포 증식 표시하는 확산 마커 사료된다 (빨간색)과 인슐린 (녹색)에 대한 immunolabeled된다. 핵은 DAPI (파란색)으로 표시됩니다. 화살표는 사료된다 양성 / 인슐린 양성 세포를 나타냅니다. 별표 (*)는 undegraded 미소를 나타냅니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
β 세포 프로의 정량 및 분석 : 그림 4월콧 샌더는. rhCTGF-PLGA 미립자의 상이한 양으로 처리 아일렛. 사료된다 양성 / 인슐린 양성 세포의 수는 모든 샘플에서 직접 계산 및 인슐린 양성 β 세포의 총 수의 백분율로 표시 하였다. X 축은 각 치료 rhCTGF 존재하는 최종 농도에 대응한다. 통계적 유의성은 ANOVA는 Tukey에의 다중 비교 시험 하였다 일방을 사용하여 측정 하였다. 통계적 유의성은 P는 ≤ 0.05로 설정 하였다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
문화의 β 세포 증식의 연구는 일반적으로 여러 가지 어려움에 의해 방해된다. 우선, β 불멸화 세포주 라이브 아일렛 내인성 β 세포에서 발견 된 것보다 더 높은 정도의 증식을 특징으로한다. 또한 이러한 불멸화 세포주 정상 β 세포 기능에 중요한 일반 아키텍처 부족하다. 이 두 가지 사실이 결과는 생체 내에서 또는 전체 섬에서 시험했을 때 성립됩니다 불후의 β 세포 라인을 사용하여 얻은 경우 어려운 결정 할 수 있습니다. 작은 섬 구조가 유지 β 세포 증식이 생체 내에서 발견되는 것과 비교할 바와 같이 갓 절연 그대로 마우스 아일렛을 사용하는 우리의 설명 프로토콜은 이러한 문제를 회피.
그대로 독도를 배양 한 가지 중요한 관심사는 섬 코어 내에서 세포가 저산소증에 의한 괴사를 받게 될 것이다 또는 rhCTGF에 노출되지 않습니다 가능성이다. 이 때문에, 최종0.1 밀리미터 EGTA의 농도는 섬 아키텍처를 방해하지 않고 세포 - 세포 연락처를 풀어 미디어에 추가됩니다. 우리는 이전에 EGTA 단독의 첨가가 섬 코어 (12)에 미디어의 영양소 및 유사 분열의 증가 액세스 아마도 때문에 β 세포 증식을 증가시킬 수 있음을 발표 하였다. EGTA의 질문에 답변 β 세포 증식의 증가는 세포 - 세포 접촉 자체 13,14의 감소로 인해 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명하는 매체는 말 혈청 대신 전통적인 소 태아 혈청으로 보충한다. 이 교체로 인해 잠재적으로 증식 분석에서 분석 복잡 자체 β 세포 증식을 자극 할 수있는 소 태아 혈청 태반 락토 겐의 존재로 이루어진다.
췌장 세포합니다 (COI 함께 또는없이) PLGA 미립자의 상대적인 독성의 결정 (MA)의 면역 형광 분석을 통해 평가할 수있다TUNEL 또는 γ-H2AX (15, 16)를 포함하는 세포 사멸 또는 DNA 손상의 rkers. PLGA 미립자의 첨가는 생체 아일렛에 명백한 악영향을 도시하지 않았지만, 사용자는 미소 이미지 분석에 미칠 수있는 효과를 알고 있어야한다. 그림 3에서 설명하고 결과 섹션에서 언급 한 바와 같이, undegraded 미세 증가 농도가 이용 될 때 나타나는 더 미소와 면역 형광 이미지에서 어두운 반점으로 알 수 있습니다.
이는 설명 프로토콜 절연 마우스 아일렛 작동하도록 맞추어되었음을 주목해야한다. 동일한 조건은 래트 및 인간과 같은 다른 유기체에서 수확 아일렛 작동한다면 이와 같이,이 불분명하다. 다른 생물은 종종 다른 최적의 배양 조건과 β 세포 증식 (17, 18)의 다른 학위를 가지고에서 특히, 수확 islets에.
수많은 biomaterials 잠재적 폴리 (thioketal 우레탄) 및 폴리 (프로필렌 설파이드) (19)를 포함 고립 된 섬에 rhCTGF을 관리 할 수 있습니다. 우리는 그것 때문에 가지고 몇 가지 주목할만한 특성에 PLGA에 집중하기로 결정했습니다. 먼저, PLGA는 비교적 저렴한 시약이며 대부분 미소 연구 기관에서 사용 가능한 표준 장비 (원심 분리기, 균질화, 동결 건조기)를 생성 할 수있다. PLGA는 생체 적합성, 생분해 성 및 화합물의 방출 속도 (20)을 조절하는 능력 때문에 FDA 승인 된 장치에서 성공적으로 사용하기위한 전례가 인공 중합체이다. PLGA 과정에서화물을 방출 물의 존재하에 가수 분해에 의해 분해. 화합물을 몇 주일의 기간 동안 생체 내에서 방출되는 PLGA 입자의 화학 조성은 조정될 수있다. PLGA는 로컬 다양한 기관과 tissu에 화합물 관리에 전임상 동물 실험과 인간의 임상 치료에 사용되어왔다에스 21, 22. 다른 소수성 중합체는 생분해 성 미립자의 생성에 사용될 수있다. 이들 중합체는 예컨대 산도, 온도, 반응성 산소 종 (23, 24)의 존재와 같은 특정 환경 적 자극에 반응 할 수있다. 따라서, 연구진은 조심스럽게 자신의 연구에 가장 적합한 생체 재료 고려해야합니다.
PLGA, 또는 다른 생체 재료를 사용하는 모든 연구원은 캡슐화 COI에 비해 캡슐화 된 COI의 효과 사이의 전위차 알고 있어야 β 세포 증식 생체을 연구한다. 예를 들어, PLGA 통해 rhCTGF의 배달 봉입 단백질 치료에 비해 β 세포 증식 유도 정도의 타이밍을 변경할 수있다. 우리의 실험실에서 진행하는 연구는 현재 이러한 잠재적 인 차이를 조사하고있다.
배양 섬의 β 세포 증식의 분석은 식별 및 나를위한 강력한 모델입니다β 세포 분열 촉진 물질의 chanistic 분석. 우리가 확장 된 릴리스 배달 차량에 고립 된 배양 섬에 COI 관리를위한 상대적으로 신속하고 비용 효율적인 방법을 보여 여기에 설명 된 분석을 사용. 이 분석은 순전히 그 이전에 발행 된 생체 내에서 β 세포 증식을 자극 할 수있는 능력과 생체 (11)을 기반으로 CTGF에 초점을 거의 모든 관심의 COI, 우리의 선택에 적용해야합니다. 또한,이 분석은 아일렛이 생체에 이식 모델로 진행하기 전에 효과 및 배송 방법으로서 PLGA를 사용하여 안전성을 확인할 수있다. 전반적으로 설명 프로토콜은 이식 가능한 조직에 PLGA의 안전성을 측정에 폭 넓은 영향 배양 섬에 화합물을 관리 할 수있는 새로운 방법을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
