Abstract
Udviklingen af biomaterialer steget betydeligt potentiale til målrettet lægemiddelafgivelse til en række celle- og vævstyper, herunder de pankreatiske p-celler. Desuden biomateriale partikler, hydrogeler og stilladser også giver en unik mulighed for at administrere vedholdende, at kontrollerbar drug delivery p-celler i kultur og transplanterede væv modeller. Disse teknologier gør det muligt at studere kandidat β-celle spredning faktorer ved hjælp af intakte holme og et translationelt relevant system. Desuden bestemme effektivitet og gennemførlighed af kandidat faktorer for at stimulere β-celle proliferation i en kultur-system er kritisk inden vi går videre til in vivo modeller. Heri beskriver vi en metode til at co-kultur intakte mus holme med biologisk nedbrydelig forbindelse af interesse (COI) -loaded poly (mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) mikrokugler med henblik på at vurdere virkningerne af vedvarende in situ frigivelse of mitogene faktorer på β-celleproliferation. Denne teknik beskriver i detaljer, hvordan man kan generere PLGA mikrokugler indeholdende et ønsket last ved anvendelse af kommercielt tilgængelige reagenser. Mens den beskrevne teknik anvender rekombinant humant Bindevæv vækstfaktor (rhCTGF) som et eksempel, kan en lang række COI let anvendes. Desuden er denne fremgangsmåde anvender plader med 96 brønde for at minimere mængden af reagenser nødvendige for at vurdere β-celleproliferation. Denne protokol kan let tilpasses til at anvende alternative biomaterialer og andre endokrine celle karakteristika såsom celleoverlevelse og differentiering status.
Introduction
Pankreatiske p-celler er de eneste insulinproducerende celler i kroppen og er afgørende for at opretholde blodglukose homøostase. Mens sunde individer har tilstrækkelig β-cellemasse og funktion til korrekt regulere blodsukker, er individer med diabetes er karakteriseret ved utilstrækkelig β-cellemasse og / eller funktion 1,2. Det er blevet foreslået, at inducere β-celleproliferation i sidste ende kan øge β-cellemassen og genoprette glucosehomøostase hos personer med diabetes 3. Men er nødvendige evaluering og validering af potentielle β-celle-proliferative forbindelser i intakte holme, før der kan udvikles effektive behandlinger. Transplantation af kadaver humane øer i personer med diabetes genskaber blodsukker homøostase i nogen tid, men tilgængeligheden og succes denne eksperimentelle procedure hindres af mangel på humane øer til rådighed til transplantation og ved p-celledød i øerne agteris transplantation 4. Selv med opdagelsen af faktorer, der inducerer opformering af insulinproducerende celler, findes en stor udfordring stadig i afgivelse af disse faktorer til relevante steder in vivo. En strategi for vedvarende lokal levering af β-celle-proliferative forbindelser er poly (mælke-co-glycol) syre (PLGA). PLGA har en historie af brug i FDA godkendte drug delivery produkter på grund af sin høje sikkerhed, bionedbrydelighed, og release kinetik udvidede 5. Specifikt PLGA er en copolymer af lactid og glycolid, der nedbrydes ved hydrolyse med vand enten in vivo eller i kultur til mælkesyre og glycolsyre, som er naturligt forekommende metabolitter i kroppen. Det indkapslede lægemiddelforbindelse kan frigives i det omgivende miljø ved både diffusion og / eller mekanismer nedbrydnings--kontrolleret frigivelse. Indkapsling af COI giver beskyttelse mod enzymatisk nedbrydning, at forbedre biotilgængeligheden af reagenset i forhold til unencapsulaTed COI 5. Vi foreslår, at PLGA-mikrosfærer kan anvendes til at administrere kandidatforbindelser til intakte øer i kultur, og i sidste ende in vivo. Test af effektiviteten af PLGA at administrere β-celle mitogener til holme ex vivo er kritisk inden transplantation protokoller udforskes.
I øjeblikket er der ingen teknik til at måle β-celleproliferation i levende dyr. Forsøg på at vurdere effektiviteten af potentielle proliferative forbindelser in vivo derfor behøve administration af disse forbindelser til levende dyr, med efterfølgende dissektion og behandling af pancreas for immunolabeling. Sådanne protokoller er dyre og arbejdskrævende, og kræver forbindelsen skal indgives systemisk, uden nogen garanti for, at de vil nå øerne. Omvendt flere immortaliserede β-cellelinier er tilgængelige til undersøgelse af insulin-producerende celler i kultur, men disse cellelinier mangler ø-arkitektur og milt findes i levende organismer 6. Immortaliserede β-cellelinier også kendetegnet ved at have en meget højere grad af replikation end endogene p-celler in vivo, hvilket komplicerer analysen af forbindelser, der inducerer proliferation. I denne undersøgelse beskriver vi en protokol, som anvender intakte øer isoleret fra voksne mus. I modsætning β-cellelinier, intakte øer bevarer normal ø-arkitektur. Ligeledes i modsætning til eksperimenter udført in vivo, der administrerer proliferative forbindelser direkte til dyrkede intakte øer signifikant reducerer mængden af reagenser, som er nødvendige for præcist at måle β-celleproliferation.
Den aktuelle undersøgelse anvender PLGA at indgive en COI, i dette eksempel, rekombinant human Connective Tissue Growth Factor (rhCTGF). Den her beskrevne fremgangsmåde giver en betydelig fordel i forhold til administration af rå forbindelse til dyrkede øer da det giver mulighed for en kontinuerlig frigivelse af forbindelse i the medier. Især kan dette assay modificeres til at administrere en lang række proteiner og antistoffer af interesse for intakte øer. Virkninger på andre endokrine celletyper, herunder a-celler, kan også analyseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med Vanderbilt Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Mærkning COI med fluorophor (valgfri)
- Vælg et fluorescerende farvestof, som vil reagere med en fri primær amin (fx på et protein), såsom succinimidylestere eller fluoresceinderivater, at visualisere mikrosfære last. Opløs 8x molært overskud (i forhold til mol COI) af fluorofor i 200 pi dimethylsulfoxid (DMSO).
- Resuspender 50 mg COI op til et slutvolumen på 800 pi i et køretøj opløsning (slutkoncentration på 62,5 ng / pl). Køretøjet løsning vil variere afhængigt af kilden til COI.
BEMÆRK: Typisk køretøj løsninger omfatter phosphatbufret saltvand (PBS) eller DMSO. - Tilføj alle fluoroforen / DMSO-opløsningen fra trin 1.1 og resuspender COI. Vortex natten over ved 4 ° C. Alternativt vortexes reaktionsblandingen ved stuetemperatur(RT) i 4 timer.
- Efter mærkningsreaktionen, fjerne overskydende fluorofor ved anvendelse af en afsaltningskolonne.
- Drain opbevaringspuffer fra afsaltning søjle og skylles med 16 ml deioniseret vand. Kassér alle flow igennem.
- Tilsæt fluorescensmærket COI til afsaltningssøjle. Elueres med 1,2 ml deioniseret vand og indsamle gennemstrømningen.
- Gentag elueringstrin yderligere fire gange, hver gang tilsætte 1,2 ml deioniseret vand og opsamling af gennemstrømningen som separate prøver.
- Frys alle indsamlede strømning gennem prøver ved -80 ° C og lyofiliseres ifølge producentens instruktioner til 24 timer.
2. COI-loaded mikrosfærepræparationen via vand-i-olie-i-vand-emulsion opløsningsmiddelafdampningsmetoden
- Tilsæt 1 mg fluorescensmærket COI til 100 pi deioniseret vand til dannelse af den første vandfase (W1).
- Opløs 65 mg poly (mælke-co-glycolsyre acid) (50:50 lactid: glycolid molekylvægt 54.000 - 69.000) i 750 pi dichlormethan i et mikrocentrifugerør. Ultralydsbehandles til 10 - 30 sekunder (ved 160 W) for at opløse PLGA. Dette danner oliefasen (O).
- Tilføj alle W1 fase er frembragt i trin 2.1 til O fase i en dråbevis måde. Emulgere ved anvendelse af en håndholdt homogenisator ved 20.000 rpm i 30 sek til dannelse af W1 / O fasen.
- Tilføj alle W1 / O fase i en dråbevis måde til 15 ml af en 1% (vægt / volumen) vandig poly (vinylalkohol) (PVA) opløsning og emulgere ved anvendelse af en håndholdt homogenisator ved 20.000 rpm i 30 sek .
- Overfør hele af emulsionen dannet i trin 2.4 til en 200 ml rundbundet kolbe og genstand for en 635 mm Hg vakuum under anvendelse af en rotationsfordamper i 1 time for at fjerne opløsningsmidlet og generere den vandige fase.
- Alikvote 1 ml af den vandige fase dannet i trin 2.5 til fjorten mikrocentrifugerør. Centrifugering af vandige opløsning i mikrocentrifugerør ved 7.500xg i 8 min.
BEMÆRK: I dette trin mikrosfærerne er til stede i den resterende vandige opløsning og koncentreres til bunden af mikrocentrifugerør. - Fjern forsigtigt 900 pi vandig opløsning fra mikrocentrifugerør med en mikropipette, pipettering, så den ikke forstyrrer mikrosfærerne på bunden af mikrocentrifugerør.
- Vask mikrosfærer af overskydende PVA ved tilsætning af 1 ml deioniseret vand til hvert mikrocentrifugerør. Centrifuger ved 7.500 xg i 8 min, og igen forsigtigt fjerne 900 pi vandig opløsning fra mikrocentrifugerør med en mikropipette, pipettering, så den ikke forstyrrer mikrosfærerne på bunden af mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: De resterende 100 pi vandige opløsning indeholder de genererede mikrosfærer.
- Vask mikrosfærer af overskydende PVA ved tilsætning af 1 ml deioniseret vand til hvert mikrocentrifugerør. Centrifuger ved 7.500 xg i 8 min, og igen forsigtigt fjerne 900 pi vandig opløsning fra mikrocentrifugerør med en mikropipette, pipettering, så den ikke forstyrrer mikrosfærerne på bunden af mikrocentrifugerør.
- Frys vandige mikrosfære opløsning frembragt i trin 2.7 ved -80 ° C.
- Lyofilisere mikrosfærer ved anvendelse af en frysetørrer ifølge producentensinstruktioner og opbevares ved -20 ° C.
BEMÆRK: Mål belastningseffektivitet af COI ved fuldstændigt at opløse PLGA mikrokugler og bestemmelse af proteinkoncentration i forhold til en standardkurve for den frit protein 7. - Som en negativ kontrol, generere et parti af "tomme" mikrosfærer (herefter benævnt kontrolmikrosfærer).
BEMÆRK: Produktion af kontrolmikrosfærer er identisk med frembringelsen af hydrofile COI mikrosfærer, med ingen COI tilsætning til 800 pi af køretøjets opløsning i trin 1.2. Match kontrol partikler i massekoncentration af PLGA i forhold til COI-loaded PLGA mikrokugler for β-celle mitogen assay.
3. Fremstilling af Islet dyrkningsmedier og Pre-assay Media
- Forbered 200 ml medier til dyrkning af intakte muse-øer: RPMI 1640 medium suppleret med 11 mM glucose, 10% hesteserum, 100 U / ml penicillin G og 100 pg / ml streptomycin (herefter kaldet erlad kulturmedier).
NOTE 1: I modsætning føtalt bovint serum (FBS), mangler hesteserum placentalactogen, en inducer af β-celleproliferation, hvilket forvirrer analyse i proliferationsassay.
NOTE 2: Som PLGA mikrokuglerne ikke er steriliseret før anvendelse ved tilsætning af antibiotika til dyrkningsmediet er afgørende at undgå mikrobiologisk forurening. - Fjern 25 ml ø-dyrkningsmedier med en elektronisk pipette og anbringes i et 50 ml konisk rør. Supplere de 25 ml islet dyrkningsmedier i 50 ml konisk rør med en slutkoncentration på 0,2 mM EGTA til at generere den præ-assaymedier.
BEMÆRK: Tilføjelsen af EGTA mildt løsner celle-celle kontakter i holme uden at ændre ø arkitektur. Dette hjælper med at sikre COI kan nå de indre celler i islet og hjælper med at forhindre nekrose af den centrale islet.
4. Dyrkning af intakt Mouse Islets
- Isoler intakte øer fra en forudvalgt stamme, køn age og genotype af mus efter en rutinemæssig collagenasefordøjelse i bugspytkirtlen 8,9. Pool sammen holme fra lignende prøver.
- Alikvot 40 øer i én brønd i en 96-brønds vævsdyrkningsplade i 200 pi ø-dyrkningsmedier. Visuelt størrelse-match holme per brønd (en nøjagtig vurdering af ø ækvivalens (IEQ) mellem prøverne er ikke nødvendigt). Fylde tomme brønde umiddelbart tilgrænsende til brønde med øer med 200 pi sterilt vand for at tilvejebringe en fordampning buffer. Kultur holme i medier natten over ved 37 ° C under en atmosfære af 95% luft og 5% CO2.
5. Re-suspension af COI-lastes og Kontrol PLGA mikrosfærer
- Efter natten over islet nyttiggørelse, resuspender mikrosfærer ved tilsætning pre-assaymedier til en aliquot af frysetørrede COI-fyldte PLGA mikrokugler, således at slutkoncentrationen af COI i mikrocentrifugerør er 10 ng / pl (mængden af COI stede i en given mængde de genererede microsatmosfærer blev bestemt i trin 2.9). Sonikeres de resuspenderede COI mikrosfærer i et isvandbad i 10 minutter ved 160 W med 10 sek lange pulser ved 4 ° C.
- Resuspender kontrol PLGA mikrosfærer ved at tilsætte det samme volumen af præ-assaymedier til en tilsvarende masse af lyofiliseret kontrol PLGA mikrokugler. Sonikeres De resuspenderede kontrol PLGA mikrokugler i et isvandbad i 10 minutter ved 160 W med 10 sek lange pulser ved 4 ° C.
- Bekræft visuelt mikrosfærer dispergeret ved pipettering 2 pi resuspenderede mikrokugler mellem to dækglas. Visualiser mikrosfærer ved hjælp af en 40X objektiv på et epifluorescens eller lysfelt mikroskop.
- Hvis det er signifikant aggregation af mikrosfærer er stadig synlig, soniker i et is-vandbad i yderligere 10 minutter ved 160 W med 10 sek lange pulser ved 4 ° C og gentag visualisering af resuspenderede mikrokugler.
6. Behandling af Islets med COI-lastes eller Kontrol PLGA mikrosfærer </ P>
- For hver brønd, der skal behandles med COI mikrosfærer, forberede assaymedier ved fortynding af 10 ng / pl af den genopslæmmede COI mikrosfærer med præ-assaymedier til et endeligt volumen på 100 pi og en forudbestemt slutkoncentration.
BEMÆRK: Den optimale slutkoncentration af proteinet vil variere for hver COI anvendes til dette assay. Ideelt set er en række slutkoncentrationer testet. - For hver brønd til anvendelse som en kontrol, forberede kontrol assaymedier ved fortynding de resuspenderede kontrol PLGA mikrokugler genereret i trin 5,2 med den samme fortynding volumen anvendes til at fortynde de COI mikrosfærer i trin 6.1.
BEMÆRK: Islets behandlet med kontrol assay medierne vil tjene som en negativ kontrol for at muliggøre påvisning af nogen effekt de tomme mikrosfærer kan have på de eksperimentelle resultater. - Fjern forsigtigt 100 pi holm dyrkningsmedier fra hver brønd med en mikropipette sådan at ingen øer fjernes fra brøndene. Forsigtigt tilsættes 100 μl assay medier eller 100 pi kontrol assaymedier til hver brønd.
- Inkuber øer ved 37 ° C under en atmosfære af 95% luft og 5% CO2 i tre dage.
7. Dispergering Intakte Islets onto Mikroskop Slides
- Efter tre dage, så brug en mikropipette til forsigtigt at fjerne og kassere assay medier fra alle brønde for ikke at fjerne øer. Forsigtigt tilsættes 200 pi PBS til holme at vaske dem for analysen medier. Fjern forsigtigt og kassér PBS med en mikropipette og forsigtigt vaske holme igen med yderligere 200 pi PBS.
- Fjern og kassér PBS med en mikropipette og tilsæt 100 ul 0,025% trypsin, 2 mM EDTA-opløsning. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min. Pipetter holme i trypsin-EDTA-opløsning op og ned hver 2 min, indtil øer visuelt bekræftet at blive dispergeret i enkelte celler (bemærk, at nogle små klumper af celler stadig kan være til stede) ved hjælp af et lysmikroskop. Overfør hele mængden af hver brønd individly i labeled- mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 400 pi ø-dyrkningsmedier til hver mikrocentrifugerør at stoppe trypsin-medieret celle dissociation.
- Centrifugér prøver i 5 minutter ved 100 xg ved 4 ° C for at pelletere øceller til bunden af mikrocentrifugerør.
- Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af en mikropipette, og resuspender pellet i 200 pi frisk holm kulturmedier.
- Ved hjælp af en cyto-centrifuge, centrifuge dissocierede holme ved 140 xg i 3 min på ladede objektglas.
- Lufttør objektglas ved stuetemperatur i 10 minutter, derefter tegne en boks rundt om de dissocierede øer med en hydrofob markeringspen.
- Fix celler med 75 pi 4% paraformaldehyd (PFA) ved stuetemperatur i 10 min. Fjern 4% PFA og forsigtigt vaske celler i 75 pi PBS to gange. Efter vask, permeabilisere celler med 75 pi 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 min. Derefter vaskes celler med 75 pi PBS.
Forsigtig: PFA er kendt for at være allergifremkaldende, kræftfremkaldende og giftige. 8. Immunofluorescens Mærkning af Dissocierede Islets for Insulin og Cell Proliferation Marker, Ki67 - Forbered et fugtigt kammer ved at placere to våde papirservietter i bunden af en 100 dias kapacitet objektglas kassen.
- Place glider flade ned (celler opad) i fugtigt kammer. Fremstille prøver til mærkning ved sugning PBS fra det foregående vasketrin under anvendelse af en mikropipette og tilsætning 75 pi blokeringsopløsning (5% Normal Donkey Serum (NDS) i PBS) til hver slide for at blokere ikke-specifik binding af antistoffer til prøverne. Inkuber objektglassene i blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur.
- Forsigtigt aspireres blokerende opløsning under anvendelse af en mikropipette og tilsæt 75 pi primære antistof indeholdende marsvine-anti-insulin og kanin-anti-Ki67-antistoffer, fortyndet 1 ug / ml i 5% NDS i PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
BEMÆRK: Alternative markører for celleproliferation indbefatter prolifererende cellekerneantigen (PCNA) og phosphohistone H3 (PH3), - Forsigtigt aspirere primært antistof løsning med en mikropipette og skyl cellerne med 75 pi PBS. Aspirer PBS under anvendelse af en mikropipette og skyl celler to gange mere, hver gang med 75 pi PBS. Inkuber hver prøve med 75 pi anti-marsvine Cy5 sekundært antistof og anti-kanin-Cy3 sekundært antistof fortyndet til 2 ug / ml i blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Brug ikke sekundære antistoffer mærket med det samme eller spektralt overlappende fluorophor, som allerede blev brugt til at mærke mikrosfærerne. - Aspirer sekundært antistof løsning med en mikropipette og inkuberes i 75 pi 300 nM DAPI i PBS i 3 minutter ved stuetemperatur. Aspirer DAPI anvendelse af en mikropipette og skyl i deioniseret vand i 5 minutter.
- aspirere forsigtigt vand fra prøver under anvendelse af en mikropipette. Spot en dråbe (ca. 100 ul) af hurtigtørrende montering opløsning indeholdende antifade reagens på et dækglas. Invert mikroskopobjektglasset prøvesiden nedad, onto den monteringsløsning. Tryk forsigtigt dækglasset mod dias ved hjælp af en pipette tip til at fjerne bobler og tørre overskydende væske med en blød renseserviet. Tillad dækglas tørre natten over ved stuetemperatur.
- Brug en epifluorescensmikroskop med en vedhæftet kamera til billedoptagelse. For hver fluorophor, bestemme den optimale eksponeringstid (typisk 20 ms for DAPI, 40 - 80 msek for insulin, og 250 msek for Ki67). Sørg billedoptagelse parametre står lige for alle prøver.
- For hver prøve manuelt tælle 3.000 insulin-positive celler og af dem tælle, hvor mange er også Ki67-positive. tæller kun insulin-positive celler, der har en veldefineret og let synligt kerne. Beregn procentdelen af prolifererende p-celler for hver prøve ved at dividere antallet af Ki67-positive / insulin-positive celler med det samlede antal af insulin-positive celler og gange med 100.
- efter ded opgørelsen procentdelen af prolifererende p-celler for hver prøve, afgøre, om en statistisk signifikant forskel i β-celleproliferation eksisterer mellem kontrol- og forsøgsprøver ved at analysere resultater med en envejs ANOVA under anvendelse af kommercielt tilgængelige statistiske software.
9. Image Acquisition og Analysis
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er en visuel repræsentation af mikrokuglerne frembragt ved anvendelse af ovennævnte protokol. Protokollen beskrevet her giver rhCTGF mikrosfærer i forskellige størrelser. Den største fraktion af mikrosfærer vil være mellem 1 og 10 um i diameter, selvom nogle mikrosfærer kan være større (figur 2). Om ønsket kan mikrosfære størrelse indstilles og optimeres baseret på fabrikation parametre såsom homogenisering hastighed og tid, koncentration af overfladeaktivt middel anvendes, og relative mængder af hver vand / olie / vand fase 10.
Efter spredning af intakte øer behandlet med PLGA mikrokugler og efterfølgende immunolabeling, er det almindeligt at se områder af prøven blottet for enhver mærkning i mellem celler (figur 3). Mens de fleste af mikrokuglerne, der stadig intakt efter behandlingen dyrkningsperiode erfjernes under vasketrinene nogle forbliver efter øerne er spundet på mikroskopobjektglas. Disse mikrosfærer forårsage hole-lignende strukturer visualiseret under billedbehandling. Disse resterende mikrokugler typisk ikke forstyrrer efterfølgende kvantificering.
Efter billeddannelse, kan procentdelen af Ki67-positive / insulin-positive celler kvantificeres ved manuelt at tælle det totale antal af mærkede celler, eller ved hjælp af software billedanalyse. Vi har tidligere vist, at rekombinant human Connective Tissue Growth Factor (rhCTGF) kan stimulere muse β-celleproliferation i intakte øer ex vivo 11. Ved hjælp af ovennævnte protokol, genereret vi PLGA mikrosfærer indeholdende rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Behandling intakte holme med rhCTGF-PLGA mikrokugler i 3 dage resulterede i en tilsvarende stigning i β-celle proliferation som tidligere rapporteret med den rå protein, hvilket viser, at proteinet ikke lo SE nogen funktionalitet under mikrosfære generation (figur 4).
Figur 1:. Visuel repræsentation af PLGA-mikrosfærer ved at inkorporere et fluorescerende farvestof i protokollen fremstilling, kan PLGA mikrokugler visualiseres under anvendelse af et epifluorescensmikroskop. Scale søjle repræsenterer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Størrelsesfordelingen af PLGA-mikrosfærer Selvom størrelsesfordeling kan variere, vil de fleste mikrokugler være mindre end 10 um i diameter.Arget = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Immunfluorescerende visualisering af dispergeret Prolifererende P-celler Spredt øer immunolabeled for proliferationsmarkør Ki67 (rød) og insulin (grøn) til at markere prolifererende p-celler. Kerner mærket med DAPI (blå). Pile angiver Ki67-positive / insulin-positive celler. Stjerner (*) indikerer nedbrudte mikrosfærer. Scale søjle repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kvantificering og analyse af β-celle-Proliferation. holme behandles med forskellige mængder af rhCTGF-PLGA. Antallet af Ki67-positive / insulin-positive celler blev manuelt talt fra alle prøver og udtrykt som en procentdel af det samlede antal insulin-positive p-celler. X-aksen svarer til den endelige koncentration af rhCTGF stede i hver behandling. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af en envejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligningstest. Statistisk signifikans blev sat til p ≤ 0,05. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet af β-celleproliferation i kultur typisk hæmmet af adskillige vanskeligheder. Først immortaliserede β-cellelinjer kendetegnet ved højere grader af proliferation end hvad der er fundet i endogene p-celler i levende øer. Derudover disse immortaliserede cellelinjer mangler den normale arkitektur er kritisk for normal β-cellefunktion. Disse to fakta gør det vanskeligt at afgøre, om resultater opnået ved anvendelse af immortaliserede β-cellelinjer vil være tilfældet, når det afprøves in vivo eller in hele øer. Vores beskrevne protokol, som anvender frisk isolerede intakte muse-øer, omgår disse problemer som ø-arkitektur bevares og β-celleproliferation kan sammenlignes med den, der findes in vivo.
En væsentlig bekymring, når dyrkning intakte øer er muligheden for, at celler i ø-kerne vil undergå hypoxi-induceret nekrose eller ikke vil blive udsat for rhCTGF. Af denne grund en endeligkoncentration på 0,1 mM EGTA tilsættes til mediet for at løsne celle-celle-kontakter uden at forstyrre holm arkitektur. Vi har tidligere offentliggjort, at tilsætningen af EGTA alene kan forøge β-celleproliferation, formodentlig på grund af øget adgang af næringsstoffer og mitogener i medierne til ø-kernen 12. Stigningen i β-celle-proliferation som respons på EGTA kunne også skyldes faldet i celle-celle-kontakt selve 13,14. De i denne protokol medie er også suppleret med hesteserum i stedet for den mere traditionelle kalvefosterserum. Denne substitution udføres på grund af tilstedeværelsen af placentalactogen i føtalt bovint serum, som kan stimulere β-celleproliferation i sig selv potentielt komplicerer analysen i proliferationsassay.
Bestemmelse af den relative toksicitet af PLGA mikrokugler (med eller uden COI) til ø-cellerne kan vurderes ved immunofluorescensanalyse af markers af celledød eller DNA-skader, herunder TUNEL eller γ-H2AX 15,16. Selv tilsætning af PLGA ikke har vist nogen tydelige skadelige virkninger for holme ex vivo, skal brugerne være opmærksomme på de virkninger, mikrokuglernes kan have på billedanalyse. Som påvist i figur 3 og nævnt i resultatafsnittet, kan nedbrudte mikrosfærer fremgå som mørke pletter inden immunfluorescerende billeder, med flere mikrokugler vises, når stigende koncentrationer er udnyttet.
Det skal bemærkes, at den beskrevne protokol er blevet skræddersyet til at arbejde med isolerede mus øer. Som sådan er det uklart, om identiske betingelser vil arbejde med øer høstet fra alternative organismer, såsom rotter og mennesker. Især, holme høstet fra forskellige organismer ofte har forskellige optimale dyrkningsbetingelser og forskellige grader af β-celle proliferation 17,18.
Talrige BIOMaterialer er potentielt til rådighed til at administrere rhCTGF til isolerede holme, herunder poly (thioketal-urethan) og poly (propylen sulfid) 19. Vi valgte at fokusere på PLGA på grund af flere bemærkelsesværdige kvaliteter, det besidder. Først PLGA er en forholdsvis overkommelig reagens og mikrosfærer kan genereres med standardudstyr (centrifuge, homogenisator, frysetørrer) findes på de fleste forskningsinstitutioner. PLGA er en kunstig polymer, som har præcedens for vellykket anvendelse i FDA godkendte anordninger på grund af sin biokompatibilitet, bionedbrydelighed, og dens evne til at modulere forbindelse afgivelseshastigheder 20. PLGA nedbrydes ved hydrolyse i nærvær af vand, frigiver sin last i processen. Den kemiske sammensætning af PLGA-partikler kan skræddersys således, at en forbindelse frigives in vivo over en periode på flere uger. PLGA er også blevet anvendt i prækliniske dyreforsøg og humane kliniske behandlinger til lokalt at administrere forbindelser til forskellige organer og tissues 21,22. Andre hydrofobe polymerer kan også anvendes i frembringelsen af bionedbrydelige mikrosfærer. Disse polymerer kan reagere på specifikke miljømæssige stimuli, såsom pH, temperatur, og tilstedeværelsen af reaktive oxygenspecies 23,24. Således bør forskerne nøje overveje, hvilke biomateriale er mest hensigtsmæssigt for deres studier.
Enhver forsker udnytte PLGA, eller andre biomaterialer, for at studere β-celle proliferation ex vivo bør være opmærksomme på potentielle forskelle mellem effekterne af indkapslet COI sammenlignet med ikke-indkapslet COI. For eksempel kunne leveringen af rhCTGF via PLGA ændre graden af og timingen af β-celleproliferation induktion sammenlignet med behandling med uindkapslet protein. Igangværende studier i vores laboratorium undersøger i øjeblikket disse potentielle forskelle.
Analysen af β-celleproliferation i dyrkede øer er en kraftfuld model for identifikation og migchanistic analyse af β-celle-mitogener. Anvendelse af assayet beskrevet her viser vi en relativt hurtig og omkostningseffektiv metode til indgivelse af et COI til isolerede dyrkede øer med en udvidet release køretøj. Denne analyse bør gælde for næsten enhver COI af interesse, og vores valg at fokusere på CTGF er udelukkende baseret på dens tidligere offentliggjorte evne til at stimulere β-celle proliferation in vivo og ex vivo 11. Derudover kan denne analyse validere effektiviteten og sikkerheden ved at anvende PLGA som en metode levering før videre til modeller, hvor holme er transplanteret i levende organismer. Samlet set den beskrevne protokol giver en ny måde at administrere forbindelser til dyrkede holme med en bredere betydning for at måle sikkerheden af PLGA til transplanterbare væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
