Summary
Vi beskriver en mikro metod för generering av en arteriovenös (AV) slinga som en modell för att analysera vaskularisering in vivo i en isolerad och väldefinierad miljö. Denna modell är inte bara användbar för undersökning av angiogenes, men också optimalt lämpad för ingenjörs axiellt vaskulariserade och transplanterbara vävnader.
Introduction
De flesta vävnader och organ i människokroppen är beroende av en funktionell blodkärl som försörjer näringsämnen, utväxlar gaser och avlägsnar avfallsprodukter. Fel i detta system som orsakas av lokala eller systemiska vaskulära problem kan leda till en mångfald av svåra sjukdomar. Dessutom i forskningsområden såsom vävnadsteknik eller regenerativ medicin, är en funktionell blodkärl nätverk inom artificiellt genererade vävnader eller transplanterade organ krävs för en lyckad klinisk tillämpning.
För årtionden forskare har undersökt de exakta mekanismer som är involverade i den växande kärl att få djupare insikt i patologiska situationer för att hitta nya terapeutiska ingrepp och ger bättre förebyggande av vaskulära sjukdomar. I det första steget, är grundläggande processer såsom cell-cell interaktioner eller effekten av molekyler på celler i kärlsystemet vanligtvis undersökts av in vitro 2D eller 3Dexperiment. Traditionella 2D modeller är lätta att utföra, är väl etablerade och har i hög grad bidragit till en bättre förståelse av dessa processer. För första gången 1980, Folkman et al. rapporterats in vitro angiogenes sådd av kapillära endotelceller på gelatinbelagda plattor 1. Detta gav omedelbart sätt att offentliggörandet av en mängd ytterligare 2D angiogenes experiment på endotelceller röret bildningsanalys 2, migration analys 3 och co-odling av olika celltyper 4, liksom andra. Dessa analyser används fortfarande idag och accepteras som standard in vitro-metoder.
Emellertid är detta experimentuppställning inte alltid är lämplig för studier av in vivo-cellens beteende eftersom de flesta celltyper kräver en 3D-miljö för att bilda relevanta fysiologiska vävnadsstrukturer 5. Det kunde visas att arkitekturen av 3D-matris är avgörande för kapillär morphogenesis 6 och att cell extracellulär matrix (ECM) växelverkan och 3D odlingsbetingelser reglerar viktiga faktorer som är involverade i tumörangiogenes 7. 3D Matrisen ger komplexa mekaniska ingångar, kan binda effektorceller proteiner och etablera vävnads skala lösta koncentrationsgradienter. Dessutom anses det nödvändigt för att efterlikna in vivo morfogenetiska och ombyggnad steg i komplexa vävnader 5. I dessa system kan studeras både angiogenes och vaskulogenes. Medan angiogenes beskriver groning av kapillärer från redan existerande blodkärl 8 hänvisar vaskulogenes till bildandet de novo av blodkärl genom endotelceller eller deras föregångare 9,10. Mognad av fartyg beskrivs i en process som kallas "arteriogenes" via rekrytering av glatta muskelceller 11. En typisk angiogen in vitro-modell är groning av endotelceller från befintliga monolagers seedade som ett monolager på gel ytor, på ytan av mikrosfärer inbäddade i en gel eller genom att bygga endotelceller sfäroider 12. I vaskulär modeller enkla endotelceller är infångade i en 3D-gel. De interagerar med intilliggande endotelceller att bilda vaskulära strukturer och nätverk de novo, vanligtvis i kombination med stödjande cellerna 12.
Men även komplexa 3D in vitro-modeller kan inte härma in vivo-inställningar helt och hållet med tanke på mångfalden av cell-cell och cell-ECM interaktioner 13. Substanser med hög in vitro aktivitet inte automatiskt visar samma effekter in vivo och vice versa 14. För en omfattande analys av vaskularisering processer det finns ett akut behov av att utveckla in vivo-modeller som bättre simulerar situationen i kroppen. Ett stort utbud av in vivo angiogenes analyser beskrivs i litteraturen, inklusivechick korioallantoismembranet analys (CAM), zebrafisk modellen, hornhinnans angiogenes analysen rygg luftsäcken modell, rygg skinfold kammaren, de subkutana tumörmodeller 14. Men dessa analyser ofta förknippas med begränsningar, till exempel snabba morfologiska förändringar, problem att skilja nya kapillärer från redan befintliga i CAM-analysen, eller det begränsade utrymmet i hornhinnans angiogenes analysen 15. Vidare är icke-däggdjurssystem används (t.ex.., Zebrafisk modell 16), vilket leder till problem i xenotransplantation 17. I den subkutana tumörmodellen, kan angiogenes endast härrör från själva tumören inte analyseras, eftersom den intilliggande vävnaden bidrar stort till vaskularisering processen. Dessutom kan den omgivande vävnaden har en avgörande roll i att forma tumörmikro 18.
Inte bara för att studera angiogenes eller vaskulogenes finns det en stark need om ett standardiserat och väl karakteriserad in vivo-modell, men också för att studera olika vaskularisering strategier i tissue engineering och regenerativ medicin. Idag är det möjligt att genereringen av komplexa artificiella organ eller vävnader både in vitro och in vivo. 3D bioprinting ger en on-demand tillverkningstekniken för att generera komplexa 3D funktionell levande vävnader 19. Vidare kan bioreaktorer användas för generering av vävnader 20 eller till och med den egna kroppen kan användas som bioreaktor 21. Men det främsta hindret för en framgångsrik tillämpning av artificiellt genererade vävnader är bristen på kärl inom de tekniska konstruktioner. Omedelbar anslutning till värdens kärlsystem efter transplantation är en viktig förutsättning för överlevnad, i synnerhet i fallet av storskaliga artificiella vävnader eller organ.
Olika in vitro eller in vivo prevaskularise strategier var devellats för att skapa en funktionell mikrovaskulaturen i konstruktioner före implantation 22. Implantation av en byggnadsställning med in vitro förformade manipulerade kapillärer på rygghuden hos möss ledde till snabb anastomos av mössen kärl inom en dag 23. I motsats härtill utvecklade en sfäroid samodling bestående av humana mesenkyma stamceller och humana navelvenendotelceller sammanfogade till ett tredimensionellt prevascular nätverk ytterligare efter implantation in vivo. Dock anastomos med värdkärl begränsad 24. Framför allt i dåligt vaskulariserade defekter, såsom nekrotiska eller bestrålade områden, denna så kallade yttre vaskularisering - inväxt av fartyg från omgivningen i ställningen - ofta misslyckas. Inneboende vaskularisering, å andra sidan, är baserad på en vaskulär axeln som en källa till nya kapillärer gro in i byggnadsställningen 25. Använda den axiella kärl strategiKan den manipulerade vävnaden transplanteras med kärl axel och ansluten till lokala fartyg till mottagaren platsen. Omedelbart efter transplantation är vävnaden tillräckligt stöd av syre och näringsämnen, vilket skapar förutsättningar för optimal integration.
På grund av den begränsade tillgången till modeller för att undersöka in vivo angiogenes och som ett erkännande av den växande betydelsen av att generera axiellt vaskulariserad vävnad, vi utvecklat mikro tillvägagångssätt Erol och Spira ytterligare för att generera en arteriovenös (AV) slinga i djurmodell 26. Användningen av en helt stängd implantation kammaren gör denna metod mycket väl lämpad för att studera blodkärlsbildning under "kontrollerad", väl karakteriserade in vivo betingelser (figur 1). Denna modell är inte bara användbar för undersökning av angiogenes men också optimalt lämpad för axiella vaskularisering av byggnadsställningar för vävnads Engineering ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care kommittén för Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU) och regeringen i mellersta Franken, Tyskland godkände samtliga försök. För experimenten, Lewis-hanråttor med en kroppsvikt av 300 - var 350 g användes.
1. Arteriovenösa Loop modell i råtta
- Implantation ordningen (Figur 2)
- För anestesi använda en speciell plastlåda som är ansluten via slangen till isofluran förångare och stängs med ett lock. Slå på matnings gas och flödesmätare mellan 0,8-1,5 l / min.
- Placera råttan i induktionsplastlåda och försegla toppen. Slå på isofluran förångare till 5%.
- Noggrant observera råtta vid induktion av anestesi. Efter 3-4 minuter, kommer råttan sövd.
- Bekräfta korrekt anestesi: förlust av rätande reflex, förlust av ögonlocksreflexer, tillbakadragande reflex, positiv hornhinnan reflex.
- Ta råttan ur kartongen och kontrollera dessvikt för beräkning av läkemedel. Applicera ögonsalva att förhindra torrhet under narkos.
- Administrera smärtstillande och antibiotika (t ex., 7,5 mg / kg enrofloxacin subkutant (se), 12,5 mg / kg tramadol och 100 mg / kg metamizol både intravenöst (iv)). Administrera viktanpassade kristalloider under drift (eg., 30 ml / kg sc).
- Placera råttan på rygg på en värmeplatta vid 37 ° C under anestesi med 1-2% isofluran inandning administreras via mask.
- Övervaka anestesi ordentligt och öka isofluran om anestesi nivån är för låg (förflyttning av råtta, som svar på smärta, käken ton, ingen förlust av reflexer (se 1.1.4.), Hjärtfrekvens ökar). Var noga med att inte överdosera isofluran (förlust av hornhinnan reflexer, hög hjärtfrekvens, minskad syremättnad). Använda en speciell pulsoximetri för smådjur för kontroll av syremättnad (95-100%) och hjärtfrekvens (250-450 / min) hos råttan. Under operatipå monitor temperaturen för råtta (36 - 40 ° C) och justera temperaturen på värmeplattan vid behov.
- Raka insidor bakbenen med en elektrisk rakapparat och desinfektera området med antiseptiska medel. Sprid bakbenen och fixera dem med tejp.
- Lägga råtta under ett operationsmikroskop och täcka råtta med steril drapering. Se till att hela operationen proceduren utförs under sterila betingelser.
- Öppna huden i mitten av det vänstra låret med en längsgående snitt från övre knä till ljumsken med användning av en skalpell (nr 10).
- Skär den subkutana vävnaden och fascia i lager av ca 3 cm i längd med hjälp av dissekera sax och microforceps tills lårbens vaskulära bunten exponeras från bäcken artär i ljumsken till förgreningen av lårbensartären i knäet.
- Separera fartyg och ta bort adventitia hjälp av adventitia sax och microforceps.
- Koagulera sidan brancher med hjälp av elektrisk koagulering. Täck drift fältet med en fuktig kompress.
- Öppna huden på höger sida som beskrivs för vänster sida, 1.1.11 - 1.1.14.
- För skörd den venösa transplantat, ligera den högra lårbensvenen genom elektrisk koagulering på den proximala och distala ändar på ett avstånd av 1 - 1,5 cm.
- Ta det venösa transplantat med microforceps och spola det venösa transplantat med en heparinlösning (50 IU / ml i 0,9% natriumkloridlösning) med en bevattnings kanylen och överför den till vänster lår. Täck drift fältet på höger sida med en fuktig kompress.
- Ligera lårbensvenen på vänster sida proximalt vid inguinal region med en mikrokärls klämma. Koagulera lårbensvenen distalt genom elektrisk koagulering, vid övre knä innan förgrening, på ett avstånd av ca 2 cm.
- För anastomos ansluta den proximala änden av det venösa transplantatet med den proximala änden av venen med end-to-end anastomos med en 11-0 suture. Använd ca 8 avbrutna suturer. Börja med att placera de två första suturer vid klockan 12 och klockan 6 positioner. Sedan satte i två till ytterligare 3 suturer mellan dessa punkter på framsidan och sedan lägga två till ytterligare 3 suturer i baksidan.
- Ligera lårbensartären på samma sätt som beskrivits för den femorala venen (1.1.18.). Kontrollera att sling fartyg som inte är tvinnade. Anastomos den distala änden av den venösa transplantatet med den proximala änden av artären, såsom beskrivits för lårbensvenen (steg 1.1.19.).
- Administrera 25 IU heparin intravenöst. Se igen säker sling fartyg som inte är tvinnade, ta bort klämmorna och kontrollera att läckage och öppenhet i slingan för ca 5 min.
- Dribble papaverin (t.ex. 4 mg / ml) på fartygen för att förhindra kärlkramp. Om det finns patency, expanderar slingan och kan observeras pulsen på artären.
- Prefill implantation kammaren med den första halvan (ca 500 l) i matrisen (t.ex. </ Em>, en hydrogel eller ett ben matris med eller utan celler). Bädda in slingan i implantation kammaren.
- Fylla implantation kammaren med den andra halvan av matrisen till en totalvolym av 1000 | j, l. Försegla kammaren med lock kammaren.
- Fixera implantation kammaren på låret med en icke-absorberbar 6-0 sutur. Fixera locket kammaren med en icke-absorberbar 6-0 sutur. Stoppa eventuell blödning med elektrisk koagulering.
- Stäng huden med absorberbara suturer 4-0. Täcka såret med aluminiumspray.
- Administrera antibiotika och smärtstillande medel (t.ex. 7,5 mg / kg enrofloxacin sc, tramadol 12,5 mg / kg per os (po) (genom dricksvatten) för 3 - 5 dagar och därefter beroende på beteendet hos råtta).
- Stänga förångaren och låt råttan att andas tillförselgasen tills den börjar att vakna.
- Placera råttan i en låda med termisk stöd och iaktta den försiktigt tills den är helt återhämtat sig.
- Inte lämna rat undeltog tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
- Inte tillbaka råttan till sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt.
- explantation ordningen
- Utför explantation efter en kort tid eller lång tid implantation (enligt studiens utformning, för exempel se referenser 27-32). Söva råttan enligt steg 1.1.1.-1.1.9.
- Öppna huden i buken med en skalpell (nr 10) och flytta tarmarna åt sidan med en kompress. Exponera bukaorta och vena cava caudalis använder bomullspinnar.
- Cannulate bukaorta (eg., 24 gauge plastkanyl) och skär hålvenen caudalis med dissekera sax.
- Spola bukaorta med 0,9% natriumkloridlösning innehållande 100 lU / ml heparin, tills den vätska som läcker är tydlig. BEGJUTA aorta med 30 ml perfusion lösning (t ex., Kontrastmedel eller Indien ik).
- Avliva råtta genom injektion av en dödlig dos av embutramid, mebezonium jodid, tetrakainhydroklorid injicerbar lösning (0,1-0,2 ml / kg) i djup anestesi.
- Ligera den abdominala aortan och vena cava caudalis med en icke-absorberbar 4-0 sutur.
- Stäng det öppna såret med 1 - 2 klämmor. Lagra råttan under 24 h vid 4 ° C (härdning av perfusionslösningen).
- Placera råttan på rygg. Sprid bakbenen och fixera dem med tejp.
- Öppna huden ovanför kammaren med en längsgående incision med en skalpell (nr 10).
- Avlägsna bindväv från kammaren och slingan pedicle med hjälp dissekera saxar och microforceps. Skära slingan pediculus på ett avstånd av 1 cm från kammaröppningen med dissekera sax och ta bort kammaren.
- Öppna locket på kammaren och försiktigt bort konstruktionen från kammaren med pincett och fixa det i 4% buffrad formalinlösning under 24 timmar vid rumstemperatur. Efteråt använda konstruktionen för 3D mikro datortomografi eller paraffininbäddade för histologisk analys 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tissue Engineering
För benvävnad tekniska ändamål, har ett antal olika bensubstitut implanteras i små djur rått AV loopmodellen 27,28,33,34. Vaskularisering kunde helt påvisas genom 3D mikro datortomografi (mikro-CT) (Figur 3A). Vaskularisering av en bearbetad bovin benvävnad (PBCB) matris var signifikant högre i slingan gruppen jämfört med gruppen utan vaskularisering. En ständigt växande och maturating blodkärlsnätverk utvecklats inom implantation kammaren över 8 veckor. Mellan 4 och 8 veckor, var kontinuerlig tillväxt av kärlvävnad mot mitten av konstruktionerna observeras, medan ingen ökning detekterades i icke-vaskulariserad grupp 33. Prevaskularisering av PBCB matrisen under 6 veckor i AV-loopmodellen ledde till överlägsna överlevnaden av de injicerade osteoblaster jämfört med kontroll osteoblaster. I motsats till kontrollgrupperna, var uttryck av ben-specifika gener detekteras i AV-slinggrupp med implanterade osteoblaster 28. Som en ytterligare matris, sintrades bioaktivt glas tillsammans med fibringel implanteras i AV-slingor av råttorna. Efter 3 veckor, har ett tätt nätverk av nybildade kärl utvecklats framgår av mikro-CT och histologi 27.
Implantation Kammaren ändrades för att påskynda ställnings vaskularisering. Genom att använda en perforerad titan kammare, var inneboende vaskularisering stöds av yttre fartyg från den omgivande vävnaden. På bara två veckor efter implantation av en β-trikalciumfosfat hydroxyapatit (β-TCP / HA) / fibrin matris, var 83% av de fartyg som är ansluten till AV-slinga med kontinuerlig ökning över tid och nådde 97% anslutning efter 8 veckor 34. Med implantation av 5 x 10 6 benmärgs härrör mesenkymala stamceller (MSC) och benmorfogenetiskt protein 2 (BMP-2), en signifikant ökning i benbildning jämfört med de BMP-2 eller MSC ensam grupper kunde induceras. Vid 6 och 12 veckor, fibrinmatrisen var helt nedbrutna och ersättas av ytterst vaskulariserad bindväv i samtliga grupper (figur 3B 6 vecka implantation). Det var en signifikant minskning i kärl nummer i BMP-2 / MSC grupp mellan 6 och 12 veckor och efter 12 veckor i de andra grupperna. Detta berodde förmodligen på mognad av det vaskulära nätverket eller den kompakta arrangemanget av benstrukturer som leder till en begränsad vaskulär nätverksbildning 32.
Förutom ben, kan andra vävnader såsom muskel eller lever också konstrueras i AV-loopmodellen.
För teknik axiellt vaskulariserade muskelvävnad, utfördes experiment med primära myoblaster i en AV-loop fibrinmatrisen genomförts. Efter en prevascularization tid av 2 veckor för 2, 4, och 8 veckor, var 1 x 10 6 myoblaster transplanteras in i AV-loop kammaren. Transplanterade myoblaster kan redetected även efter 8 veckor med karboxifluoresceindiacetat diacetat succinimidylester (CFDA) märkning. Cellerna hålls deras myogenic fenotyp inom fibrinmatrisen och uttryck av muskelspecifika markörer MEF-2 och desmin var positiv efter 4 veckor. Men myogena markörgen uttryck var negativ efter 8 veckor, vilket var förmodligen på grund av avsaknad av myogena stimuli och snabb absorption av fibrinmatrisen 35. Att öka myogenic stimulering tillsattes en ny modifiering av rått AV-slingan utvecklats med hjälp epigastrisk venen i stället för den vena saphena i syfte att uppnå en mer proximal positionering av isoleringskammaren. Därför ytterligare inkorporering av obturatorn motor nerven geometriskt underlättas. Genom att använda denna AV loop modifiering, som kallas EPI slingan, kan vi visa myogena differentiation av samimplanterad myoblaster och MSC 36.
För levervävnadsteknik 4 x 10 6 PKH-26 märkta fetala leverceller transplanterades i en fibrin matris i rått AV modell för 2 veckor slinga. I kontrollgruppen, var matriser utan en AV-slinga och cellfria matriser implanteras. Funktionella kapillärer uppstod från AV-loop fartyg och mycket vaskulariserad neo-vävnad observerades i kammaren efter 14 dagars implantation, vilket framgår av CD31 färgning och tusch märkning. Det var ingen skillnad mellan den cellfria och hepatocyt AV-loop-grupp. AV-loop vaskulariserade fibrinmatrisen tätt och livsdugliga fetala celler kunde detekteras efter explantation genom positiv PKH-26-färgning och levercellspecifik cytokeratin 18 (CK-18) immunhistologi huvudsakligen i närheten av den stora vaskulära axeln. mRNA-nivåer av CK-18 var förhöjda i AV loop cellgruppen. I motsats, ingen CK-18 expression kunde detekteras i konstruktioner utan en slinga eller celler 37.
angiogenesforskning
AV-slingan består av tre segment: venen, artärtransplantat och interpositional venös transplantat (IVG) segment (Figur 1). Tredimensionell utvärdering av det vaskulära systemet visat att nybildade kärl har sitt ursprung från både den venösa och arteriella partiet samt från den venösa interponate. Ett stort antal nybildade kärl observerades från IVG 33. Med in vivo MRA, svepelektronmikroskopi av korrosions avgjutningar och immun histologi, var uppkomsten av angiogenes i en fibrin matris observerades mellan dag 10 och 14. Framför allt det venösa och IVG segment gav upphov till många kapillärer och större fartyg. En gradvis minskning av luminal kaliber som ett tecken på arterialization av IVG på grund av ökningen i endovaskulär tryck och skjuvspänning was detekteras från dag 7 på 38. I ytterligare studier, kan det bekräftas att vaskulär groning sker främst på icke-arteriella transplantat 39.
Den exakta analysen av angiogenesprocesser och stimulering och hämning av blodkärlsbildning kan visualiseras i AV-loop implantation kammaren. Den tillväxtfaktorer vaskulär endotelial tillväxtfaktor A (VEGFA) och basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) inducerade en högre absolut och relativ vaskulär densitet och snabbare resorption av fibrinmatrisen jämfört med den tillväxtfaktorfria kontrollgruppen 31. Vidare tillsattes remodeling fenomen och mognad av det vaskulära nätverket inuti isoleringskammaren visualiseras under en implantation period av 8 veckor. I AV-loop kamrarna processer intercapillary sammankoppling och intussusceptive angiogenes så bra som möjligt lymfatiska tillväxt identifierades immunohistologically som parametrar för neovascular mognad 39. Genom att tillämpa PHD (prolyl hydroxylas domän) hämmare DMOG (dimethyloxallyl glycin) systemiskt hos råttor, kunde man visa att koncentrationen av hypoxi-inducerbara faktor alfa (HIF-α) korrelerar med den växande vaskularisering i AV-slingan och är en stimulans för fartyg utväxt 40.
Figur 1:. Scheme of en AV-loop i Rat Model AV-slingan består av tre segment: venen (V), arteriell (A) transplantat och interpositional venös transplantat (IVG) segment. AV-slinga kan bäddas in i en sluten implantation kammare (C) för induktion av inneboende kärlbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
GE = "1"> 
Figur 2: AV Loop operation i Rat (A):.. Lokalisering av den femorala bunt på den inre sidan av bakbenen hos råtta (B / C): Framställning av den femorala vaskulär bunt i den vänstra och högra ljumske råttan. Fartygen är separerade (D), den interpositional ventransplantatet skördas från höger sida (E) och anastomoseras med lårvenen (F) och lårbensartären på vänster sida i en AV-slinga (G, pil indikerar anastomoser). Kärlen sling överförs till implantation kammaren förfylld med en matris (H) och efter fullständig fyllning (I) locket är stängt (J). A = lårbensartären, V = lårvenen, N = femoralisblockad, IVG = interpositional venös transplantat. Skala bar 5 mm (DJ).tp_upload / 54.676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Visualisering av Vascularization i Rat AV Loop modell (A). Micro-CT efter perfusion med ett kontrastmedel (gul perfusion fartyg) (B). Hematoxylin-Eosin färgning av en β-TCP / HA bensubstitut med MSC implanteras i aV-loopmodellen råtta under 6 veckor. Fartygen AV loop är perfusion med tusch (svart färg). Skala bar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I över ett decennium, har vi framgångsrikt använt arteriovenösa (AV) slinga för vävnadstekniska syften och studera angiogenes in vivo i den lilla djurmodell. Vi kunde visa att denna mikro modellen är mycket väl lämpad för ingenjörs olika vävnader och att det också kan användas för angiogenes eller antiangiogenes studier.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Engineered vävnader eller organ kräver en fungerande blodkärl nätverk för att leverera näringsämnen och syre som de behöver för sin överlevnad och lyckad integration efter transplantation till skadestället 41. Ett antal olika prevaskularisering strategier har utvecklats under de senaste decennierna, som kan differentieras med hänsyn till in vitro kontra in vivo och yttre vs. inneboende metoder.
Ställningar kan vara fabricated med rörformade strukturer och ympades med vaskulära celler såsom endotelceller eller progenitorceller in vitro 42. Å andra sidan, för in vivo-prevaskularisering, är byggnadsställningar implanteras i en höggradigt vaskulariserad område såsom subkutan eller muskelvävnad 21. Efteråt kan dessa extrinsically vaskulariserade konstruktioner transplanteras in i skadestället. Emellertid är nackdelen med dessa tillvägagångssätt av bristen på mikrokirurgiska samband med mottagarens fartyg efter transplantation. I synnerhet i fallet av storskaliga konstruktioner, är av avgörande betydelse för omedelbar tillförsel av den manipulerade vävnaden 43 omedelbar anslutning till värdkärlsystemet. Det uppenbara och mest lovande lösningen på detta problem ligger i genereringen av en i sig vaskulariserad vävnad eller ett organ av en vaskulär axel, såsom AV-loopmodellen.
Förutom att använda AV-loop metod som beskrivits ovan, axiell vaskularisation kan alså framkallas genom att använda AV buntar i stället 44 eller endast ett kärl, såsom epigastrisk artär 45. Men i flera publikationer AV-loopmodellen visade sig vara överlägsen med avseende på graden av vaskularisering och mängden de novo vävnad bildas. Tanaka et al., Jämfört både metodologiska ansatser och observerades betydligt högre vävnadsbildning och en högre grad av utvecklings kapillärer i slingan jämfört med bunten gruppen 46. Dong et al. också genomfört en studie med AV-slingan eller AV bunt metoder för ben tissue engineering i en kaninmodell, som också visade signifikant högre kärltäthet i slingan jämfört med bunten gruppen 47. Vi kunde bekräfta dessa resultat samt visa i en tidigare studie som AV-loop modellen har en högre kapacitet för angiogenes 48.
Så vitt vi vet finns det ingen motsvarande modell för att analyseravaskularisering in vivo i en isolerad och väldefinierad miljö. Därför representerar AV loopmodellen ett kraftfullt verktyg för att utvärdera hur olika celltyper eller tillväxtfaktorer bidrar till fartyg nätverksbildning eller vaskularisering processer i olika vävnader utan störningar från omgivande strukturer, såsom invaderande celler eller tillväxtfaktorer.
Begränsningar av tekniken
Men det är en stor utmaning för den föreslagna modellen hög komplexitet operationen. För en behandling av defekter med hjälp av AV-loopmodellen kräver ett förfarande i två steg - prevaskularisering av byggnadsställningen och transplantation i det defekta stället. Detta innebär att patienten måste genomgå två operationer. Dessutom, mikro kompetens är en nödvändig förutsättning för framgångsrika anastomosering submillimeter fartyg 49. Därför AV bunt ibland anses vara mer användbar för klinisk tillämpning eftersom jagt erbjuder också lovande, även om mindre potential för angiogenes och vävnadsregenere jämfört med AV-slingan 46. Emellertid kan denna operation läras steg-för-steg även av icke-kirurger, med hjälp av små kaliber kisel rör för utbildningen i början och därefter fartyg från döda djur (t.ex. kycklinglår) innan du gör AV-loop operation i en levande djur. Däremot kan de praktiserade mikro kirurger utföra denna operation med endast en kort tid av träning.
Kritiska steg i protokollet
I allmänhet, på grund av den lilla kaliber av kärlen finns det en risk för trombbildning och tillslutning av de slingkärlen. Men i råttmodellen 80% -100% av slingorna i genomsnitt var patent med användning av endast kort tid heparin antikoagulation efter operationen 28,30,31,34,38,39.
Vidare, beroende på den höga komplexiteten hos operationen kommer det att ta ett par timmar (beroende på than expertis kirurgen). Det är viktigt att kontrollera korrekt bedövning av djur under hela operationen och att på lämpligt sätt tillhandahålla infusion för att upprätthålla en tillräcklig blodtryck. Under den postoperativa perioden är det av stor betydelse att kontrollera hälsan hos de djur flera gånger, för att administrera analgetika / antibiotika och kolla operationssåret. Eftersom i de flesta fall implantation av en isolerad kammare utförs är det möjligt att infektion i inre av kammaren sker utan att märka. Därför är det mycket viktigt att upprätthålla sterilitet under hela operationen och administration av antibiotika bör noggrant göras över en period av 3 - 5 dagar.
Ändringar i protokollet
Kammaren kan justeras individuellt för att storleken och formen av defekten. Vidare även membran kan användas för att innesluta den AV-slinga som utförs av Manasseri et al. 50. Dessutom byggnadsställningen, supplemented celler och tillväxtfaktorer kan väljas i enlighet med de olika vävnadstyper. Nyligen Miomas et al. Kombinerad genterapeutiska metoder framgångsrikt med AV-loopmodellen och kan ge upphov till förbättring av kärltillväxt genom transduktion med VEGF165 51. Nyligen vi justerade rått AV modell för muskelvävnad tekniska ändamål slinga. I stället för lårbens fartyg, var epigastrisk ven och ytlig artär användas, vilket möjlig implantation av obturatorn nerv i axiellt vaskulariserad ställningen för motorisk innervation ( "EPI loop model") 36. Förutom implantation av en motorisk nerv, den neurotization av benvävnad konstruerad konstruktioner med sensoriska nerver rapporteras vara fördelaktigt för förbättrad osteogenes och bättre reparation av bendefekter 52. AV-loop inducerar minimal givarstället sjuklighet och kan skapas på olika ställen av kroppen 52. Det skulle vara möjligt att använda ytliga kärl på andra platser ikroppen för generering av AV-slinga eller ens att använda andra djur såsom kanin eller musmodellen.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter Mastering denna teknik
Nyligen vår arbetsgrupp implanteras en väldefinierad mus embryonala endotel stamceller (EPC) linje (T17b) uttrycker guanylat-bindande protein-1 (GBP-1) - en markör och intracellulär inhibitor av endotelceller funktioner cell såsom proliferation, migration och invasion - i rått aV loopmodellen. Den antiangiogena kapacitet differentierade GBP-1-EPC kunde påvisas genom en betydande minskning av blodkärlstätheten i AV-loop konstruktioner. När det gäller klinisk tillämpning skulle proinflammatoriska antiangiogena GTPas GBP-1 öppnar nya vägar för antiangiogena terapier, t.ex.., För cancer eller andra sjukdomar 53. Baserat på denna studie, är det tänkbart att AV-loop modellen kan användas för att fastställa ett patologisktvaskularisering nätverk för vidare analys och eventuell modulering. Till exempel ger denna modell en optimal möjlighet att få en bättre förståelse av blodkärl i tumören, dess påverkande faktorer och exakt vilken roll de olika celler som är involverade i tumörkärl nätverksbildning såsom EPC, tumörceller och stamceller 54. In vivo-modeller cancer utförs ofta i genetiskt modifierade möss för att simulera processer och tillväxt egenskaperna hos olika typer mänsklig cancer och har visat sig vara utmärkt för läkemedelsutveckling och prekliniska studier 55. Vidare finns det xenograft-modeller för omplantering tumörer i experimentdjur såsom immunförsvagade möss 56. En mer kliniskt relaterad metod innebär transplantation från patientens tumör, känd som "personliga musmodeller" eller "patientgenererade tumörxenotransplantat modeller" 57. Dessa modeller är inte praktiskt för att studera inflytande av en enda cell källa eller tillväxtfaktor utan effekter från den omgivande vävnaden.
AV-loopmodellen gör det möjligt att använda vävnadsutvecklings metoder för att studera tumörbiologi. Detta definieras som "tumör engineering" av Ghajar et al. och innebär "byggandet av komplexa odlingsmodeller som rekapitulera aspekter av in vivo tumörmikro att studera dynamiken i tumörutveckling, progression och terapi på flera skalor" 58. En tumör miljö kan byggas inom den isolerade implantation kammaren, vilket möjliggör en noggrann analys av cell-cell interaktioner, angiogenes, modulering, förstärkning och hämning. Vidare kan AV loopmodellen vara till nytta för att utveckla eller validera behandlingar om avbrytande av neoangiogenes eller hämning av tumörtillväxt.
Med användning av detta tillvägagångssätt för att inducera vaskularisering, är det möjligt att engineer vävnader i en kliniskt relevant storlek. I ytterligare studier, kunde vi generera axiellt vaskulariserad benvävnad för transplantation med en betydande volym av ca 15 cm i en relativt kort tid av 12 veckor 59,60. För att omsätta dessa upptäckter till klinisk praxis, kommer en proof of principle studie med skenbenet defekt modell utföras inom en snar framtid innan för användning i människor. Som ett första steg kan vi framgångsrikt demonstrera in situ ben tissue engineering i en stor volym defekt i en klinisk situation med långsiktig stabilitet 61. Tillämpa den beskrivna AV loopmodellen gör det möjligt att åstadkomma en terapi anpassad till den enskilda patientens behov. Baserat på våra resultat idén om människokroppen fungerar som en levande bioreaktor har fortfarande mycket lovande för framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka följande institutioner för att stödja våra AV loop forskning: Staedtler Stiftung, Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Byrån för Genus och mångfald, Forschungsstiftung Medizin , Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), AO Foundation, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Hans Georg Geis Foundation, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Tyskland, och ministeriet för högre utbildning och vetenskaplig forskning, Irak. Vi vill tacka Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Köhn och Ilse Arnold-Herberth för deras utmärkta teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride | Berlin-Chemie AG | 34592508 | |
| 11-0 Ethilon / polyamide 6/6 | Ethicon | EH7438G | |
| 4-0 Vicryl / polygalactin 910 | Ethicon | V392H | |
| 6-0 Prolene / polypropylene | Ethicon | 8695H | |
| aluminium spray | Pharma Partner Vertriebs-GmbH | 1020 | |
| antiseptics | BODE Chemie GmbH | ||
| Catheter | B Braun Meslungen AG | 4251612-02 | |
| contrast agent | Flowtech | MV-122 | |
| embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution | Intervet International GmbH | ||
| encre de chine intense Indian ink | Lefranc & Bourgeois | ||
| Enrofloxacin | Bayer AG | ||
| eye ointment | Bayer AG | ||
| Formalin 4% | Carl Roth GmbH & Co. KG | P087.4 | |
| Heparin | Ratiopharm GmbH | ||
| isoflurane | Abbott Laboratories | 6055482 | |
| Lewis rat, male | Charles River Laboratories | ||
| Metamizol-Natrium | Ratiopharm GmbH | ||
| papaverine / Paveron N | Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH | ||
| tramadol / Tramal | Grünenthal GmbH |
References
- Folkman, J., Haudenschild, C. Angiogenesis in vitro. Nature. 288 (5791), 551-556 (1980).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312 (2014).
- Puddu, A., Sanguineti, R., Traverso, C. E., Viviani, G. L., Nicolo, M. Response to anti-VEGF-A treatment of endothelial cells in vitro. Exp Eye Res. 146, 128-136 (2016).
- Li, H., Daculsi, R., Bareille, R., Bourget, C., Amedee, J. uPA and MMP-2 were involved in self-assembled network formation in a two dimensional co-culture model of bone marrow stromal cells and endothelial cells. J Cell Biochem. 114 (3), 650-657 (2013).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Nehls, V., Herrmann, R. The configuration of fibrin clots determines capillary morphogenesis and endothelial cell migration. Microvasc Res. 51 (3), 347-364 (1996).
- Fischbach, C., et al. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Mac Gabhann, F. A systems biology view of blood vessel growth and remodelling. J Cell Mol Med. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tissue Eng Part B Rev. 15 (2), 159-169 (2009).
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro models of angiogenesis. World J Surg. 31 (4), 654-663 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Agostini, S., et al. Barley beta-glucan promotes MnSOD expression and enhances angiogenesis under oxidative microenvironment. J Cell Mol Med. 19 (1), 227-238 (2015).
- Zhang, B., Xuan, C., Ji, Y., Zhang, W., Wang, D. Zebrafish xenotransplantation as a tool for in vivo cancer study. Fam Cancer. 14 (3), 487-493 (2015).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol Ther. 22 (1), 18-27 (2014).
- Min, Z., Shichang, Z., Chen, X., Yufang, Z., Changqing, Z. 3D-printed dimethyloxallyl glycine delivery scaffolds to improve angiogenesis and osteogenesis. Biomater Sci. 3 (8), 1236-1244 (2015).
- Sundaram, S., et al. Tissue-engineered vascular grafts created from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 3 (12), 1535-1543 (2014).
- Hori, A., Agata, H., Takaoka, M., Tojo, A., Kagami, H. Effect of Cell Seeding Conditions on the Efficiency of In Vivo Bone Formation. Int J Oral Maxillofac Implants. 31 (1), 232-239 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. , (2015).
- Wong, H. K., et al. Novel method to improve vascularization of tissue engineered constructs with biodegradable fibers. Biofabrication. 8 (1), 015004 (2016).
- Rouwkema, J., de Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Eng. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
- Erol, O. O., Spira, M. New capillary bed formation with a surgically constructed arteriovenous fistula. Surg Forum. 30, 530-531 (1979).
- Arkudas, A., et al. Evaluation of angiogenesis of bioactive glass in the arteriovenous loop model. Tissue Eng Part C Methods. 19 (6), 479-486 (2013).
- Arkudas, A., et al. Axial prevascularization of porous matrices using an arteriovenous loop promotes survival and differentiation of transplanted autologous osteoblasts. Tissue Eng. 13 (7), 1549-1560 (2007).
- Arkudas, A., et al. Composition of fibrin glues significantly influences axial vascularization and degradation in isolation chamber model. Blood Coagul Fibrinolysis. 23 (5), 419-427 (2012).
- Arkudas, A., et al. Dose-finding study of fibrin gel-immobilized vascular endothelial growth factor 165 and basic fibroblast growth factor in the arteriovenous loop rat model. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2501-2511 (2009).
- Arkudas, A., et al. Fibrin gel-immobilized VEGF and bFGF efficiently stimulate angiogenesis in the AV loop model. Mol Med. 13 (9-10), 480-487 (2007).
- Buehrer, G., et al. Combination of BMP2 and MSCs significantly increases bone formation in the rat arterio-venous loop model. Tissue Eng Part A. 21 (1-2), 96-105 (2015).
- Kneser, U., et al. Engineering of vascularized transplantable bone tissues: induction of axial vascularization in an osteoconductive matrix using an arteriovenous loop. Tissue Eng. 12 (7), 1721-1731 (2006).
- Arkudas, A., et al. Combination of extrinsic and intrinsic pathways significantly accelerates axial vascularization of bioartificial tissues. Plast Reconstr Surg. 129 (1), 55e-65e (2012).
- Bach, A. D., et al. A new approach to tissue engineering of vascularized skeletal muscle. J Cell Mol Med. 10 (3), 716-726 (2006).
- Bitto, F. F., et al. Myogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a newly developed neurotised AV-loop model. Biomed Res Int. 2013, 935046 (2013).
- Fiegel, H. C., et al. Foetal hepatocyte transplantation in a vascularized AV-Loop transplantation model in the rat. J Cell Mol Med. 14 (1-2), 267-274 (2010).
- Polykandriotis, E., et al. The venous graft as an effector of early angiogenesis in a fibrin matrix. Microvasc Res. 75 (1), 25-33 (2008).
- Polykandriotis, E., et al. Regression and persistence: remodelling in a tissue engineered axial vascular assembly. J Cell Mol Med. 13 (10), 4166-4175 (2009).
- Yuan, Q., et al. PHDs inhibitor DMOG promotes the vascularization process in the AV loop by HIF-1a up-regulation and the preliminary discussion on its kinetics in rat. BMC Biotechnol. 14, 112 (2014).
- Dew, L., MacNeil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Kang, Y., Mochizuki, N., Khademhosseini, A., Fukuda, J., Yang, Y. Engineering a vascularized collagen-beta-tricalcium phosphate graft using an electrochemical approach. Acta Biomater. 11, 449-458 (2015).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Zimmerer, R., Jehn, P., Spalthoff, S., Kokemuller, H., Gellrich, N. C. Prefabrication of vascularized facial bones. Chirurg. 86 (3), 254-258 (2015).
- Dunda, S. E., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of a Novel, 3-Dimensional Cellulose Matrix Structure. Handchir Mikrochir Plast Chir. 47 (6), 378-383 (2015).
- Tanaka, Y., et al. Tissue engineering skin flaps: which vascular carrier, arteriovenous shunt loop or arteriovenous bundle, has more potential for angiogenesis and tissue generation? Plast Reconstr Surg. 112 (6), 1636-1644 (2003).
- Dong, Q. S., et al. Prefabrication of axial vascularized tissue engineering coral bone by an arteriovenous loop: a better model. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 32 (6), 1536-1541 (2012).
- Polykandriotis, E., et al. Prevascularisation strategies in tissue engineering. Handchir Mikrochir Plast Chir. 38 (4), 217-223 (2006).
- Mofikoya, B. O., Ugburo, A. O., Bankole, O. B. Does open guide suture technique improve the patency rate in submillimeter rat artery anastomosis? Handchir Mikrochir Plast Chir. 46 (2), 105-107 (2014).
- Manasseri, B., et al. Microsurgical arterovenous loops and biological templates: a novel in vivo chamber for tissue engineering. Microsurgery. 27 (7), 623-629 (2007).
- Moimas, S., et al. AAV vector encoding human VEGF165-transduced pectineus muscular flaps increase the formation of new tissue through induction of angiogenesis in an in vivo chamber for tissue engineering: A technique to enhance tissue and vessels in microsurgically engineered tissue. J Tissue Eng. 6, (2015).
- Fan, J., et al. Microsurgical techniques used to construct the vascularized and neurotized tissue engineered bone. Biomed Res Int. 2014, 281872 (2014).
- Bleiziffer, O., et al. Guanylate-binding protein 1 expression from embryonal endothelial progenitor cells reduces blood vessel density and cellular apoptosis in an axially vascularised tissue-engineered construct. BMC Biotechnol. 12, 94 (2012).
- Horch, R. E., et al. Cancer research by means of tissue engineering--is there a rationale? J Cell Mol Med. 17 (10), 1197-1206 (2013).
- Lee, H. Genetically engineered mouse models for drug development and preclinical trials. Biomol Ther (Seoul). 22 (4), 267-274 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research). Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
- Guiro, K., Arinzeh, T. L. Bioengineering Models for Breast Cancer Research. Breast Cancer (Auckl). 9 (Suppl 2), 57-70 (2015).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2153-2156 (2010).
- Boos, A. M., et al. Engineering axially vascularized bone in the sheep arteriovenous-loop model. J Tissue Eng Regen Med. 7 (8), 654-664 (2013).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Horch, R. E., Beier, J. P., Kneser, U., Arkudas, A. Successful human long-term application of in situ bone tissue engineering. J Cell Mol Med. 18 (7), 1478-1485 (2014).
