Summary
We beschrijven een microchirurgische benadering voor het genereren van een arterioveneuze (AV) -lus als model voor het analyseren van vascularisatie in vivo in een geïsoleerd en goed gekarakteriseerd omgeving. Dit model is niet alleen nuttig voor het onderzoek naar angiogenese, maar ook optimaal geschikt voor engineering axiaal gevasculariseerd en transplantable weefsels.
Introduction
De meeste weefsels en organen in het menselijk lichaam zijn afhankelijk van een functionele bloedvat netwerk levert voedingsstoffen, gassen en wisselt afvalstoffen af. Storing van dit systeem veroorzaakt door lokale of systemische vasculaire problemen kunnen leiden tot een groot aantal ernstige ziekten. Bovendien is in onderzoeksgebieden zoals tissue engineering en regeneratieve geneeskunde, een functioneel bloedvat netwerk binnen kunstmatig opgewekte weefsels of getransplanteerde organen is onontbeerlijk voor een succesvolle klinische toepassing.
Decennia onderzoekers hebben onderzoek de exacte mechanismen betrokken bij de groeiende vaatstelsel dieper inzicht in pathologische situaties krijgen om nieuwe therapeutische interventies vinden en een betere preventie van vasculaire aandoeningen. In de eerste stap worden basisprocessen zoals cel-cel interacties en het effect van moleculen op cellen van het vasculaire systeem gewoonlijk onderzocht door in vitro 2D of 3Dexperimenten. Traditionele 2D modellen zijn eenvoudig uit te voeren, zijn goed ingeburgerd en hebben sterk bijgedragen tot een beter begrip van deze processen. Voor het eerst in 1980, Folkman et al. gerapporteerd in vitro angiogenese zaaien van capillaire endotheelcellen op met gelatine beklede platen 1. Dit gaf onmiddellijk manier om publicatie van een groot aantal verdere 2D angiogenese experimenten op endotheliale cellen buisvorming assay 2, migratieanalyse 3 en de co-kweken van verschillende celtypen 4, evenals anderen. Deze testen worden vandaag nog steeds gebruikt en geaccepteerd als standaard in vitro methoden.
Echter, deze experimentele opzet is niet altijd geschikt voor de studie van de in vivo celgedrag omdat de meeste celtypen vereisen een 3D-omgeving relevante fysiologische weefselstructuren 5 vormen. Het kon worden aangetoond dat de architectuur van het 3D matrix bepalend voor capillaire morphogenesis 6 en die cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties en 3D kweekomstandigheden reguleren belangrijke factoren die betrokken zijn bij tumor angiogenese 7. De 3D-matrix biedt complexe mechanische inputs, kunnen effector eiwitten binden en vast weefsel schaal opgeloste stof concentratie gradiënten. Bovendien is het noodzakelijk geacht om na te bootsen in vivo morfogenetische en remodeling stappen in complexe weefsels 5. In deze systemen kunnen zowel angiogenese en vasculogenese bestudeerd. Hoewel angiogenese beschrijft de kiemen van capillairen uit reeds bestaande bloedvaten 8, vasculogenese betrekking op de de novo vorming van bloedvaten door de endotheliale cellen of hun progenitors 9,10. Rijping van schepen wordt beschreven in een proces genaamd 'arteriogenese' via rekrutering van gladde spiercellen 11. Een typische angiogene in vitro model de kiemen van endotheelcellen van bestaande monolaags geënt als een monolaag op gel oppervlakken op oppervlakte microbolletjes ingebed in een gel of door het bouwen van endotheelcellen sferoïden 12. In vasculaire endotheelcellen enkele modellen worden ingesloten in een 3D gel. Ze met aangrenzende endotheelcellen vasculaire structuren en netwerken de novo vormen, gewoonlijk in combinatie met ondersteunende cellen 12.
Zelfs complexe 3D in vitro modellen kunnen nabootsen in vivo instellingen volledig omdat er meerdere cel-cel en cel-ECM interacties 13. Stoffen met hoge in vitro activiteit niet automatisch hetzelfde effect in vivo en vice versa 14 tonen. Voor een uitgebreide analyse van vascularisatie processen is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling in vivo modellen die de situatie in het lichaam beter te simuleren. Een groot aantal in vivo angiogenese assays worden beschreven in de literatuur, waaronder dechick chorion membraan assay (CAM), de zebravis model, de cornea angiogenese assay, de dorsale luchtzak model, de dorsale huidplooi kamer, de onderhuidse tumor modellen 14. Echter, deze assays vaak geassocieerd met beperkingen, zoals snelle morfologische veranderingen, problemen bij het onderscheiden van nieuwe capillairen uit reeds bestaande in de CAM-bepaling, of de beperkte ruimte in het corneale angiogenese assay 15. Bovendien worden niet-zoogdierlijke systemen (bv., De zebravis model 16), hetgeen leidt tot problemen bij xenotransplantatie 17. In het subcutane tumormodel, kunnen angiogenese alleen afkomstig zijn van de tumor zelf niet worden geanalyseerd aangezien het aangrenzende weefsel mate bijdraagt tot de vascularisatie proces. Bovendien kan het omringende weefsel een beslissende rol bij de vorming van de tumor micro 18 hebben.
Niet alleen voor de studie van angiogenese of vasculogenese is er een sterke need voor een gestandaardiseerde en goed gekarakteriseerd in vivo model, maar ook voor het bestuderen van verschillende strategieën vascularisatie in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Vandaag de vorming van complexe kunstmatige organen of weefsels kan zowel in vitro als in vivo. 3D bioprinting biedt een on-demand fabricage techniek voor het genereren van complexe 3D-functionele levende weefsels 19. Bovendien kan bioreactoren worden gebruikt voor het genereren weefsels 20 of het lichaam kan worden gebruikt als bioreactor 21. De belangrijkste barrière voor succesvolle toepassing van kunstmatig opgewekte weefsels het ontbreken van vascularisatie in de gemanipuleerde constructen. Directe verbinding met vasculatuur van de gastheer na transplantatie is een belangrijke voorwaarde om te overleven, vooral bij grote kunstmatige weefsels of organen.
Verschillende in vitro en in vivo prevascularization strategieën waren ontwikkeld om een functionele microvasculatuur in constructies te vestigen voorafgaand aan implantatie 22. De implantatie van een steiger met in vitro gemanipuleerde voorgevormde haarvaten op de dorsale huid van muizen leidde tot snelle anastomose van de muizen vasculatuur binnen een dag 23. Daarentegen een sferoïde co-cultuur, bestaande uit menselijke mesenchymale stamcellen en humane navelstrengader endotheelcellen samengesteld tot een driedimensionaal netwerk prevascular verder ontwikkeld na in vivo implantatie. Echter, anastomose met de gastheer vasculatuur beperkt 24. Vooral in slecht gevasculariseerde gebreken, zoals necrotische of bestraalde gebieden, deze zogenaamde extrinsieke vascularisatie - de ingroei van vaten uit de omgeving in de scaffold - vaak niet. Intrinsieke vascularisatie, anderzijds, is gebaseerd op een vasculaire as als bron van nieuwe capillairen kiemen in de scaffold 25. Met de axiale vascularisatie benaderingDe gemanipuleerde weefsel kan worden getransplanteerd met vasculaire as en verbonden met lokale schepen op de receptorplaats. Onmiddellijk na de transplantatie, is het weefsel voldoende ondersteund door zuurstof en voedingsstoffen, die de juiste voorwaarden voor een optimale integratie creëert.
Vanwege de beperkte beschikbaarheid van modellen voor het onderzoek in vivo angiogenese en in de erkenning van het toenemende belang van het genereren van axiaal doorbloed weefsel, ontwikkelden we de microchirurgische benadering van Erol en Spira naar aanleiding van een arterioveneuze (AV) lus in het diermodel 26 te genereren. Het gebruik van een volledig gesloten implantatiekamer maakt deze methode zeer geschikt voor bloedvatvorming studeren onder "gecontroleerde", goed gekarakteriseerd in vivo omstandigheden (figuur 1). Dit model is niet alleen nuttig voor het onderzoek naar angiogenese maar ook optimaal geschikt voor axiale vascularisatie van scaffolds voor weefsel enginEering doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het Animal Care Comite van de Friedrich-Alexander Universiteit van Erlangen-Nürnberg (FAU) en de regering van het Midden-Franken, Duitsland, goedgekeurd alle experimenten. Voor de experimenten mannelijke Lewis ratten met een lichaamsgewicht van 300 - 350 g werden gebruikt.
1. De arterioveneuze Loop Model in het Rat
- Implantatieprocedure (figuur 2)
- Voor verdoving een speciale plastic doos die via buis is verbonden met de verdamper isofluraan en afgesloten door een deksel. Schakel de gasvoorziening en flow meter tussen 0,8-1,5 l / min.
- Plaats de rat in de inductie plastic doos en sluit de top. Schakel isofluraan vaporizer tot 5%.
- let op de rat zorgvuldig tijdens de inductie van de anesthesie. Na 3-4 minuten wordt de rat onder narcose.
- Bevestig de juiste verdoving: meer verlies van evenwicht, verlies van ooglidreflex, terugtrekking reflex, positieve cornea reflex.
- Haal de rat uit de doos en controleer degewicht voor de berekening van geneesmiddelen. Toepassen oogzalf tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
- Beheren pijnmedicatie en antibiotica (bv., 7,5 mg / kg enrofloxacine subcutaan (sc), 12,5 mg / kg en 100 mg tramadol / kg metamizool zowel intraveneus (iv)). Dien-gewicht aangepast kristalloïden tijdens de werking (bijv., 30 ml / kg sc).
- Plaats de rat op zijn rug op een verwarmingsplaat bij 37 ° C onder anesthesie met 1-2% isofluraan inhalatie toegediend via masker.
- Monitor verdoving naar behoren en verhogen isofluraan als anesthesie te laag is (beweging van de rat, reactie op pijn, kaak toon, geen verlies van reflexen (zie 1.1.4.), De hartslag verhogen van). Wees niet te isofluraan (verlies van het hoornvlies reflexen, hoge hartslag, daling van de zuurstofverzadiging) overdosis. Gebruik een speciale pulsoximetrie voor kleine dieren ter controle van de zuurstofverzadiging (95-100%) en hartslag (250-450 / min) van de rat. Tijdens de operatiop monitor temperatuur van de rat (36 - 40 ° C) en stel de temperatuur van de warmhoudplaat indien nodig.
- Scheer de binnenzijden van de achterpoten met een elektrisch scheerapparaat en ontsmetten het gebied met ontsmettingsmiddelen. Spreid de achterste ledematen en zet ze vast met plakband.
- Leg de rat onder een chirurgische microscoop en hebben betrekking op de rat met steriel draperen. Zorg ervoor dat de hele operatie procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
- Open de huid in het midden van de linker dij met een longitudinale incisie van de bovenste knie tot de lies met een scalpel (No. 10).
- Snijd het subcutane weefsel en fascia in lagen van ongeveer 3 cm in lengte met behulp ontleden schaar en microforceps tot de femorale vasculaire bundel wordt blootgesteld, het bekken slagader in de lies tot aan de splitsing van de dijbeenslagader in de knie.
- Scheid de schepen en verwijder de adventitia met behulp van adventitia schaar en microforceps.
- Stollen de kant bboerderijen die elektrische coagulatie. Bedek het veld operatie met een vochtig kompres.
- Open de huid aan de rechterkant, zoals beschreven voor de linkerkant, 1.1.11 - 1.1.14.
- Voor het oogsten van de veneuze graft, ligeren rechts femorale ader door elektrische coagulatie op de proximale en distale einden op een afstand van 1-1,5 cm.
- Verwijder de veneuze graft met microforceps en spoel de veneuze graft met een heparineoplossing (50 IU / ml in 0,9% natriumchlorideoplossing) door een irrigatiecanule en mogelijk in de linkerdij. Bedek het operatieveld aan de rechterkant met een vochtige kompres.
- Afbinden de lies aan de linkerkant proximaal aan de lies regio met een microvaatje klem. Coaguleren femorale ader distaal door elektrische coagulatie, bovenaan knie voor vertakking, op een afstand van ongeveer 2 cm.
- Voor anastomose sluit het proximale uiteinde van de veneuze graft aan het proximale uiteinde van de ader van end-to-end anastomose met 11-0 Suture. Gebruik ongeveer 8 onderbroken hechtingen. Begin met het plaatsen van de eerste twee hechtingen op de 12 uur en 6 uur posities. Zet dan 2 tot 3 hechtingen tussen deze punten aan de voorkant en vervolgens 2-3 meer hechtingen aan de achterkant.
- Ligeren de femorale slagader op dezelfde wijze beschreven voor de femorale ader (1.1.18.). Zorg ervoor dat de lus vaartuigen niet gedraaid. Anastomose het distale uiteinde van de veneuze graft aan het proximale uiteinde van de slagader zoals beschreven voor de femorale ader (stap 1.1.19.).
- Dien 25 IU heparine intraveneus. Zorg opnieuw ervoor dat de lus vaartuigen niet gedraaid, verwijder de klemmen en controleer op lekkage en doorgankelijkheid van de lus voor ongeveer 5 minuten.
- Dribbel papaverine (bijvoorbeeld 4 mg / ml) op de vaartuigen vasculaire spasmen. Als er doorgankelijkheid, de lus wordt groter en de pols van de slagader kan worden waargenomen.
- Prefill de implantatie kamer van de eerste helft (ongeveer 500 pl) van de matrix (bv </ Em>, een hydrogel of een botmatrix met of zonder cellen). Insluiten de lus in de implantatie kamer.
- Vul het implantatiekamer de tweede helft van de matrix tot een totaal volume van 1000 gl. Sluit de kamer met de kamer deksel.
- Bevestig de implantatiekamer op de dij van een niet absorbeerbare 6-0 hechtdraad. Bevestig de kamer deksel met een niet-absorbeerbare 6-0 hechtdraad. Stop mogelijk bloeden met elektrische coagulatie.
- Sluit de huid met absorbeerbare 4-0 hechtingen. Bedek de wond met aluminium spray.
- Dien antibiotica en analgetica (bijvoorbeeld 7,5 mg / kg sc enrofloxacine, tramadol 12,5 mg / kg per os (PO) (via drinkwater) gedurende 3-5 dagen en daarna afhankelijk van het gedrag van de rat).
- Schakel de verdamper uit en laat de rat te gasvoorziening ademen tot het begint te ontwaken.
- Plaats de rat in een doos met thermische ondersteuning en acht het voorzichtig tot ze volledig hersteld.
- Laat de rat unbijgewoond totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
- Laat de rat niet terug naar het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld.
- explantatie Procedure
- Voer de explantatie na korte tijd of lange tijd implantatie (volgens de studie ontwerp, voor voorbeelden zie referenties 27-32). Verdoven van de rat volgens stappen 1.1.1.-1.1.9.
- Open de huid van de buik met een scalpel (No. 10) en zet de darmen opzij met een kompres. Expose de abdominale aorta en de vena cava caudalis met behulp van wattenstaafjes.
- Canule de abdominale aorta (bijv., 24 meter plastic canule) en snijd de vena cava caudalis met het ontleden van een schaar.
- Spoel de abdominale aorta met 0,9% natriumchloride oplossing die 100 IU / ml heparine tot lekkende vloeistof helder. Perfuseren de aorta met 30 ml perfusie-oplossing (bv., Contrastmiddel of India ink).
- Euthanaseren de rat door injectie van een dodelijke dosis van embutramide, mebezonium jodide, tetracaïnehydrochloride injecteerbare oplossing (0,1-0,2 ml / kg) in diepe anesthesie.
- Ligeren van de abdominale aorta en vena cava caudalis met niet absorbeerbare 4-0 hechtdraad.
- Sluit de open wond met 1-2 klemmen. Bewaar de rat gedurende 24 uur bij 4 ° C (uitharding van de perfusievloeistof).
- Plaats de rat op zijn rug. Spreid de achterste ledematen en zet ze vast met plakband.
- Open de huid boven de kamer met een longitudinale incisie met een scalpel (No. 10).
- Verwijder het bindweefsel van de kamer en de loop pedikel behulp ontleden schaar en microforceps. Snijd de lus pedikel op een afstand van 1 cm van de kameropening met ontleden schaar en verwijder de kamer.
- Open het deksel van de kamer en voorzichtig het construct uit de kamer met een tang en oplossen in 4% gebufferde formaline oplossing 24 uur bij kamertemperatuurtemperatuur. Daarna gebruikt het construct voor 3D-micro CT of paraffine voor histologische analyse 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
tissue engineering
Voor botweefsel doeleinden verschillende botvervangers geïmplanteerd in het kleine dier rat AV lusmodel 27,28,33,34. Vascularisatie kan perfect worden aangetoond door 3D-micro computertomografie (micro-CT) (Figuur 3A). Vascularisatie van een verwerkt bovine poreus bot (PBCB) matrix was significant hoger in de lus vergeleken met de groep zonder vascularisatie. Een steeds groter en maturating bloedvat netwerk ontwikkeld binnen de implantatie kamer meer dan 8 weken. Tussen 4 en 8 weken continue groei van gevasculariseerd weefsel naar het midden van de constructen werd waargenomen, terwijl er geen toename van de niet-gevasculariseerd groep 33 gedetecteerd. Prevascularization van de PBCB matrix gedurende 6 weken in de AV lusmodel tot superieure overleving van de geïnjecteerde osteoblasten vergelijking met de controle osteoblasten. In tegenstelling tot de controle groepen, expressie van bot-specifieke genen gedetecteerd in de AV lus groep met geïmplanteerde osteoblasten 28. Als verdere matrix werd gesinterd bioactief glas samen met fibrine gel geïmplanteerd in de AV lussen van de ratten. Na 3 weken werd een dicht netwerk van nieuw gevormde vaten aangetoond door micro-CT en histologie 27 ontwikkeld.
De implantatie kamer werd gewijzigd om schavot vascularisatie te versnellen. Door het gebruik van een geperforeerde titanium kamer, werd intrinsieke vascularisatie ondersteund door extrinsieke schepen uit het omringende weefsel. Op slechts 2 weken na implantatie van een β-tricalciumfosfaat hydroxyapatiet (β-TCP / HA) / fibrinematrix, 83% van de vaten werden aangesloten op de AV lus met continue toename in de tijd en bereikte 97% verbinding na 8 weken 34. Met het implanteren van 5 x 10 6 beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC) en bot morfogenetisch eiwit 2 (BMP-2), een aanzienlijke toename van botvorming vergeleken met de BMP-2 of MSC alleen groepen kan worden geïnduceerd. Bij 6 en 12 weken, de fibrinematrix werd volledig afgebroken en vervangen door vaatrijke bindweefsel in alle groepen (Figuur 3B 6 weken implantatie). Er was een significante vermindering in aantal vat de BMP-2 / MSC groep tussen 6 en 12 weken en na 12 weken in de andere groepen. Dit werd waarschijnlijk veroorzaakt door rijping van het vasculaire netwerk of de compacte opstelling van botstructuren leidt tot een beperkte vasculaire netwerkvorming 32.
Daarnaast bot, kunnen andere weefsels zoals spieren of lever worden gemanipuleerd in de AV lusmodel.
Voor engineering axiaal gevasculariseerd spierweefsel experimenten met primaire myoblasten per AV lus fibrinematrix uitgevoerd. Na prevascularization van 2 weken 2, 4 en 8 weken werden 1 x 10 6 myoblasten getransplanteerd in de AV lus kamer. Getransplanteerde myoblasten kan zelfs na 8 weken worden geherdetecteerd behulp carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFDA) etikettering. De cellen hielden hun myogene fenotype in de fibrine matrix en expressie van het spier-specifieke markers MEF-2 en desmine positief was na 4 weken. Echter, myogene marker genexpressie negatief na 8 weken, waarschijnlijk vanwege de afwezigheid van myogene stimuli en snelle absorptie van de fibrine matrix 35. Om myogene stimulatie te verhogen, een nieuwe modificatie van de rat AV lus werd ontwikkeld met epigastrische ader in plaats van de saphena om een meer proximale positie van de isolatiekamer bereiken. Daarom werd extra opname van de afsluiter motorische zenuw geometrisch vergemakkelijkt. Door deze AV lus modificatie die wordt aangeduid als de EPI lus, zouden we myogene d tonenifferentiation van co-geïmplanteerde myoblasten en MSC 36.
Hepatotoxische weefselmanipulatie werden 4 x 10 6 PKH-26 gelabelde foetale levercellen getransplanteerd in een fibrinematrix in de rat AV lusmodel gedurende 2 weken. In de controlegroep, matrices zonder AV lus en celvrije matrices werden geïmplanteerd. Functionele haarvaten is ontstaan uit de AV loop schepen en vaatrijke neo-weefsel werd waargenomen in de kamer na 14 dagen van de implantatie, zoals blijkt uit CD31 kleuring en Oost-Indische inkt etikettering. Er was geen verschil tussen de cel-vrij en hepatocyte AV loop groep. De AV lus gevasculariseerd de fibrine matrix dicht en levensvatbare foetale cellen waargenomen na explantatie door positieve kleuring PKH-26 en lever- celspecifieke cytokeratine 18 (CK-18) immunohistologie vooral in de nabijheid van de belangrijkste vasculaire as. mRNA niveaus van CK-18 werden verhoogd in de AV-lus cel groep. Er is daarentegen geen CK-18 expression kan worden gedetecteerd in constructen zonder lus of cellen 37.
angiogenese Studies
De AV lus bestaat uit drie segmenten: de ader, de arteriële graft en de interpositioneel veneuze graft (IVG) segment (figuur 1). Driedimensionale evaluatie van het vasculaire systeem zien dat nieuw gevormde vaten afkomstig zowel de veneuze en arteriële portie alsmede van de veneuze interponate. Een groot aantal van de nieuw gevormde schepen werden waargenomen vanuit de IVG 33. Met in vivo MRA, scanning elektronenmicroscopie corrosie afgietsels en immuun histologie, werd het begin van angiogenese in een fibrinematrix waargenomen tussen dag 10 en 14. Vooral de veneuze en IVG segmenten aanleiding gaf tot capillairen en grotere schepen. Een geleidelijke vermindering van de lumen kaliber als een teken van arterialization van de IVG als gevolg van de toename van de endovasculaire druk en shear stress was gedetecteerd vanaf dag 7 op 38. In verdere studies, kon worden bevestigd dat vasculaire kiemen vindt voornamelijk plaats in de niet-arteriële graft 39.
De exacte analyse van angiogenese processen en het stimuleren en remming van bloedvatvorming kunnen worden gevisualiseerd in de AV-lus implantatie kamer. De groeifactoren vascular endothelial growth factor A (VEGFA) en basische fibroblast groeifactor (bFGF) induceerde een hogere absolute en relatieve vasculaire dichtheid en snellere resorptie van de fibrine matrix vergeleken met de groeifactor-vrije controlegroep 31. Verder remodeling verschijnselen en rijping van het vasculaire netwerk binnen de isolatiekamer gevisualiseerd via een implantatie periode van 8 weken. In AV werden immunohistologisch lus kamers processen van intercapillary interconnectie en intussusceptive angiogenese zo goed mogelijk lymfatische groei geïdentificeerd als parameters neovascular rijping 39. Door toepassing van de PHD (prolyl hydroxylase domein) remmer DMOG (dimethyloxallyl glycine) systemisch in ratten kon worden aangetoond dat de concentratie van de hypoxia-induceerbare factor alfa (HIF-α) correleert met de groeiende vascularisatie in de AV lus en een stimulans voor vaartuig uitgroei 40.
Figuur 1:. Schema van een AV-Loop in het Rat Model De AV lus bestaat uit drie segmenten: de ader (V), de arteriële (A) transplantaat en de interpositioneel veneuze graft (IVG) segment. De AV-lus kan worden ingebed in een gesloten implantatie kamer (C) voor de inductie van intrinsieke vascularisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ge = "1"> 
Figuur 2: AV lusbedrijf de Rat (A):.. Lokalisatie van de femorale bundel aan de binnenzijde van de achterpoten van de rat (B / C) Bereiding van de femorale vasculaire bundel in de linker en rechter lies van de Rat. De schepen zijn gescheiden (D), de interpositioneel ader graft wordt geoogst vanaf de rechterkant (E) en anastomose met de femorale ader (F) en femorale slagader van de linkerzijde in een AV-lus (G, pijl geeft de anastomosen). De lus vaten worden overgebracht in de implantatiekamer voorgevuld met een matrix (H) en na volledige vulling (I) het deksel wordt gesloten (J). A = dijbeenslagader, V = lies, N = femorale zenuw, IVG = interpositioneel veneuze graft. Schaal bar 5 mm (DJ).tp_upload / 54676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Visualisatie van vascularisatie in het Rat AV lusmodel (A). Micro-CT na perfusie met contraststoffen (geel geperfuseerde vaten) (B). Hematoxyline-eosine kleuring van een β-TCP / HA beenvervanger met MSC geïmplanteerd in de AV lusmodel rat gedurende 6 weken. De AV-lus schepen worden geperfuseerd met Oost-Indische inkt (zwarte kleur). Schaal bar 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Al meer dan tien jaar, hebben we met succes gebruik gemaakt van de arterioveneuze (AV) lus voor tissue engineering doeleinden en het bestuderen van angiogenese in vivo in de kleine diermodel. Wij konden aantonen dat dit microchirurgische model is zeer geschikt voor engineering van verschillende weefsels en het kan ook worden gebruikt voor angiogenese of anti-angiogenese studies.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
Gemanipuleerde weefsels of organen vereisen een functioneel netwerk bloedvat om de voedingsstoffen en zuurstof die ze nodig hebben voor hun overleving en succesvolle integratie na transplantatie in het defect ter plaatse 41 te leveren. Een aantal verschillende prevascularization strategieën zijn ontwikkeld in de afgelopen decennia, die kunnen worden gedifferentieerd in vitro vs. in vivo en extrinsieke vs. intrinsieke benaderingen.
Steigers kunnen fabricated met buisvormige structuren en bezaaid met vasculaire cellen zoals endotheliale cellen of voorlopercellen in vitro 42. Anderzijds, in vivo prevascularization, steigers worden geïmplanteerd in een sterk gevasculariseerde gebied, zoals subcutane of spierweefsel 21. Daarna kunnen deze extrinsiek gevasculariseerde constructen worden getransplanteerd in plaats van het defect. Echter, het nadeel van deze aanpak is het gebrek aan microchirurgische vaartuigen met de ontvanger na transplantatie. Vooral bij grootschalige constructies, onmiddellijke verbinding met de host vasculatuur essentieel voor onmiddellijke levering van het gemanipuleerde weefsel 43. De hand liggende en meest veelbelovende oplossing voor dit probleem ligt in de vorming van een intrinsiek gevasculariseerd weefsel of orgaan door een vasculaire as, zoals de AV lusmodel.
Naast het gebruik van de AV lus werkwijze zoals hierboven beschreven, axiaal vascularisatie kan alzo worden opgewekt met behulp van AV bundels plaats 44 of slechts één schip zoals de epigastrische slagader 45. In verscheidene publicaties de AV lusmodel bleek superieur wat betreft mate van vascularisatie en de hoeveelheid de novo weefselvorming te zijn. Tanaka et al. Vergeleken zowel methodologische benaderingen en vorming waargenomen significant hogere weefsel en een grotere capillairen ontwikkelen in de lus ten opzichte van de bundel 46 groep. Dong et al. Ook een studie uitgevoerd met behulp van de AV-loop of AV-bundel benaderingen voor botweefsel in een konijn model, die eveneens toonde significant hogere vasculaire dichtheid in de lus ten opzichte van de bundel groep 47. We waren in staat om deze resultaten, evenals tonen bevestigen een eerdere studie dat de AV-lus model heeft een hogere capaciteit voor angiogenese 48.
Voor zover wij weten, is er geen vergelijkbaar model voor het analyseren vanvascularisatie in vivo in een geïsoleerde en goed gekarakteriseerd omgeving. Daarom is de AV lusmodel vormt een krachtig instrument voor het evalueren hoe verschillende celtypen of groeifactoren dragen naar vat netwerkvorming of vascularisatie processen in verschillende weefsels zonder verstoring van omgevende structuren, zoals binnendringende cellen of groeifactoren.
Beperkingen van de Techniek
Echter, een belangrijke uitdaging van het voorgestelde model is de hoge complexiteit van de operatie. Ten eerste, de behandeling van defecten met de AV lusmodel vereist een tweestapsprocedure - prevascularization van de steiger en transplantatie in plaats van het defect. Dit betekent dat de patiënt twee operaties ondergaan. Bovendien microchirurgische vaardigheden zijn een noodzakelijke voorwaarde voor een succesvolle anastomose submillimeter vaartuigen 49. Daarom wordt de AV bundel soms beschouwd nuttiger voor klinische toepassing, omdat it biedt ook veelbelovend, hoewel minder, mogelijkheden voor angiogenese en generatie weefsel in vergelijking met de AV lus 46. Echter kan deze bewerking worden vervolgens stap voor stap, zelfs door niet-chirurgen met behulp klein kaliber siliconeslangen de training in het begin en vervolgens de vaten van dode dieren (bijvoorbeeld kippenpoten) voordat u de AV lus bedrijf in een levende dieren. Daarentegen kan meest uitgeoefende micro-chirurgen deze bewerking met slechts korte tijd na training.
Kritische stappen in het protocol
In het algemeen, vanwege het kleine kaliber van de vaten is er het risico van trombusvorming en sluiten van de lus vaartuigen. In het rattenmodel 80% -100% van de lussen werden gemiddeld octrooi met alleen kortdurende heparine anticoagulatie postoperatieve 28,30,31,34,38,39.
Verder komt door de hoge complexiteit van de operatie zal een paar uur (afhankelijk van thij expertise van de chirurg). Het is essentieel voor een goede verdoving van de dieren controleren gedurende de hele operatie en adequaat leveren infusie voor het handhaven van een adequate bloeddruk. Tijdens de postoperatieve periode is het van groot belang is voor de gezondheid van het dier meerdere malen controleren, te beheren analgetica / antibiotica en de operatiewond te controleren. Aangezien in de meeste gevallen implantatie van een geïsoleerde kamer wordt uitgevoerd, is het mogelijk dat infectie in het binnenste van de kamer optreedt ongemerkt. Daarom is het erg belangrijk om de steriliteit te handhaven tijdens de hele operatie en toediening van antibiotica moet zorgvuldig gebeuren over een periode van 3-5 dagen.
Wijzigingen van het protocol
De kamer kan individueel worden aangepast aan de grootte en vorm van het defect. Verder ook membranen kunnen worden gebruikt voor het insluiten van de AV lus uitgevoerd door Manasseri et al. 50. Bovendien, de steiger, Supplemented cellen en groeifactoren kunnen worden gekozen overeenkomstig de verschillende weefseltypen. Onlangs, Miomas et al. In combinatie gen therapeutische benaderingen met succes met de AV-lus model en mogelijk versterking van de groei vaartuig te induceren door transductie met VEGF165 51. Onlangs, aangepast we de rat AV lus model voor spier tissue engineering doeleinden. In plaats van de femorale vaten, de epigastrische ader en oppervlakkige slagader werden gebruikt, die de implantatie van de obturator zenuw ingeschakeld in de axiaal doorbloed steiger voor motorische innervatie ( "EPI lusmodel") 36. Naast de implantatie van een motorische zenuw, de neurotization van botweefsel gemanipuleerde constructen met gevoelszenuwen is gemeld gunstig voor een betere osteogenesis en beter herstel van botdefecten 52 te zijn. De AV lus induceert minimale donorplaats morbiditeit en kan worden gemaakt op verschillende plaatsen van het lichaam 52. Het zou mogelijk zijn om oppervlakkige vaten gebruiken bij andere plaatsen vanhet orgaan voor het genereren van de AV lus of andere dieren te gebruiken, zoals het konijn of het muismodel.
Toekomstige toepassingen of richtingen na beheersen van deze techniek
Onlangs heeft onze werkgroep geïmplanteerd een goed gekarakteriseerde muriene embryonale endotheliale progenitor cellen (EPC) lijn (T17b) die het guanylate bindend eiwit-1 (GBP-1) - een marker en intracellulaire remmer van endotheliale celfuncties zoals proliferatie, migratie en invasie - in de rat AV lus model. De anti-angiogene capaciteit van gedifferentieerde GBP-1-EPC kan worden aangetoond door een significante vermindering van de dichtheid van bloedvaten in de AV lusconstructies. Met betrekking tot de klinische toepassing, zou de pro-inflammatoire anti-angiogene GTPase GBP-1 opent nieuwe wegen van anti-angiogene therapieën, bv. Voor kanker of andere ziekten 53. Op basis van dit onderzoek, is het denkbaar dat de AV lusmodel kan worden gebruikt voor het vaststellen van een pathologischevascularisatie netwerk voor verdere analyse en modulatie mogelijk. Bijvoorbeeld, dit model een optimale mogelijkheid om een beter begrip van tumorangiogenese, mogelijke beïnvloedende factoren en de precieze rol van de verschillende cellen die betrokken zijn bij tumor vat netwerkvorming zoals EBV tumorcellen krijgen en stamcellen 54. In vivo kankermodellen worden vaak in genetisch gemodificeerde muizen om de processen en groeikenmerken van verschillende typen menselijke kanker simuleren uitgevoerd en hebben bewezen uitstekend geschikt voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en preklinische testen 55 zijn. Verder zijn er xenograft modellen verplanten tumoren in proefdieren zoals immuungecompromitteerde muizen 56. Een klinisch verwante benadering omvat de transplantatie van de tumor van de patiënt, bekend als "gepersonaliseerde muismodellen" of "patiënt afgeleide tumorxenotransplantaten modellen" 57. Echter, deze modellen zijn niet praktisch voor het bestuderen van de inflinvloed van een enkele cel bron of groeifactor zonder effecten van het omliggende weefsel.
De AV lusmodel maakt het mogelijk tissue engineering methoden om tumorbiologie bestuderen. Dit wordt gedefinieerd als "tumor techniek" door Ghajar et al. en omvat "het bouwen van complexe cultuur modellen die aspecten van de in vivo tumor micro herhalen om de dynamiek van tumorontwikkeling, progressie en therapie studie op meerdere schalen" 58. Een tumoromgeving kan worden geconstrueerd binnen de geïsoleerde implantatiekamer wordt een precieze analyse van cel-cel interacties, angiogenese, modulatie, verbetering en remming mogelijk maakt. Bovendien kan de AV lusmodel gunstig voor het ontwikkelen en valideren van therapieën met betrekking tot de onderbreking van neo- angiogenese of de remming van tumorgroei bewijzen.
Met deze aanpak voor het induceren van vascularisatie, is het mogelijk om engineer weefsels in een klinisch relevante maat. In verdere studies, konden we axiaal gevasculariseerd botweefsel voor transplantatie genereren met een aanzienlijke hoeveelheid van ongeveer 15 cc in een relatief korte tijd van 12 weken 59,60. Om deze bevindingen te vertalen klinische praktijk, wordt een proof of principle studie met de tibia defecten model worden uitgevoerd in de nabije toekomst vooraf voor toepassing in de mens. Om te beginnen, kunnen we met succes aantonen in situ botweefsel in een groot volume defect in een klinische scenario met langdurige stabiliteit 61. Aan het beschreven AV lusmodel maakt het mogelijk om een behandeling op maat van de individuele patiënt verschaffen. Op basis van onze resultaten het idee van het menselijk lichaam zelf die als een levende bioreactor heeft nog steeds een grote belofte voor de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag de volgende instellingen bedanken voor de ondersteuning van onze AV lus onderzoek: Staedtler Stiftung, Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Office voor Gender en Diversiteit, de Forschungsstiftung Medizin , Friedrich-Alexander Universiteit van Erlangen-Nürnberg (FAU), AO Foundation, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Hans Georg Geis Foundation, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Duitsland, en het Ministerie van Hoger Onderwijs en Wetenschappelijk Onderzoek, Irak. We willen graag Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Köhn en Ilse Arnold-Herberth bedanken voor hun uitstekende technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride | Berlin-Chemie AG | 34592508 | |
| 11-0 Ethilon / polyamide 6/6 | Ethicon | EH7438G | |
| 4-0 Vicryl / polygalactin 910 | Ethicon | V392H | |
| 6-0 Prolene / polypropylene | Ethicon | 8695H | |
| aluminium spray | Pharma Partner Vertriebs-GmbH | 1020 | |
| antiseptics | BODE Chemie GmbH | ||
| Catheter | B Braun Meslungen AG | 4251612-02 | |
| contrast agent | Flowtech | MV-122 | |
| embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution | Intervet International GmbH | ||
| encre de chine intense Indian ink | Lefranc & Bourgeois | ||
| Enrofloxacin | Bayer AG | ||
| eye ointment | Bayer AG | ||
| Formalin 4% | Carl Roth GmbH & Co. KG | P087.4 | |
| Heparin | Ratiopharm GmbH | ||
| isoflurane | Abbott Laboratories | 6055482 | |
| Lewis rat, male | Charles River Laboratories | ||
| Metamizol-Natrium | Ratiopharm GmbH | ||
| papaverine / Paveron N | Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH | ||
| tramadol / Tramal | Grünenthal GmbH |
References
- Folkman, J., Haudenschild, C.
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312 (2014).
- Puddu, A., Sanguineti, R., Traverso, C. E., Viviani, G. L., Nicolo, M. Response to anti-VEGF-A treatment of endothelial cells in vitro. Exp Eye Res. 146, 128-136 (2016).
- Li, H., Daculsi, R., Bareille, R., Bourget, C., Amedee, J. uPA and MMP-2 were involved in self-assembled network formation in a two dimensional co-culture model of bone marrow stromal cells and endothelial cells. J Cell Biochem. 114 (3), 650-657 (2013).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Nehls, V., Herrmann, R. The configuration of fibrin clots determines capillary morphogenesis and endothelial cell migration. Microvasc Res. 51 (3), 347-364 (1996).
- Fischbach, C., et al. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Mac Gabhann, F. A systems biology view of blood vessel growth and remodelling. J Cell Mol Med. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tissue Eng Part B Rev. 15 (2), 159-169 (2009).
- Risau, W.
- Carmeliet, P.
- Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Agostini, S., et al. Barley beta-glucan promotes MnSOD expression and enhances angiogenesis under oxidative microenvironment. J Cell Mol Med. 19 (1), 227-238 (2015).
- Zhang, B., Xuan, C., Ji, Y., Zhang, W., Wang, D. Zebrafish xenotransplantation as a tool for in vivo cancer study. Fam Cancer. 14 (3), 487-493 (2015).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol Ther. 22 (1), 18-27 (2014).
- Min, Z., Shichang, Z., Chen, X., Yufang, Z., Changqing, Z. 3D-printed dimethyloxallyl glycine delivery scaffolds to improve angiogenesis and osteogenesis. Biomater Sci. 3 (8), 1236-1244 (2015).
- Sundaram, S., et al. Tissue-engineered vascular grafts created from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 3 (12), 1535-1543 (2014).
- Hori, A., Agata, H., Takaoka, M., Tojo, A., Kagami, H. Effect of Cell Seeding Conditions on the Efficiency of In Vivo Bone Formation. Int J Oral Maxillofac Implants. 31 (1), 232-239 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. , (2015).
- Wong, H. K., et al. Novel method to improve vascularization of tissue engineered constructs with biodegradable fibers. Biofabrication. 8 (1), 015004 (2016).
- Rouwkema, J., de Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Eng. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M.
- Erol, O. O., Spira, M. New capillary bed formation with a surgically constructed arteriovenous fistula. Surg Forum. 30, 530-531 (1979).
- Arkudas, A., et al. Evaluation of angiogenesis of bioactive glass in the arteriovenous loop model. Tissue Eng Part C Methods. 19 (6), 479-486 (2013).
- Arkudas, A., et al. Axial prevascularization of porous matrices using an arteriovenous loop promotes survival and differentiation of transplanted autologous osteoblasts. Tissue Eng. 13 (7), 1549-1560 (2007).
- Arkudas, A., et al. Composition of fibrin glues significantly influences axial vascularization and degradation in isolation chamber model. Blood Coagul Fibrinolysis. 23 (5), 419-427 (2012).
- Arkudas, A., et al. Dose-finding study of fibrin gel-immobilized vascular endothelial growth factor 165 and basic fibroblast growth factor in the arteriovenous loop rat model. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2501-2511 (2009).
- Arkudas, A., et al. Fibrin gel-immobilized VEGF and bFGF efficiently stimulate angiogenesis in the AV loop model. Mol Med. 13 (9-10), 480-487 (2007).
- Buehrer, G., et al. Combination of BMP2 and MSCs significantly increases bone formation in the rat arterio-venous loop model. Tissue Eng Part A. 21 (1-2), 96-105 (2015).
- Kneser, U., et al. Engineering of vascularized transplantable bone tissues: induction of axial vascularization in an osteoconductive matrix using an arteriovenous loop. Tissue Eng. 12 (7), 1721-1731 (2006).
- Arkudas, A., et al. Combination of extrinsic and intrinsic pathways significantly accelerates axial vascularization of bioartificial tissues. Plast Reconstr Surg. 129 (1), 55e-65e (2012).
- Bach, A. D., et al. A new approach to tissue engineering of vascularized skeletal muscle. J Cell Mol Med. 10 (3), 716-726 (2006).
- Bitto, F. F., et al. Myogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a newly developed neurotised AV-loop model. Biomed Res Int. 2013, 935046 (2013).
- Fiegel, H. C., et al. Foetal hepatocyte transplantation in a vascularized AV-Loop transplantation model in the rat. J Cell Mol Med. 14 (1-2), 267-274 (2010).
- Polykandriotis, E., et al. The venous graft as an effector of early angiogenesis in a fibrin matrix. Microvasc Res. 75 (1), 25-33 (2008).
- Polykandriotis, E., et al. Regression and persistence: remodelling in a tissue engineered axial vascular assembly. J Cell Mol Med. 13 (10), 4166-4175 (2009).
- Yuan, Q., et al. PHDs inhibitor DMOG promotes the vascularization process in the AV loop by HIF-1a up-regulation and the preliminary discussion on its kinetics in rat. BMC Biotechnol. 14, 112 (2014).
- Dew, L., MacNeil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Kang, Y., Mochizuki, N., Khademhosseini, A., Fukuda, J., Yang, Y. Engineering a vascularized collagen-beta-tricalcium phosphate graft using an electrochemical approach. Acta Biomater. 11, 449-458 (2015).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Zimmerer, R., Jehn, P., Spalthoff, S., Kokemuller, H., Gellrich, N. C.
- Dunda, S. E., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of a Novel, 3-Dimensional Cellulose Matrix Structure. Handchir Mikrochir Plast Chir. 47 (6), 378-383 (2015).
- Tanaka, Y., et al. Tissue engineering skin flaps: which vascular carrier, arteriovenous shunt loop or arteriovenous bundle, has more potential for angiogenesis and tissue generation? Plast Reconstr Surg. 112 (6), 1636-1644 (2003).
- Dong, Q. S., et al. Prefabrication of axial vascularized tissue engineering coral bone by an arteriovenous loop: a better model. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 32 (6), 1536-1541 (2012).
- Polykandriotis, E., et al.
- Mofikoya, B. O., Ugburo, A. O., Bankole, O. B. Does open guide suture technique improve the patency rate in submillimeter rat artery anastomosis? Handchir Mikrochir Plast Chir. 46 (2), 105-107 (2014).
- Manasseri, B., et al. Microsurgical arterovenous loops and biological templates: a novel in vivo chamber for tissue engineering. Microsurgery. 27 (7), 623-629 (2007).
- Moimas, S., et al. AAV vector encoding human VEGF165-transduced pectineus muscular flaps increase the formation of new tissue through induction of angiogenesis in an in vivo chamber for tissue engineering: A technique to enhance tissue and vessels in microsurgically engineered tissue. J Tissue Eng. 6, (2015).
- Fan, J., et al. Microsurgical techniques used to construct the vascularized and neurotized tissue engineered bone. Biomed Res Int. 2014, 281872 (2014).
- Bleiziffer, O., et al. Guanylate-binding protein 1 expression from embryonal endothelial progenitor cells reduces blood vessel density and cellular apoptosis in an axially vascularised tissue-engineered construct. BMC Biotechnol. 12, 94 (2012).
- Horch, R. E., et al. Cancer research by means of tissue engineering--is there a rationale? J Cell Mol Med. 17 (10), 1197-1206 (2013).
- Lee, H. Genetically engineered mouse models for drug development and preclinical trials. Biomol Ther (Seoul). 22 (4), 267-274 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research). Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
- Guiro, K., Arinzeh, T. L. Bioengineering Models for Breast Cancer Research. Breast Cancer (Auckl). 9 (Suppl 2), 57-70 (2015).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2153-2156 (2010).
- Boos, A. M., et al. Engineering axially vascularized bone in the sheep arteriovenous-loop model. J Tissue Eng Regen Med. 7 (8), 654-664 (2013).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Horch, R. E., Beier, J. P., Kneser, U., Arkudas, A. Successful human long-term application of in situ bone tissue engineering. J Cell Mol Med. 18 (7), 1478-1485 (2014).
