Summary
Vi beskriver et mikrokirurgisk fremgangsmåde til frembringelse af en arteriovenøs (AV) loop som en model for analyse af vaskularisering in vivo i en isoleret og velkarakteriseret miljø. Denne model er ikke kun nyttig til undersøgelse af angiogenese, men er også optimalt egnet til ingeniør aksialt vaskulariseret og transplanterbare væv.
Introduction
De fleste væv og organer i det menneskelige legeme er afhængige af en funktionel blodkar, som forsyner næringsstoffer, udveksler gasser og fjerner affaldsprodukter. Funktionsfejl i systemet forårsaget af lokale eller systemiske vaskulære problemer kan føre til en lang række alvorlige sygdomme. Desuden er der i forskningsområder som vævsmanipulation eller regenerativ medicin, et funktionelt blodkar netværk inden kunstigt genererede væv eller transplanterede organer er uundværlig for en vellykket klinisk anvendelse.
I årtier forskere har undersøgt de nøjagtige mekanismer involveret i den voksende kar for at få dybere indsigt i patologiske situationer for at finde nye terapeutiske indgreb og give bedre forebyggelse af vaskulære lidelser. I det første trin, er grundlæggende processer såsom celle-celle interaktioner eller virkningen af molekyler på celler af den vaskulære system sædvanligvis undersøgt ved in vitro 2D eller 3Deksperimenter. Traditionelle 2D modeller er let at udføre, er veletablerede og har i høj grad bidraget til en bedre forståelse af disse processer. For første gang i 1980, Folkman et al. rapporterede in vitro angiogenese podning af endotelceller på gelatineovertrukne pladerne 1. Dette gav straks måde at offentliggørelsen af en lang række yderligere 2D angiogenese eksperimenter på endotelcelle kanaldannelse assay 2, migration assay 3 og den co-dyrkning af forskellige celletyper 4, såvel som andre. Disse analyser er stadig bruges i dag, og accepteret som standard in vitro-metoder.
Men denne forsøgsopstilling ikke altid er hensigtsmæssigt for studiet af in vivo-celle adfærd, da de fleste celletyper kræver et 3D-miljø til dannelse relevante fysiologiske vævsstrukturer 5. Det kunne påvises, at arkitekturen i 3D matrix er afgørende for kapillær morphogenesis 6 og at celle-ekstracellulær matrix (ECM) interaktioner og 3D dyrkningsbetingelser regulerer vigtige faktorer involveret i tumor angiogenese 7. 3D Matricen indeholder komplekse mekaniske indgange, kan binde effektor proteiner og etablere væv omfattende opløst stof koncentrationsgradienter. Desuden anses det for nødvendigt for at efterligne in vivo morfogenetiske og remodeling skridt i komplekse væv 5. I disse systemer kan både angiogenese og vaskulogenese undersøges. Mens angiogenese beskriver spiring af kapillærer fra forudeksisterende blodkar 8, vaskulogenese refererer til de novo dannelsen af blodkar gennem endotelceller eller deres stamceller 9,10. Modning af skibe er beskrevet i en proces, der kaldes "arteriogenese" via rekruttering af glatte muskelceller 11. En typisk angiogen in vitro model er den spiring af endotelceller fra eksisterende monolags podet som et monolag på gel overflader, på overfladen af mikrosfærer indlejret i en gel eller ved at bygge endotheliale celle sfæroider 12. I vaskulogene modeller enkelt endotelceller indesluttet i en 3D gel. De interagerer med tilstødende endotelceller til dannelse vaskulære strukturer og netværk de novo, typisk i kombination med støttende celler 12.
Men selv komplekse 3D in vitro-modeller kan ikke efterligne in vivo indstillinger helt givet de mange celle-celle og celle-ECM interaktioner 13. Stoffer med høj in vitro aktivitet ikke automatisk viser de samme virkninger in vivo og omvendt 14. For en omfattende analyse af vaskularisering processer der er et presserende behov for at udvikle in vivo modeller, der bedre simulerer situationen i kroppen. Et stort udvalg af in vivo-angiogenese assays er beskrevet i litteraturen, herunderkyllingechorioallantoinmembranen assay (CAM), zebrafisk model, den corneale angiogenese assay den dorsale luftsækken model, den dorsale skinfold kammer, de subkutane tumormodeller 14. Men disse analyser ofte forbundet med begrænsninger, såsom hurtige morfologiske ændringer, problemer med at skelne nye kapillærer fra allerede eksisterende i CAM assay, eller den begrænsede plads i hornhindens angiogenese assay 15. Endvidere ikke-mammale systemer anvendes (f.eks., Zebrafisk model 16), hvilket fører til problemer i xenotransplantation 17. I den subkutane tumor model kan angiogenese udelukkende kommer fra selve tumoren ikke analyseres eftersom det tilstødende væv i høj grad bidrager til vaskularisering processen. Desuden kan det omgivende væv har en afgørende rolle i udformningen af tumor mikromiljø 18.
Ikke kun for at studere angiogenese eller vaskulogenese er der en stærk need om et standardiseret og godt karakteriseret in vivo model, men også for at studere forskellige vaskularisering strategier i tissue engineering og regenerativ medicin. Dag, frembringelsen af komplekse kunstige organer eller væv er muligt både in vitro og in vivo. 3D bioprinting giver en on-demand fabrikation teknik til at generere komplekse 3D funktionelle levende væv 19. Endvidere kan bioreaktorer skal bruges til generering væv 20 eller endog egen krop, kan anvendes som bioreaktor 21. Men den væsentligste barriere for vellykket anvendelse af kunstigt genererede væv er manglen på vaskularisering inden de konstruerede konstruktioner. Umiddelbar forbindelse til værten vaskulatur efter transplantation er en væsentlig forudsætning for overlevelse, især i tilfælde af store kunstige væv eller organer.
Forskellige in vitro eller in vivo prevascularization strategier var develviklet til at etablere en funktionel mikrovaskulatur i konstruktioner inden implantation 22. Implantation af et stillads med in vitro foruddannede manipulerede kapillærer på den dorsale hud af mus førte til en hurtig anastomose af musene vaskulaturen inden for en dag 23. I modsætning hertil en sfæroid co-kultur bestående af humane mesenchymale stamceller og humane navleveneendotelceller samlet i et tredimensionalt prevascular netværk videreudviklet efter in vivo implantation. Imidlertid anastomose med værten vaskulatur var begrænset 24. Frem for alt i dårligt vaskulariserede defekter, såsom nekrotiske eller bestrålede områder, denne såkaldte ydre vaskularisering - indvækst af skibe fra det omkringliggende område i stilladset - ofte mislykkes. Intrinsic vaskularisering, på den anden side, er baseret på en vaskulær akse som en kilde til nye kapillærer spiring i stilladset 25. Brug af aksiale vaskularisering tilgangKan den konstruerede væv transplanteres med sine vaskulære akse og forbundet med lokale fartøjer på recipientstedet. Umiddelbart efter transplantation, er vævet tilstrækkeligt understøttet af ilt og næringsstoffer, som skaber de rette betingelser for en optimal integration.
På grund af den begrænsede tilgængelighed af modeller til at undersøge in vivo angiogenese og i erkendelse af den voksende betydning af at generere aksialt vaskulariseret væv, vi udviklet mikrokirurgisk tilgang Erol og Spira yderligere til at generere en arteriovenøs (AV) loop i dyremodel 26. Anvendelsen af et fuldstændigt lukket implantation kammer gør denne fremgangsmåde meget velegnet til at studere dannelsen af blodkar under "kontrolleret", velkarakteriseret in vivo betingelser (figur 1). Denne model er ikke kun nyttig til undersøgelse af angiogenese, men er også optimalt egnet til den aksiale vaskularisering af stilladser til væv engineering formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
The Animal Care udvalg af Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU) og regeringen for Mittelfranken, Tyskland, godkendt alle forsøgene. For forsøgene, Lewis-hanrotter med en kropsvægt på 300 - blev 350 g anvendes.
1. arteriovenøse Loop model i Rat
- Implantation Procedure (figur 2)
- Til anæstesi bruge en speciel plastic boks, der er forbundet via rør til isofluran fordamper og lukkes med et låg. Tænd gasforsyningen og flowmåler mellem 0,8 - 1,5 l / min.
- Placer rotte i induktion plastboks og forsegle toppen. Slå isofluran fordamper til 5%.
- observere omhyggeligt rotten under induktion af anæstesi. Efter 3 - 4 minutter, vil rotten blive bedøvet.
- Bekræft ordentlig anæstesi: tab af stabilitetsrefleks, tab af øjenlågsreflekser, tilbagetrækning refleks, positiv hornhinde refleks.
- Fjern rotten ud af kassen og kontrollere densvægt til beregning af narkotika. Påfør øjensalve at forhindre tørhed mens under anæstesi.
- Administrere smertestillende medicin og antibiotika (f.eks., 7,5 mg / kg enrofloxacin subkutant (sc), 12,5 mg / kg tramadol og 100 mg / kg metamizol både intravenøst (iv)). Administrer vægt-tilpassede krystalloider under drift (f.eks., 30 ml / kg sc).
- Placer rotte på ryggen på en varmeplade ved 37 ° C under anæstesi til 1 - 2% isofluran inhalation administreret via masken.
- Overvåg anæstesi ordentligt og øge isofluran hvis anæstesi er for lavt (bevægelse af rotten, reaktion på smerte, kæbe tone, ingen tab af reflekser (se 1.1.4.), Hjertefrekvens stigende). Pas på ikke at overdosere isofluran (tab af hornhinden reflekser, høj puls, fald i iltmætning). Bruge en speciel pulsoximetri til små dyr til kontrol af iltmætningen (95 - 100%) og hjertefrekvens (250 - 450 / min) af rotte. I løbet af operatipå monitor temperatur af rotte (36 - 40 ° C) og juster temperaturen af varmepladen om nødvendigt.
- Barber indersider bagbenene med en elektrisk barbermaskine og desinficere området med antiseptiske. Spred bagbenene og løse dem med tape.
- Lægge rotten under et kirurgisk mikroskop og dække rotten med sterilt drapering. Sørg for, at hele operationen procedure udføres under sterile forhold.
- Åbn huden i midten af den venstre lår med en langsgående indsnit fra den øvre knæ til lysken hjælp af en skalpel (No. 10).
- Skær det subkutane væv og fascia i lag på ca. 3 cm lange ved hjælp dissekere saks og microforceps indtil den femorale vaskulære bundt er udsat fra bækken arterie i lysken til tvedeling af den femorale arterie i knæet.
- Adskil fartøjer og fjern adventitia hjælp adventitia saks og microforceps.
- Koagulere side Branches ved elektrisk koagulation. Dæk operation felt med en fugtig komprimere.
- Åbn huden på højre side som beskrevet for den venstre side, 1.1.11 - 1.1.14.
- Til høst af den venøse graft, ligere den højre femorale vene ved elektrisk koagulation på den proksimale og distale ender i en afstand på 1 - 1,5 cm.
- Fjern det venøse graft med microforceps og skyl den venøse graft med en heparinopløsning (50 IU / ml i 0,9% natriumchloridopløsning) ved hjælp af en vanding kanyle og overføre den til venstre lår. Dæk operation feltet i højre side med en fugtig komprimere.
- Ligere den femorale vene i venstre side proximalt på inguinale region med en mikrokar klemme. Koagulere den femorale vene distalt ved elektrisk koagulation, ved den øvre knæ før forgrening, i en afstand på ca. 2 cm.
- For anastomose forbinde den proximale ende af den venøse graft med den proximale ende af venen ved ende-til-ende anastomose med en 11-0 suture. Brug omkring 8 afbrudt suturer. Begynd med at placere de to første suturer klokken 12 og klokken 6 positioner. Derefter sættes i 2 til 3 flere suturer mellem disse punkter på forsiden og derefter sætte 2 til 3 flere suturer i bagsiden.
- Ligere lårarterien på samme måde beskrevet for den femorale vene (1.1.18.). Sørg for, at loop skibe er ikke snoet. Anastomose den distale ende af den venøse graft med den proximale ende af arterien som beskrevet for den femorale vene (trin 1.1.19.).
- Administrer 25 IU heparin intravenøst. Sørg igen sikker loop skibe er ikke snoet, Fjern klemmerne og tjekke for lækage og åbenheden af sløjfen i omkring 5 min.
- Drible papaverin (f.eks 4 mg / ml) på skibene for at forhindre vaskulære spasmer. Hvis der er åbenhed, sløjfen ekspanderer og kan iagttages pulsen af arterien.
- Udfyld forud implantation kammer med den første halvdel (ca. 500 pi) af matricen (f.eks </ Em>, en hydrogel eller en knoglematrix med eller uden celler). Indlejre løkken ind i implantation kammeret.
- Fyld implantation kammer med den anden halvdel af matricen til et samlet volumen på 1.000 pi. Forsegle kammeret med kammeret låg.
- Fastgør implantation kammer på låret med en ikke-absorberbar 6-0 sutur. Fastgør kammeret låg med en ikke-absorberbar 6-0 sutur. Stop mulig blødning med el koagulation.
- Luk huden med absorberbare suturer 4-0. Dæk såret med aluminium spray.
- Administrere antibiotika og analgetika (f.eks, 7,5 mg / kg enrofloxacin sc, tramadol 12,5 mg / kg per os (po) (via drikkevandet) i 3 - 5 dage og derefter afhængigt af adfærden hos rotter).
- Drej vaporizer fra og lade rotten at ånde gasforsyningen, indtil det begynder at vågne.
- Placer rotte i en kasse med termisk støtte og observere det forsigtigt, indtil fuldt tilbagebetalt.
- Du må ikke forlade rotte undeltog indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Må ikke returnere rotte til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
- eksplantation Procedure
- Udfør explantation efter en kort tid eller lang tid implantation (ifølge undersøgelsen design, for eksempler se Referencer 27-32). Bedøver rotten ifølge trin 1.1.1.-1.1.9.
- Åbn maveskindet med en skalpel (No. 10) og flytte tarmene til side med en kompres. Expose den abdominale aorta og vena cava caudalis bruger vatpinde.
- Kanyle den abdominale aorta (f.eks., 24 gauge plastkanyle) og sender en vena cava caudalis med dissekere saks.
- Skyl abdominale aorta med 0,9% natriumchloridopløsning indeholdende 100 IU / ml heparin, indtil den lækkende væske er klar. Perfundere aorta med 30 ml perfusion opløsning (f.eks., Kontrastmiddel eller Indien ik).
- Aflive rotten ved injektion af en dødelig dosis af embutramid, mebezonium iodid, tetracainhydrochlorid injicerbar opløsning (0,1 - 0,2 ml / kg) i dyb anæstesi.
- Ligere den abdominale aorta og vena cava caudalis med en ikke-absorberbar sutur 4-0.
- Luk det åbne sår med 1 - 2 klemmer. Opbevar rotten i 24 timer ved 4 ° C (hærdning af perfusion opløsning).
- Placer rotte på ryggen. Spred bagbenene og løse dem med tape.
- Åbn huden over kammeret med en langsgående incision med en skalpel (No. 10).
- Fjern bindevævet fra kammeret og sløjfen pedicle hjælp dissekere saks og microforceps. Skær løkken stilken i en afstand af 1 cm fra kammerets åbning med dissekere saks og fjern kammeret.
- Åbn låget af kammeret og fjern forsigtigt konstruktionen fra kammeret med pincet og ordne det i 4% buffered formalin løsning i 24 timer ved stuetemperatur. Bagefter bruge konstruktionen til 3D mikro-computertomografi eller paraffin-indstøbt for histologisk analyse 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
tissue Engineering
For bone tissue engineering formål, blev en række forskellige knoglesubstitutter implanteret i små dyr rotte AV loop model 27,28,33,34. Vaskularisering udmærket kan påvises ved 3D mikro-computertomografi (mikro-CT) (figur 3A). Vaskularisering af et forarbejdet bovin spongiøs knogle (PBCB) matrix var signifikant højere i sløjfen gruppen sammenlignet med gruppen uden vaskularisering. En konstant voksende og maturating blodkar netværk udviklet inden for implantation kammer over 8 uger. Mellem 4 og 8 uger, blev der observeret kontinuerlig vækst i vaskulariserede væv mod midten af de konstruktioner, hvorimod ingen stigning blev påvist i den ikke-vaskulariserede gruppe 33. Prevascularization af PBCB matrix i 6 uger i AV loop model førte til overlegen overlevelse af den injicerede osteoblaster sammenlignet med kontrol osteoblaster. I modsætning til kontrolgrupperne blev ekspression af knogle-specifikke gener detekteres i AV loop gruppe med implanteret osteoblaster 28. Som en yderligere matrix, blev sintret bioaktivt glas sammen med fibringel implanteret i AV sløjfer af rotterne. Efter 3 uger, har et tæt netværk af nydannede fartøjer udviklet demonstreret ved mikro-CT og histologi 27.
Den implantation Kammeret blev ændret for at fremskynde stillads vaskularisering. Ved at anvende et perforeret titanium kammer, blev intrinsic vaskularisering understøttet af ydre fartøjer fra det omgivende væv. På bare 2 uger efter implantation af en β-tricalciumphosphat hydroxyapatit (β-TCP / HA) / fibrinmatrix, blev 83% af de fartøjer, tilsluttet AV loop med kontinuerlig stigning over tid og nåede 97% tilslutning efter 8 uger 34. Med implantation af 5 x 10 6 knoglemarv afledte mesenchymstamceller (MSC) og knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2), en signifikant stigning i knogledannelse sammenlignet med BMP-2 eller MSC alene grupper kunne induceres. Efter 6 og 12 uger, fibrinmatrixen var fuldstændigt nedbrudt og erstattet af stærkt vaskulariseret bindevæv i alle grupper (figur 3B 6 uger implantation). Der var et signifikant fald i fartøjets nummer i BMP-2 / MSC gruppe mellem 6 og 12 uger og efter 12 uger i de andre grupper. Dette skyldtes sandsynligvis modning af det vaskulære netværk eller kompakt arrangement af knoglestrukturer fører til en begrænset vaskulære netværk formation 32.
Udover knogle, kan andre væv, såsom muskel- eller lever også konstrueres i AV loop model.
For engineering aksialt vaskulariseret muskelvæv blev eksperimenter med primære myoblaster i en AV loop fibrinmatrix udført. Efter en prevascullinearisering cirka 2 uger til 2, 4, og 8 uger blev 1 x 10 6 myoblaster transplanteret ind i AV loop kammeret. Transplanterede myoblaster kunne redetekteret selv efter 8 uger ved hjælp carboxyfluorescein diacetat succinimidylester (CFDA) mærkning. Cellerne holdt deres myogene fænotype inden fibrinmatrixen og angivelse af muskel-specifikke markører MEF-2 og desmin var positiv efter 4 uger. Imidlertid myogene markørgenekspression var negativ efter 8 uger, hvilket var sandsynligvis på grund af fraværet af myogene stimuli og hurtig absorption af fibrinmatrixen 35. At øge myogene stimulation, blev en ny modifikation af rotte AV loop udviklet ved hjælp epigastriske vene i stedet for den vena saphena for at opnå en mere proximal placering af isolationskammer. Derfor blev yderligere inkorporering af obturatoren motoriske nerve geometrisk lettes. Ved at bruge denne AV loop modifikation, der omtales som EPI loop, kunne vi vise myogene differentiation af co-implanterede myoblaster og MSC 36.
For hepatisk vævsmanipulering blev 4 x 10 6 PKH-26 mærkede føtale leverceller transplanteret i en fibrin-matrix i rotten AV loop model i 2 uger. I kontrolgruppen blev matricer uden en AV loop og cellefrie matricer implanteret. Funktionelle kapillærer opstod fra AV loop fartøjer og stærkt vaskulariseret neo-væv blev observeret inden i kammeret efter 14 dages implantation, hvilket fremgår af CD31-farvning og tusch mærkning. Der var ingen forskel mellem celle-fri og hepatocyt AV loop gruppe. AV loop vaskulariseret fibrinmatrixen tæt og levedygtige føtale celler kunne påvises efter eksplantation ved positiv PKH-26-farvning og lever cellespecifik cytokeratin 18 (CK-18) immunhistologi hovedsageligt i nærheden af den større vaskulære akse. mRNA-niveauer af CK-18 var forhøjet i AV loop cellegruppe. I modsætning hertil ingen CK-18 expression kunne påvises i konstruktioner uden en sløjfe eller celler 37.
angiogenese Studies
AV loop består af tre segmenter: venen, den arterielle graft og interpositional venøs graft (IVG) segment (figur 1). Tredimensionale evaluering af det vaskulære system viste, at nyligt dannede kar stammede både fra den venøse og arterielle del samt fra det venøse interponate. Et stort antal nyligt dannede skibe blev observeret fra IVG 33. Med in vivo MRA, scanning elektronmikroskopi af korrosion afstøbninger og immun histologi, blev observeret indtræden af angiogenese i en fibrinmatrixen mellem dag 10 og 14. Frem for alt den venøse og IVG segmenter gav anledning til mange kapillærer og større fartøjer. En gradvis reduktion i luminal kaliber som et tegn på arterialization af IVG på grund af stigningen i endovaskulær tryk og shear stress was opdaget fra dag 7 på 38. I yderligere undersøgelser kunne det bekræftes, at vaskulær spiring foregår hovedsagelig på den ikke-arteriel transplantat 39.
Den nøjagtige analyse af angiogenese processer og stimulering og inhibering af blodkardannelse kunne visualiseres i AV loop implantation kammer. Den vækstfaktorer vaskulær endotel vækstfaktor A (VEGFA) og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) inducerede en højere absolut og relativ vaskulær densitet og hurtigere resorption af fibrinmatrixen sammenlignet med vækstfaktoren-free kontrolgruppe 31. Endvidere remodeling fænomener og modning af det vaskulære netværk i isolationskammeret visualiseret over en implantation periode på 8 uger. I AV loop kamre processer interkapillær sammenkobling og intussusceptive angiogenese samt mulige lymfe vækst blev identificeret immunhistologisk som parametre for neovascular modning 39. Ved at anvende PHD (prolyl hydroxylase domæne) inhibitor DMOG (dimethyloxallyl glycin) systemisk i rotter, kunne det vises, at koncentrationen af hypoxi-inducerbare faktor alfa (HIF-α) korrelerer med den stigende vaskularisering i AV loop og er en stimulus for fartøj udvækst 40.
Figur 1:. Scheme of en AV Loop i Rat Model AV løkke består af tre segmenter: venen (V), arteriel (A) graft og interpositional venøs graft (IVG) segment. AV loop kan indlejres i et lukket implantation kammer (C) for induktion af iboende vaskularisering. Klik her for at se en større version af dette tal.
ge = "1"> 
Figur 2: AV Loop Drift i Rat (A):.. Lokalisering af den femorale bundt på indersiden af bagbenene af rotte (B / C): Fremstilling af den femorale vaskulære bundt i venstre og højre lyske af rotten. Fartøjerne er adskilt (D), den interpositional venegraft høstes fra højre side (E) og anastomeres med den femorale vene (F) og femoral arterie i venstre side, en AV løkke (G, pilen angiver anastomoser). The Loop fartøjer overføres til implantation kammer forfyldt med en matrix (H), og efter fuldstændig fyldning (I) låget er lukket (J). A = femoral arterie, V = femorale vene, N = femoralis nerve, IVG = interpositional venøs graft. Scale bar 5 mm (DJ).tp_upload / 54.676 / 54676fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Visualisering af Vaskularisering i Rat AV Loop Model (A):. Micro-CT efter perfusion med et kontrastmiddel (gul perfuseret fartøjer) (B):. Hematoxylin-Eosin-farvning af en β-TCP / HA knoglesubstitut med MSC implanteret i AV loop model rotte i 6 uger. De AV loop skibe er perfunderet med tusch (sort farve). Målestok 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I over et årti, har vi med succes brugt arteriovenøse (AV) loop for vævsteknologiske formål og studere angiogenese in vivo i den lille dyremodel. Vi kunne påvise, at denne mikrokirurgisk model er meget velegnet til engineering forskellige væv, og at det kan også anvendes til angiogenese eller antiangiogenese undersøgelser.
Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder
Manipuleret væv eller organer kræver en funktionel blodkar netværk til at levere næringsstoffer og ilt, de har brug for deres overlevelse og vellykket integration efter transplantation ind i defekte sted 41. En række forskellige prevascularization strategier er blevet udviklet i de seneste årtier, som kan variere alt efter in vitro vs. in vivo og ydre vs iboende tilgange.
Stilladser kan være Fabricated med rørformet strukturer og podet med vaskulære celler, såsom endotelceller eller progenitorceller in vitro 42. På den anden side, til in vivo prevascularization, er skeletter implanteret i en stærkt vaskulariserede område såsom subkutan eller muskelvæv 21. Bagefter kan disse extrinsically vaskulariserede konstruktioner transplanteres til det defekte område. Imidlertid er ulempen ved disse fremgangsmåder er manglen på mikrokirurgisk forbindelse med modtagerens fartøjer efter transplantation. Især i tilfælde af store konstruktioner, umiddelbar forbindelse til værten vaskulatur er vigtig for umiddelbar levering af den konstruerede væv 43. Den åbenlyse og mest lovende løsning på dette problem ligger i frembringelsen af en iboende vaskulariseret væv eller organ af en vaskulær akse, såsom AV loop model.
Ud over anvendelse af AV loop fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, aksial vaskularisering kan alså fremkaldes ved hjælp af AV-bundter i stedet 44 eller kun ét fartøj såsom epigastriske arterie 45. Men i flere publikationer AV loop model viste sig at være overlegen med hensyn til graden af vaskularisering og mængden af de novo vævsdannelse. Tanaka et al. Sammenlignet både metodiske tilgange og observeret signifikant højere vævsdannelse og en større grad af udviklingslandene kapillærer i sløjfen i forhold til bundtet gruppe 46. Dong et al. også foretaget en undersøgelse ved hjælp af AV-loop eller AV bundt tilgange til knoglevæv engineering i en kanin model, som ligeledes viste signifikant højere vaskulær tæthed i sløjfen i forhold til bundtet gruppe 47. Vi var i stand til at bekræfte disse resultater samt show i en tidligere undersøgelse, at AV loop model har en højere kapacitet for angiogenese 48.
Så vidt vi ved, er der ingen sammenlignelig model for analysevaskularisering in vivo i en isoleret og velkarakteriseret miljø. Derfor AV loop model repræsenterer et stærkt værktøj til vurdering hvordan forskellige celletyper eller vækstfaktorer bidrager til fartøjets netværksdannelse eller vaskularisering processer i forskellige væv uden forstyrrelser fra omgivende strukturer, såsom invaderende celler eller vækstfaktorer.
Begrænsninger af teknikken
Men en væsentlig udfordring af den foreslåede model er den høje kompleksitet af kirurgien. For én, behandling af defekter ved hjælp af AV loop model kræver en to-trins procedure - prevascularization af stilladset og transplantation ind i det defekte site. Det betyder, at patienten skal have foretaget to operationer. Desuden mikrokirurgiske kompetencer er en nødvendig forudsætning for vellykkede anastomoserende submillimeter fartøjer 49. Derfor er AV bundle undertiden betragtes mere nyttigt for klinisk anvendelse, da jegt tilbyder også lovende, selv om mindre, potentiale for angiogenese og væv generation i forhold til AV loop 46. Dog kan denne operation læres trin-for-trin selv af ikke-kirurger, ved hjælp af små kaliber silicium rør til træning i starten og bagefter Kar af døde dyr (f.eks kylling ben) før gør AV loop drift i et levende dyr. I modsætning hertil kan de fleste praktiserede mikro-kirurger udføre denne operation med kun en kort tid på træning.
Kritiske trin i protokollen
Generelt på grund af den lille kaliber af skibene er der risiko for thrombedannelse og lukning af sløjfen fartøjer. Men i rottemodellen 80% -100% af løkkerne i gennemsnit blev patentet kun bruger korte tid heparin antikoagulation efter kirurgi 28,30,31,34,38,39.
På grund af den høje kompleksitet af kirurgien vil det tage et par timer (afhængigt af than ekspertise kirurgen). Det er vigtigt at afprøve korrekt bedøvelse af dyr under hele operationen, og i tilstrækkelig grad levere infusion for at opretholde et tilstrækkeligt tryk blod. Under den postoperative periode er det af stor betydning at kontrollere sundheden for dyr flere gange, for at administrere analgetika / antibiotika og for at kontrollere driften sår. Da implantation af en isoleret kammer i de fleste tilfælde udføres, er det muligt at infektion i det indre af kammeret sker uden at mærke. Derfor er det meget vigtigt at opretholde sterilitet under hele operationen og administration af antibiotika bør nøje ske over en periode på 3 - 5 døgn.
Ændringer af protokollen
Kammeret kan justeres individuelt til størrelsen og formen af defekten. Endvidere også membraner kan anvendes til at omslutte AV loop som udføres af Manasseri et al. 50. Desuden stilladset, supplemented celler og vækstfaktorer kan vælges i henhold til de forskellige vævstyper. For nylig, Miomas et al. Kombineret gen terapeutiske tilgange succes med AV loop model, som fremkalde forstærkning af vækst fartøj ved transduktion med VEGF165 51. For nylig har vi justeret rotte AV loop model for muskelvæv engineering formål. I stedet for de femorale kar, var epigastriske vene og vena arterie anvendes, som gjorde det muligt implantation af obturatoren nerve i den aksialt vaskulariserede stillads for motorisk innervation ( "EPI loop model") 36. Udover implantation af en motorisk nerve, den neurotization af knoglevæv manipuleret konstruktioner med sensoriske nerver er rapporteret at være til gavn for forbedret osteogenese og bedre reparation af knogledefekter 52. AV loop inducerer minimal donor site sygelighed og kan laves på forskellige steder af kroppen 52. Det ville være muligt at anvende overfladiske blodkar på andre steder aflegemet til generering af AV sløjfe eller endog at anvende andre dyr såsom kaniner eller musemodellen.
Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering denne teknik
For nylig vores arbejdsgruppe implanteret en velkarakteriseret murin embryonal endothelial progenitorcelle (EPC) linje (T17b), der udtrykker guanylat-bindende protein-1 (GBP-1) - en markør og intracellulær inhibitor af endotelcellefunktioner såsom proliferation, migration og invasion - i rotten AV loop model. Den antiangiogene kapacitet differentieret GBP-1-EPC kan påvise en signifikant reduktion af blodkar tæthed i AV loop konstruktioner. Med hensyn til klinisk anvendelse, kunne den proinflammatoriske antiangiogene GTPase GBP-1 åbne nye muligheder for antiangiogene terapier, f.eks., For kræft eller andre sygdomme 53. Baseret på denne undersøgelse, er det tænkeligt, at AV loop modellen kan anvendes til etablering af en patologiskvaskularisering netværk for yderligere analyse og mulig modulation. For eksempel, denne model giver en optimal mulighed for at få en bedre forståelse af tumor angiogenese, dens påvirkende faktorer og den præcise rolle, de forskellige celler involveret i tumor fartøj netværksdannelse såsom EPC'er, tumorceller og stamceller 54. In vivo kræftmodeller udføres ofte i genetisk modificerede mus til at simulere de processer og vækst karakteristika ved forskellige typer menneskelig kræft og har vist sig at være fremragende til lægemiddeludvikling og prækliniske forsøg 55. Desuden er der xenograftmodeller til transplantation tumorer i forsøgsdyr såsom immunsvækkede mus 56. En mere klinisk relateret tilgang indebærer transplantation fra patientens tumor, kendt som "personlige musemodeller" eller "patient-afledt tumorxenoplantater modeller" 57. Men disse modeller er ikke praktisk for at studere infl,indflydelse af en enkelt celle kilde eller vækstfaktor uden påvirkninger fra det omgivende væv.
AV loop model gør det muligt at anvende væv engineering metoder til at studere tumor biologi. Dette er defineret som "tumor engineering" af Ghajar et al. og involverer "opførelse af komplekse kultur modeller, rekapitule- aspekter af in vivo tumormikromiljøet at studere dynamikken i tumorudvikling, progression, og terapi på flere skalaer" 58. En tumor miljø kan konstrueres inden det isolerede implantation kammer, der tillader en præcis analyse af celle-celle interaktioner angiogenese, modulation, forbedring og inhibering. Endvidere kan AV loop model vise sig gavnlig for udvikling eller validering terapier om afbrydelse af neoangiogenese eller inhibering af tumorvækst.
Brug af denne fremgangsmåde til induktion vaskularisering, er det muligt at engineer væv i en klinisk relevant størrelse. I yderligere undersøgelser, var vi i stand til at generere aksialt vaskulariseret knoglevæv til transplantation med en betydelig mængde på ca. 15 cm³ i en forholdsvis kort tid på 12 uger 59,60. For at omsætte disse resultater til klinisk praksis, vil et bevis for princippet undersøgelse med skinnebenet defekt model udføres i den nærmeste fremtid forud for ansøgning i mennesker. Som et første skridt, kunne vi med held demonstrere in situ knoglevæv engineering i et stort volumen defekt i et klinisk scenarie med langsigtet stabilitet 61. Anvendelse af den beskrevne AV loop model gør det muligt at tilvejebringe en terapi tilpasses den enkelte patients behov. Baseret på vores resultater ideen om den menneskelige krop selv tjener som et levende bioreaktor stadig lover godt for fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke følgende institutioner til at støtte vores AV loop forskning: Staedtler Stiftung, Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Kontoret for Ligestilling og mangfoldighed, Forschungsstiftung Medizin Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), AO Foundation, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Hans Georg Geis Foundation, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Tyskland, og ministeriet for højere uddannelse og videnskabelig forskning, Irak. Vi vil gerne takke Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Köhn og Ilse Arnold-Herberth for deres fremragende tekniske support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride | Berlin-Chemie AG | 34592508 | |
| 11-0 Ethilon / polyamide 6/6 | Ethicon | EH7438G | |
| 4-0 Vicryl / polygalactin 910 | Ethicon | V392H | |
| 6-0 Prolene / polypropylene | Ethicon | 8695H | |
| aluminium spray | Pharma Partner Vertriebs-GmbH | 1020 | |
| antiseptics | BODE Chemie GmbH | ||
| Catheter | B Braun Meslungen AG | 4251612-02 | |
| contrast agent | Flowtech | MV-122 | |
| embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution | Intervet International GmbH | ||
| encre de chine intense Indian ink | Lefranc & Bourgeois | ||
| Enrofloxacin | Bayer AG | ||
| eye ointment | Bayer AG | ||
| Formalin 4% | Carl Roth GmbH & Co. KG | P087.4 | |
| Heparin | Ratiopharm GmbH | ||
| isoflurane | Abbott Laboratories | 6055482 | |
| Lewis rat, male | Charles River Laboratories | ||
| Metamizol-Natrium | Ratiopharm GmbH | ||
| papaverine / Paveron N | Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH | ||
| tramadol / Tramal | Grünenthal GmbH |
References
- Folkman, J., Haudenschild, C.
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312 (2014).
- Puddu, A., Sanguineti, R., Traverso, C. E., Viviani, G. L., Nicolo, M. Response to anti-VEGF-A treatment of endothelial cells in vitro. Exp Eye Res. 146, 128-136 (2016).
- Li, H., Daculsi, R., Bareille, R., Bourget, C., Amedee, J. uPA and MMP-2 were involved in self-assembled network formation in a two dimensional co-culture model of bone marrow stromal cells and endothelial cells. J Cell Biochem. 114 (3), 650-657 (2013).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Nehls, V., Herrmann, R. The configuration of fibrin clots determines capillary morphogenesis and endothelial cell migration. Microvasc Res. 51 (3), 347-364 (1996).
- Fischbach, C., et al. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Mac Gabhann, F. A systems biology view of blood vessel growth and remodelling. J Cell Mol Med. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tissue Eng Part B Rev. 15 (2), 159-169 (2009).
- Risau, W.
- Carmeliet, P.
- Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Agostini, S., et al. Barley beta-glucan promotes MnSOD expression and enhances angiogenesis under oxidative microenvironment. J Cell Mol Med. 19 (1), 227-238 (2015).
- Zhang, B., Xuan, C., Ji, Y., Zhang, W., Wang, D. Zebrafish xenotransplantation as a tool for in vivo cancer study. Fam Cancer. 14 (3), 487-493 (2015).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol Ther. 22 (1), 18-27 (2014).
- Min, Z., Shichang, Z., Chen, X., Yufang, Z., Changqing, Z. 3D-printed dimethyloxallyl glycine delivery scaffolds to improve angiogenesis and osteogenesis. Biomater Sci. 3 (8), 1236-1244 (2015).
- Sundaram, S., et al. Tissue-engineered vascular grafts created from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 3 (12), 1535-1543 (2014).
- Hori, A., Agata, H., Takaoka, M., Tojo, A., Kagami, H. Effect of Cell Seeding Conditions on the Efficiency of In Vivo Bone Formation. Int J Oral Maxillofac Implants. 31 (1), 232-239 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. , (2015).
- Wong, H. K., et al. Novel method to improve vascularization of tissue engineered constructs with biodegradable fibers. Biofabrication. 8 (1), 015004 (2016).
- Rouwkema, J., de Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Eng. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M.
- Erol, O. O., Spira, M. New capillary bed formation with a surgically constructed arteriovenous fistula. Surg Forum. 30, 530-531 (1979).
- Arkudas, A., et al. Evaluation of angiogenesis of bioactive glass in the arteriovenous loop model. Tissue Eng Part C Methods. 19 (6), 479-486 (2013).
- Arkudas, A., et al. Axial prevascularization of porous matrices using an arteriovenous loop promotes survival and differentiation of transplanted autologous osteoblasts. Tissue Eng. 13 (7), 1549-1560 (2007).
- Arkudas, A., et al. Composition of fibrin glues significantly influences axial vascularization and degradation in isolation chamber model. Blood Coagul Fibrinolysis. 23 (5), 419-427 (2012).
- Arkudas, A., et al. Dose-finding study of fibrin gel-immobilized vascular endothelial growth factor 165 and basic fibroblast growth factor in the arteriovenous loop rat model. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2501-2511 (2009).
- Arkudas, A., et al. Fibrin gel-immobilized VEGF and bFGF efficiently stimulate angiogenesis in the AV loop model. Mol Med. 13 (9-10), 480-487 (2007).
- Buehrer, G., et al. Combination of BMP2 and MSCs significantly increases bone formation in the rat arterio-venous loop model. Tissue Eng Part A. 21 (1-2), 96-105 (2015).
- Kneser, U., et al. Engineering of vascularized transplantable bone tissues: induction of axial vascularization in an osteoconductive matrix using an arteriovenous loop. Tissue Eng. 12 (7), 1721-1731 (2006).
- Arkudas, A., et al. Combination of extrinsic and intrinsic pathways significantly accelerates axial vascularization of bioartificial tissues. Plast Reconstr Surg. 129 (1), 55e-65e (2012).
- Bach, A. D., et al. A new approach to tissue engineering of vascularized skeletal muscle. J Cell Mol Med. 10 (3), 716-726 (2006).
- Bitto, F. F., et al. Myogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a newly developed neurotised AV-loop model. Biomed Res Int. 2013, 935046 (2013).
- Fiegel, H. C., et al. Foetal hepatocyte transplantation in a vascularized AV-Loop transplantation model in the rat. J Cell Mol Med. 14 (1-2), 267-274 (2010).
- Polykandriotis, E., et al. The venous graft as an effector of early angiogenesis in a fibrin matrix. Microvasc Res. 75 (1), 25-33 (2008).
- Polykandriotis, E., et al. Regression and persistence: remodelling in a tissue engineered axial vascular assembly. J Cell Mol Med. 13 (10), 4166-4175 (2009).
- Yuan, Q., et al. PHDs inhibitor DMOG promotes the vascularization process in the AV loop by HIF-1a up-regulation and the preliminary discussion on its kinetics in rat. BMC Biotechnol. 14, 112 (2014).
- Dew, L., MacNeil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Kang, Y., Mochizuki, N., Khademhosseini, A., Fukuda, J., Yang, Y. Engineering a vascularized collagen-beta-tricalcium phosphate graft using an electrochemical approach. Acta Biomater. 11, 449-458 (2015).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Zimmerer, R., Jehn, P., Spalthoff, S., Kokemuller, H., Gellrich, N. C.
- Dunda, S. E., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of a Novel, 3-Dimensional Cellulose Matrix Structure. Handchir Mikrochir Plast Chir. 47 (6), 378-383 (2015).
- Tanaka, Y., et al. Tissue engineering skin flaps: which vascular carrier, arteriovenous shunt loop or arteriovenous bundle, has more potential for angiogenesis and tissue generation? Plast Reconstr Surg. 112 (6), 1636-1644 (2003).
- Dong, Q. S., et al. Prefabrication of axial vascularized tissue engineering coral bone by an arteriovenous loop: a better model. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 32 (6), 1536-1541 (2012).
- Polykandriotis, E., et al.
- Mofikoya, B. O., Ugburo, A. O., Bankole, O. B. Does open guide suture technique improve the patency rate in submillimeter rat artery anastomosis? Handchir Mikrochir Plast Chir. 46 (2), 105-107 (2014).
- Manasseri, B., et al. Microsurgical arterovenous loops and biological templates: a novel in vivo chamber for tissue engineering. Microsurgery. 27 (7), 623-629 (2007).
- Moimas, S., et al. AAV vector encoding human VEGF165-transduced pectineus muscular flaps increase the formation of new tissue through induction of angiogenesis in an in vivo chamber for tissue engineering: A technique to enhance tissue and vessels in microsurgically engineered tissue. J Tissue Eng. 6, (2015).
- Fan, J., et al. Microsurgical techniques used to construct the vascularized and neurotized tissue engineered bone. Biomed Res Int. 2014, 281872 (2014).
- Bleiziffer, O., et al. Guanylate-binding protein 1 expression from embryonal endothelial progenitor cells reduces blood vessel density and cellular apoptosis in an axially vascularised tissue-engineered construct. BMC Biotechnol. 12, 94 (2012).
- Horch, R. E., et al. Cancer research by means of tissue engineering--is there a rationale? J Cell Mol Med. 17 (10), 1197-1206 (2013).
- Lee, H. Genetically engineered mouse models for drug development and preclinical trials. Biomol Ther (Seoul). 22 (4), 267-274 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research). Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
- Guiro, K., Arinzeh, T. L. Bioengineering Models for Breast Cancer Research. Breast Cancer (Auckl). 9 (Suppl 2), 57-70 (2015).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2153-2156 (2010).
- Boos, A. M., et al. Engineering axially vascularized bone in the sheep arteriovenous-loop model. J Tissue Eng Regen Med. 7 (8), 654-664 (2013).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Horch, R. E., Beier, J. P., Kneser, U., Arkudas, A. Successful human long-term application of in situ bone tissue engineering. J Cell Mol Med. 18 (7), 1478-1485 (2014).
