Summary
Le noyau pédonculopontin (PPN) est situé dans le tronc cérébral et ses neurones sont au maximum activé lors d'éveil et de mouvements oculaires rapides (REM) cerveau de sommeil états. Cet ouvrage décrit l'approche expérimentale pour enregistrer in vitro bande gamma oscillation de la membrane subliminale dans les neurones PPN.
Abstract
Efférents synaptiques de la PPN sont connus pour moduler l'activité neuronale de plusieurs régions thalamiques intralaminaires (par exemple, le centrolateral / parafasciculaire; Cl / Pf noyau). L'activation soit du PPN ou noyaux Cl / Pf in vivo a été décrite pour induire l'éveil de l'animal et une augmentation de l'activité de la bande gamma dans l'électroencéphalogramme corticale (EEG). Les mécanismes cellulaires pour la production d'oscillations de la bande gamma à système d'activation réticulaire (RAS) neurones sont les mêmes que ceux trouvés pour générer gamma oscillations de la bande dans d'autres cerveaux noyaux. Pendant l'enregistrement courant clamp de neurones PPN (provenant parasagittales tranches de 9-25 jours d'âge des rats), l'utilisation de dépolarisation étapes carrés activée rapidement les canaux potassiques voltage-dépendants qui ont empêché les neurones PPN d'être dépolarisée au-delà de -25 mV.
Injecter 1 - 2 sec dépolarisants à long rampes actuelles progressivement dépolarisée PPN membranaires res potentielsting valeurs vers 0 mV. Cependant, l'injection de dépolarisation des impulsions carrées générées oscillations gamma-bande du potentiel de membrane qui ont montré à être plus petite en amplitude par rapport aux oscillations produites par des rampes. Toutes les expériences ont été réalisées en présence des canaux sodiques voltage-dépendants et rapide des récepteurs synaptiques bloquants. Il a été démontré que l'activation des canaux calciques voltage-dépendants à seuil élevé sous-tendent l'activité de la gamma-bande oscillatoire dans les neurones PPN. Interventions méthodologiques et pharmacologiques spécifiques sont décrites ici, en fournissant les outils nécessaires pour induire et maintenir PPN subliminale bande gamma oscillation in vitro.
Introduction
PPN noyau est anatomiquement inclus dans le tegmentum mésencéphalique caudale. Le PPN est une composante clé de la RAS 1. Le PPN participe au maintien des états activés de comportement (c. -à- veille, le sommeil paradoxal) 2. La stimulation électrique du PPN in vivo induite par oscillation rapide (20 - 40 Hz) dans l'EEG cortical 3, tandis que les lésions bilatérales PPN chez le rat réduit ou éliminé le sommeil paradoxal 4. Alors que la majorité des neurones PPN feu potentiels d'action à la fréquence bêta / gamma-bande (20 - 80 Hz), certains neurones ont présenté des taux de décharge spontanée faible (<10 Hz) 5. En outre, le PPN semble être impliqué dans d' autres aspects du comportement tels que la motivation et l' attention 6. Haute fréquence directe (40 - 60 Hz) 7 stimulation électrique du PPN noyau chez les animaux décérébrés peut favoriser la locomotion. Ces dernières années, la stimulation cérébrale profonde (DBS) de PPN a été utilisé pour traiter les patients souffrant from troubles impliquant des déficits de la marche tels que la maladie (PD) 8 Parkinson.
Les rapports précédents ont montré que presque tous les neurones PPN peuvent tirer des potentiels d'action au gamma fréquence de la bande lorsque dépolarisée en utilisant des impulsions de courant 9 carrés. En raison de l'activation drastique des canaux potassiques voltage-dépendants lors des impulsions carrées dépolarisations jusqu'à ou sous -25 mV. En conséquence, aucune oscillation gamma solides ont été observées après le blocage de la génération de potentiels d'action en utilisant 10 la tétrodotoxine. Dans un effort pour contourner un tel problème, 1 - 2 sec dépolarisants à long rampes actuelles ont été utilisés. Dépolarisées rampes progressivement le potentiel de membrane de repos des valeurs allant jusqu'à 0 mV, tandis que inactivant partiellement les canaux potassiques voltage-dépendants. Effacer les oscillations de la membrane de la bande gamma étaient évidents dans la fenêtre de la dépendance de la tension des canaux calciques seuil haut (entre -25 mV et -0 mV) 10. En conclusion, la bande gamma activity a été observée dans les neurones PPN 9, et les deux P / Q- et les canaux calciques voltage-dépendants de type N doivent être activés afin de générer des oscillations de la bande gamma dans le PPN 10.
Une série d'études a déterminé l'emplacement des canaux calciques seuil haut dans les neurones PPN. Injecter la combinaison de colorants, l' imagerie de fluorescence ratiométrique a montré des transitoires de calcium par les canaux calciques voltage-dépendants qui sont activés dans différents dendrites lorsque dépolarisée en utilisant des rampes de courant 11.
Les propriétés intrinsèques des neurones PPN ont été proposées pour permettre l'activation simultanée de ces cellules pendant l'éveil et le sommeil paradoxal, induisant ainsi à haute fréquence oscillatoire activité neuronale entre la RAS et les boucles thalamocorticales. Cette interaction de longue portée est considérée pour soutenir un état du cerveau capable d'évaluer de manière fiable le monde autour de nous sur une base continue 12. Ici, nous décrivons l'expérienceconditions al nécessaires pour générer et maintenir gamma bande oscillation dans les cellules PPN in vitro. Ce protocole n'a pas été décrit précédemment, et aiderait un certain nombre de groupes pour étudier les propriétés des membranes intrinsèques responsables de l'activité de la bande gamma à d'autres zones du cerveau. En outre, les mesures actuelles pourraient conduire à la conclusion erronée que l'activité de la bande gamma ne peut être générée dans ces cellules.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales (nombre Protocole # 3593) et sont en accord avec les National Institutes of Health des lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparation du liquide céphalo-rachidien Standard-artificielle (LCRa)
- Préparation de Stock Solution A
- Ajouter 700 ml d'eau distillée à un propre 1 bêcher avant d'ajouter des produits chimiques.
- Tout en agitant en continu d' un volume de 500 ml, ajouter 136,75 g de NaCl, 6,99 g de KCl, 2,89 g de MgSO4 et 2,83 g de NaH 2 PO 4.
- Ajouter de l' eau distillée de plus pour atteindre un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 117 mM de NaCl, 4,69 mM de KCl, 1,2 mM MgSO4 et 1,18 mM de NaH 2 PO 4.
- Garder au réfrigérateur à 4 ° C pendant 2 semaines.
- Préparation de la solution mère B
- Ajouter 700 ml d'eau distillée dans un bécher de 1L propre avant d'ajouter des produits chimiques.
- Tout en agitant en continu d' un volume de 500 ml, ajouter 41,45 g de D-glucose et 41,84 g de NaHCO 3.
- Ajouter de l' eau distillée de plus pour atteindre un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 11,5 mM de D-glucose et 24,9 mM NaHCO 3.
- Garder au réfrigérateur à 4 ° C pendant 2 semaines.
- Avant chaque mélange d'expérience de 50 ml de bouillon A avec 50 ml de B et porter à 1 L avec de l' eau distillée pour obtenir la solution finale concentration ACSF et de laisser à la température ambiante tout en continu oxygénant avec carbogène (95% O 2 - 5% de CO 2 mix) pendant au moins 30 min. La préparation finale de la concentration LCRa seulement au début de chaque expérience et le jeter à la fin de la journée.
2. Préparation du liquide céphalo-rachidien sucrose-artificielle(Saccharose- aCSF)
- Préparation de la solution mère C
- Ajouter 700 ml d'eau distillée à un propre 1 bêcher avant d'ajouter des produits chimiques.
- Tout en agitant en continu 500 ml d'eau distillée, ajouter 240 g de saccharose, 6,55 g de NaHCO 3, 0,671 g de KCl, 4,88 g de MgCl2, 0,22 g de CaCl 2 et 0,21 g d'acide ascorbique.
- Rajouter de l' eau distillée pour parvenir à un volume final de 1 L. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de 701.1 mM de saccharose, 78 mM de NaHCO 3, 9 mM de KCl, 24 mM MgCl 2, CaCl 1,5 mM d' acide ascorbique 2 et 1,2 mM .
- Gardez solution mère C à 4 ° C pendant une semaine.
- Avant chaque mélange d'expérience 300 ml de 50 ml de bouillon C avec 600 ml d' eau distillée pour obtenir la solution de saccharose-LCRa à la concentration finale et de laisser à la température ambiante tout en continu oxygénant avec carbogène (95% O 2 - 5% de CO 2 mix) pendant au moins 30 min.
3. Slice Préparation
- Placer un récipient propre avec 100 ml de solution de saccharose LCRa dans de la glace tout en oxygénant carbogène et fixer le pH à 7,4 en utilisant un pH-mètre, tout en ajoutant quelques gouttes d'une solution 0,1 M de NaOH (lorsque le pH <7,4) ou d'une solution 0,1 M de HCl (lorsque pH> 7,4).
- Remplir une chambre de coupe d'un vibratome avec du saccharose-LCRa et oxygéner. Allumez le système de réfrigération à base de glycérol couplé à la chambre de coupe et attendre 15 min pour lui permettre de refroidir à 0 - 4 ° C.
- Anesthetize bébés rats (âgés de 9 à 12 de l' adulte de rats Sprague-Dawley chronométré enceintes) avec kétamine (70 mg / kg, ip, en utilisant <50 ul de volume final). Lorsque chiot est calme, double vérifier que la queue pincée réflexe est absent.
- Décapitez chiots.
- Couper la peau de la tête longitudinalement de l'avant vers l'arrière en utilisant une lame de scalpel en acier au carbone, et tirer la peau sur les côtés à l'aide de forceps. Couper l'os recouvrant le cerveau déplaçant la scissors latéralement et retirer totalement afin d'exposer le cerveau.
- Ensuite, retirez rapidement le cerveau à l'aide d'une spatule (initialement placé sous le bulbe olfactif afin de pousser doucement le cerveau du plus rostrale vers les zones les plus caudales). Poussez doucement le cerveau en oxygéné liquide céphalo-rachidien de saccharose artificielle glacée (sucrose-LCRa).
- Faire une coupe sagittale sur l'hémisphère droit (retirer environ un tiers de l'hémisphère), et collez le côté garni du cerveau sur un disque métallique qui sera magnétiquement fixé à la chambre de coupe d'un vibroslicer pour couper sagittal 400 um sections contenant le pédonculopontin noyau (PPN). Gardez les tranches PPN à température ambiante pendant 45 min avant de cellules entières enregistrements de patch-clamp.
4. Oscillations Recordings Gamma-bande en PPN tranches
- Préparation de Potassium-gluconate Solution intracellulaires (High-K + Solution)
- Placer dansglace un bécher propre avec 10 ml d'eau distillée. Tout en agitant continuellement ajouter: K + -gluconate, 90,68 mg phosphocréatine di Tris sel, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg 2+ -ATP, et 4 mg Na + 2 -GTP.
- Ajuster le pH à 7,3 avec du KOH (100 mM dans l'eau distillée). Ajouter de l'eau distillée pour atteindre un volume final de 20 ml. Si nécessaire, ajuster l'osmolarité avec du saccharose (100 mM dans de l'eau distillée) pour être 280-290 mOsm. Après dilution, la concentration finale de chaque composé est de K + 124 mM -gluconate, 10 mM de Tris phosphocréatine di sel, HEPES 10 mM, EGTA 0,2 mM, 4 mM de Mg 2+ ATP et 0,3 mM de Na + 2 -GTP.
- solutions aliquote intracellulaires dans 1 ml de tubes et de congélation à -20 ° C. Utilisez une aliquote par jour et conserver à 4 ° C au cours des expériences.
- Whole-cell patch clamp Recordings
- Placer les tranches dans une chambre d'immersion et les (1,5 ml / min) avec perfuser oxygénées(95% de O 2 - 5% de CO 2) LCRa contenant les antagonistes des récepteurs suivants: un antagoniste du récepteur de l' acide sélectif de NMDA 2-amino-5-phosphonovalérique (APV, 40 uM), compétitif AMPA / kainate antagoniste du récepteur du glutamate 6-cyano-7- nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 10 uM), un antagoniste des récepteurs de la glycine strychnine (STR, 10 uM), le GABA spécifique Un gabazine antagoniste des récepteurs (GBZ, 10 uM) et bloquant les canaux de sodium tétrodotoxine (TTX, 3 pM)
NOTE: Dans les résultats et les chiffres, ces antagonistes sont collectivement appelés bloquants ou SBs comme synaptiques. - Remplissez les pipettes de patch d'enregistrement (Résistance 2-7 MQ, fabriqué à partir de réguliers disponibles dans le commerce épais capillaires, de verre mur de borosilicate de 1,0 mm de diamètre extérieur et de 0,6 mm de diamètre intérieur) avec une solution intracellulaire haute-K + à l' aide disponibles dans le commerce charges patch-pipettes avec filtre de solution. Insérez la pipette dans le support de son amplificateur. Appliquer une petite positive pression en utilisant une seringue de 1 ml reliée au support de la pipette à l'aide d'un tube de silicium relié à une vanne à trois voies. Se connecter à l'arrière du porte-pipette à un amplificateur de patch-clamp.
- Déplacer la pipette d'enregistrement en utilisant un micromanipulateur mécanique près du noyau PPN en utilisant un objectif 4X combinée à proche infrarouge contraste optique d'interférence différentielle.
NOTE: PPN noyau peut être observé dans les tranches dorsale du pédoncule cérébelleux supérieur (SCP; observable comme un gros paquet d'axones). Les pipettes d'enregistrement étaient situés dans la pars compacta PPN, qui est située immédiatement dorsale à l'extrémité postérieure du pédicule. - Amener la pipette d'enregistrement en contact avec un neurone PPN alors visualisé à l'aide d'un objectif 40X à immersion de l'eau, et appliquer rapidement aspiration négative pour former un joint étanche avec la cellule.
- Utiliser un logiciel d'étanchéité voltage-clamp pour surveiller la résistance de la pipette lors de l'aspiration négative en utilisant le protocole du fabricant.
- Lorsque s négatifsuction augmente lentement et les valeurs de résistance de lecture par le moniteur de patch-clamp à la pointe de la pipette atteindre 80 - 100 MOhm, changer rapidement le potentiel de maintien de -50 mV et relâcher la pression négative. Commencer à appliquer de façon continue aspiration négative jusqu'à ce que la rupture électrique membrane et l'accès du neurone est obtenu dans la configuration de cellule entière.
- Si les valeurs de résistance d'accès mesurées par le logiciel d'étanchéité voltage-clamp sont 10 MOhm ou plus, puis continuer à appliquer une aspiration négative en plus petites quantités.
- Compenser la capacité ( par exemple, les transitoires lents et rapides observés après la rupture de la membrane de la cellule) et la résistance série en mode voltage-clamp. Mettez le mode d' enregistrement à pince de courant, et rapidement compenser les valeurs de pont (par exemple, déplacer le bouton de l' amplificateur ou cliquez sur le menu de compensation automatique en utilisant la souris le ordinateur).
- Surveiller en permanence potentiel de repos de la membrane du neurone PPN étant u enregistréchanter le protocole du fabricant. Si au repos membrane changement potentiel vers dépolarisants ou hyperpolarisants valeurs, utiliser de petites quantités de courant continu (jusqu'à 100 pA) pour maintenir la valeur finale mV optimale -50.
NOTE: Gardez les neurones PPN seulement avec un potentiel stable membranaire de repos (RMP) de -48 mV ou plus hyperpolarisé (ie, RMP <-48 mV).
- Surveiller en permanence potentiel de repos de la membrane du neurone PPN étant u enregistréchanter le protocole du fabricant. Si au repos membrane changement potentiel vers dépolarisants ou hyperpolarisants valeurs, utiliser de petites quantités de courant continu (jusqu'à 100 pA) pour maintenir la valeur finale mV optimale -50.
- Placer les tranches dans une chambre d'immersion et les (1,5 ml / min) avec perfuser oxygénées(95% de O 2 - 5% de CO 2) LCRa contenant les antagonistes des récepteurs suivants: un antagoniste du récepteur de l' acide sélectif de NMDA 2-amino-5-phosphonovalérique (APV, 40 uM), compétitif AMPA / kainate antagoniste du récepteur du glutamate 6-cyano-7- nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 10 uM), un antagoniste des récepteurs de la glycine strychnine (STR, 10 uM), le GABA spécifique Un gabazine antagoniste des récepteurs (GBZ, 10 uM) et bloquant les canaux de sodium tétrodotoxine (TTX, 3 pM)
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Representative Results
Dans un premier temps, les oscillations gamma ont été évoquées en utilisant des impulsions de courant carrés. L' enregistrement en cours de serrage des neurones PPN en présence de bloqueurs synaptiques et TTX a été surveillée en continu pour garantir que le potentiel de membrane au repos est maintenu stable à ~ -50 mV (figure 1A). Deux deuxièmes longues impulsions de courant carrées ont été injectées par voie intracellulaire par l'amplificateur de patch-clamp à travers la pipette d'enregistrement, en augmentant leur amplitude de 200 Pa à 600 Pa (figure 1A). le potentiel de membrane a été dépolarisées à des niveaux de tension plus proche de -20 mV 600 pA, ce qui entraîne de petites oscillations d'amplitude gamma. Les spectres de puissances oscillations gamma présente des valeurs très faible amplitude ( par exemple, <0,01; figure 1B). D'autre part, deux rampes de courant deuxième dépolarisants a été injecté par voie intracellulaire par l'amplificateur de patch-clamp à travers la pipette d'enregistrement, la génération d'oscillations gamma robustes(Figure 2A) qui a présenté des amplitudes de puissance beaucoup plus élevée (figure 2B).
Les travaux antérieurs 10 a lié les différences entre la place et la rampe protocoles actuels à l'activation de la chaîne de canaux potassiques voltage-dépendants lors de la dépolarisation soudaine de l'ancien. rampes dépolarisants lentes pourraient plutôt être inactiver les canaux potassiques.
Figure 1. Membrane Oscillations en cellules entières connu PPN Neurones utilisant carrés actuels Impulsions d'amplitude croissante. (A) membrane représentant les réponses potentielles à dépolarisation 2 sec étapes longues carrés d'amplitude croissante injecté intracellulaire par l'amplificateur de patch-clamp à travers la pipette d'enregistrement, en présence de bloqueurs synaptiques et TTX. (B) Chevauchementles amplitudes des spectres de puissance pour les oscillations obtenues en utilisant des impulsions carrées indiquées dans A. Les spectres de puissance ont été obtenus en utilisant une fonction de fenêtre de Hamming après 20 - oscillations de filtrage passe-bande 60 Hz générées par les étapes consistant à dépolarisants. PPN neurone a été enregistré dans la configuration actuelle-clamp combinant haute K-+ solution intracellulaire et bloqueurs synaptiques + TTX décrits dans le protocole. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Gamma Band Membrane Oscillations en cellules entières connu Neurones PPN utilisant Rampes actuels d'augmenter Amplitude. (A) membrane représentant les réponses potentielles à dépolarisation 2 sec longues rampes injectés par l'amplificateur patch clamp intracellulairement à travers l'enregistrement pipette, spectacle. ing amplitude croissante en présence de bloqueurs synaptiques et TTX (B) chevauchant les amplitudes des spectres de puissance pour les oscillations obtenues à l' aide de rampes montrées dans A. Les spectres de puissance ont été obtenus en utilisant une fonction de fenêtre de Hamming au bout de 20 - 60 Hz oscillations de filtrage passe - bande généré par la rampe de dépolarisation . PPN neurone a été enregistré dans la configuration actuelle-clamp combinant haute K-+ solution intracellulaire et bloqueurs synaptiques + TTX décrits dans le protocole. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Neurones PPN ont des propriétés intrinsèques qui leur permettent de tirer des potentiels d'action à des fréquences de la bande bêta / gamma pendant les enregistrements in vivo à partir d' animaux qui sont éveillés ou pendant le sommeil paradoxal, mais pas pendant le sommeil lent 2,3,5,13-17. D'autres auteurs ont montré que les transections du tronc cérébral à plusieurs niveaux antérieurs à PPN réduit les fréquences gamma pendant les enregistrements EEG. Cependant, lorsque les lésions du tronc cérébral postérieurs à l' endroit où ce noyau se trouve, la stimulation directe de PPN a permis à la manifestation de l' activité gamma corticale sur l'EEG 2,3,5,18-21. Gamma band activité neuronale a été rapportée chez la souris PPN in vitro 22, dans la zone de sommeil d'induction REM de rat (à qui projette le PPN 23), dans le chat in vivo 3, dans la zone PPN chez les primates lorsque locomoting 24, et dans la région du PPN chez l' homme au cours de 25 renforcement. Autrement dit, il y a suffisamment de preuves pour l'activité bande gamma in la PPN à travers les espèces.
Ce protocole expérimental détaillé ici a permis la description des oscillations gamma présents à tous les types de cellules de rat PPN 10. En fait, les mécanismes intrinsèques oscillations gamma sous-jacents ont été décrits pour être présent dans chaque neurone PPN (alors que les cellules autour de la PPN ne partagent pas cette propriété), indépendamment des classifications utilisées précédentes ou synaptic type de transmetteur: type I, II ou III, ou émetteur type cholinergique, glutamatergique ou GABAergique partagent la même bande gamma générant de la propriété 10. L'utilisation de rampes actuelles a la limitation de nécessiter une surveillance continue du potentiel membranaire de repos, et la compensation de pont permanent tout au long de l'expérience. Dans certains cas, des rampes inférieures à 1 seconde ont été observées pour ne pas activer complètement les canaux calciques voltage-dépendants, tandis que la durée de rampe de 5 s ou plus ont entraîné des changements de résistance de la membrane qui subsisteraient non compensée pendant l'expérience. Dans le cas no oscillations gamma ont été observées, de petits ajustements dans la durée de la rampe pourraient améliorer la bande gamma amplitudes d'oscillation.
La combinaison de dépolarisation actuelles rampes avec des toxines spécifiques que nous avons décrits que dans une proportion importante de cellules PPN (~ 50%) de blocage N-et / de type Q P (utilisant à la fois ω-CGTX et ω-Aga) canaux canaux calciques réduits oscillation gamma amplitude, ce qui nous permet de les classer en tant que P / Q- et des cellules de type n. Dans d'autres cellules (20%), les oscillations gamma ont été affectés que par ω-aga, ce qui suggère que ces cellules expriment des canaux / Q de type P uniquement. Dans le reste des cellules (30%) seulement ω-CGTX les a bloqués, suggérant que ces neurones PPN avaient seulement des canaux de type N. Ces résultats ont confirmé la présence de cellules dans le PPN qui manifestent les oscillations de la bande gamma par l'expression de différents canaux calciques voltage-dépendants 26,27. Ce nouveau protocole peut également être considéré comme un outil clé qui a permis la mise en place d'une nouvelle cellule typ PPNe classement sur le terrain. En fait, il a été suggéré que de type N seulement neurones PPN feu uniquement pendant le sommeil paradoxal ( «REM-on"), / de type Q P uniquement pendant la veille ( "Wake-on»), ou de type N + P / Q-type au cours de deux la veille et le sommeil paradoxal ( «Wake / REM-on") 26,27. En outre, ce protocole peut être utilisé dans des expériences futures pour décrire l'activité oscillatoire dans d'autres zones du cerveau et de démontrer les propriétés intrinsèques les déclencher.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | C12H22O11, molecular weight = 342.30 |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | NaHCO3, molecular weight = 84.01 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | KCl, molecular weight = 74.55 |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | MgCl2 · 6H2O, molecular weight = 203.30 |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | C6H12O6, molecular weight = 180.16 |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | C6H8O6, molecular weight =176.12 |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | NaCl, molecular weight = 58.44 |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | C6H11KO7, molecular weight = 234.25 |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma-Aldrich | P1937 | C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight = 453.38 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | [-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40 |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma-Aldrich | A9187 | C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18 |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18 |
| Tetrodotoxin citrate | Alomone Labs | T-550 | C11H17N3O8, molecular weight = 319.27 |
| DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid | Sigma-Aldrich | A5282 | C5H12NO5P, molecular weight = 197.13 |
| CNQX disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | C239 | C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12 |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | C21H22N2O2, molecular weight = 334.41 |
| Mecamylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M9020 | C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75 |
| Gabazine (SR-95531) | Sigma-Aldrich | S106 | C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23 |
| Ketamine hydrochloride | Mylan | 67457-001-00 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| Pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| Pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200 S | |
| Refrigeration system | Vibratome Instruments | 900R | |
| Equipment | |||
| microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C |
References
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