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Neuroscience

Pedunculopontine नाभिक न्यूरॉन्स में रिकॉर्डिंग गामा बैंड दोलन

Published: September 14, 2016 doi: 10.3791/54685
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1IFIBYNE-CONICET, University of Buenos Aires, 2Center for Translational Neuroscience, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

pedunculopontine नाभिक (PPN) मस्तिष्क में स्थित है और इसकी न्यूरॉन्स ज़्यादा से ज़्यादा जागने और तेजी से आँख आंदोलन (REM) नींद मस्तिष्क राज्यों के दौरान सक्रिय रहे हैं। इस काम प्रयोगात्मक दृष्टिकोण PPN न्यूरॉन्स इन विट्रो गामा बैंड subthreshold झिल्ली दोलन में रिकॉर्ड करने के लिए वर्णन करता है।

Abstract

(; सीएल / पीएफ नाभिक जैसे, centrolateral / parafascicular) PPN से synaptic efferents कई intralaminar thalamic क्षेत्रों के neuronal गतिविधि मिलाना जाना जाता है। या तो PPN या विवो में सीएल / पीएफ नाभिक की सक्रियता के जानवर की उत्तेजना और cortical Electroencephalogram (ईईजी) में गामा बैंड गतिविधि में एक वेतन वृद्धि के लिए प्रेरित करने का वर्णन किया गया है। जालीदार सक्रिय प्रणाली में गामा बैंड दोलनों की पीढ़ी के लिए सेलुलर तंत्र (आरएएस) के न्यूरॉन्स अन्य दिमाग नाभिक में गामा बैंड दोलनों उत्पन्न करने के लिए पाए जाने वाले के रूप में ही हैं। PPN न्यूरॉन्स की वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग (9 से parasagittal स्लाइस से - 25 दिन पुरानी चूहों) के दौरान, वर्ग कदम depolarizing का उपयोग तेजी से वोल्टेज पर निर्भर पोटेशियम चैनल है कि -25 एम वी परे depolarized किया जा रहा से PPN न्यूरॉन्स रोका सक्रिय है।

इंजेक्शन 1 - 2 सेकंड लंबा वर्तमान रैंप depolarizing धीरे-धीरे depolarized PPN झिल्ली क्षमता resटिंग 0 एम वी के प्रति महत्व देता है। हालांकि, इंजेक्शन लगाने depolarizing वर्ग दालों कि रैंप द्वारा उत्पन्न दोलनों की तुलना आयाम में छोटे होने से पता चला झिल्ली क्षमता के गामा-बैंड दोलनों उत्पन्न। सभी प्रयोगों वोल्टेज gated सोडियम चैनल और तेजी से synaptic रिसेप्टर्स ब्लॉकर्स की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया। यह दिखाया गया है कि उच्च दहलीज वोल्टेज पर निर्भर कैल्शियम चैनल के सक्रियण PPN न्यूरॉन्स में गामा-बैंड oscillatory गतिविधि कायम करना। विशिष्ट पद्धति और औषधीय हस्तक्षेप यहाँ वर्णित हैं, आवश्यक उपकरण उपलब्ध कराने के लिए प्रेरित और इन विट्रो में PPN subthreshold गामा बैंड दोलन बनाए रखने के लिए।

Introduction

PPN नाभिक anatomically दुम mesencephalic tegmentum में शामिल है। PPN रास 1 के एक महत्वपूर्ण घटक है। PPN व्यवहार सक्रिय राज्यों के रखरखाव में भाग लेता है (यानी, जागने, रेम नींद) 2। - (40 हर्ट्ज 20) cortical ईईजी 3 में जबकि चूहे में द्विपक्षीय PPN घावों कम या रेम नींद 4 का सफाया विवो में PPN की बिजली की उत्तेजना तेजी से दोलन प्रेरित किया। PPN न्यूरॉन्स के बहुमत बीटा / गामा-बैंड आवृत्ति पर कार्रवाई क्षमता आग जबकि (20 - 80 हर्ट्ज), कुछ न्यूरॉन्स सहज गोलीबारी की कम दरों प्रस्तुत (<10 हर्ट्ज) 5। इसके अलावा, इस तरह के PPN प्रेरणा और ध्यान के रूप में 6 व्यवहार के अन्य पहलुओं में शामिल किया जा रहा है। प्रत्यक्ष उच्च आवृत्ति (40 - 60 हर्ट्ज) गहन निश्चेतना पशुओं में PPN नाभिक के 7 बिजली की उत्तेजना हरकत को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। हाल के वर्षों में, गहरी मस्तिष्क उत्तेजना (डीबीएस) PPN के इधर-उधर पीड़ित रोगियों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया हैमीटर चाल घाटे से जुड़े विकारों ऐसे पार्किंसंस रोग (पीडी) 8 के रूप में।

पिछली रिपोर्टों का प्रदर्शन किया है कि लगभग सभी PPN न्यूरॉन्स गामा बैंड आवृत्ति पर कार्रवाई क्षमता आग सकते हैं जब वर्ग वर्तमान दालों 9 का उपयोग depolarized। क्योंकि अप करने के लिए या -25 के तहत एम वी वर्ग दालों depolarizations दौरान वोल्टेज gated पोटेशियम चैनलों के कठोर सक्रियण की। एक परिणाम के रूप में, कोई मजबूत गामा दोलनों कार्रवाई क्षमता पीढ़ी tetrodotoxin 10 का उपयोग कर अवरुद्ध करने के बाद मनाया गया। एक ऐसी समस्या को बायपास करने के प्रयास में, 1 - 2 सेकंड लंबा वर्तमान रैंप depolarizing इस्तेमाल किया गया। रैंप धीरे-धीरे, 0 एम वी अप करने के लिए मूल्यों को आराम से झिल्ली क्षमता depolarized जबकि आंशिक रूप से वोल्टेज gated पोटेशियम चैनलों निष्क्रिय। साफ गामा बैंड झिल्ली दोलनों (यानी -25 एम वी और -0 एम वी) के बीच उच्च सीमा कैल्शियम चैनल की वोल्टेज निर्भरता खिड़की के भीतर स्पष्ट थे 10। अंत में, गामा बैंड गतिविधियोंTy PPN न्यूरॉन्स 9 में मनाया गया, और दोनों पी / क्यू और एन-प्रकार वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल आदेश PPN 10 में गामा बैंड दोलनों उत्पन्न करने में सक्रिय होने की जरूरत है।

अध्ययन की एक श्रृंखला PPN न्यूरॉन्स में उच्च सीमा कैल्शियम चैनल के स्थान निर्धारित की। रंगों के संयोजन इंजेक्शन, ratiometric प्रतिदीप्ति इमेजिंग वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल है कि अलग अलग dendrites में सक्रिय कर रहे हैं जब मौजूदा रैंप 11 का उपयोग depolarized के माध्यम से कैल्शियम यात्रियों दिखाया।

PPN न्यूरॉन्स के आंतरिक गुणों जागने और रेम नींद, इस प्रकार आरएएस और thalamocortical छोरों के बीच उच्च आवृत्ति oscillatory neuronal गतिविधि उत्प्रेरण के दौरान इन कोशिकाओं के एक साथ सक्रियण अनुमति देने के लिए सुझाव दिया गया है। इस तरह लंबे समय तक पहुँचने बातचीत एक मस्तिष्क राज्य मज़बूती से एक सतत आधार पर 12 हमारे आसपास की दुनिया का आकलन करने में सक्षम समर्थन करने के लिए माना जाता है। यहाँ, हम प्रयोग का वर्णनअल शर्तों आवश्यक पैदा करते हैं और इन विट्रो में PPN कोशिकाओं में गामा बैंड दोलन बनाए रखने के लिए। इस प्रोटोकॉल पहले से वर्णित नहीं किया गया है, और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में गामा बैंड गतिविधि मध्यस्थता आंतरिक झिल्ली गुणों का अध्ययन करने के लिए समूहों की एक संख्या में मदद मिलेगी। इसके अलावा, मौजूदा कदम गलत निष्कर्ष है कि गामा बैंड गतिविधि इन कोशिकाओं में उत्पन्न नहीं किया जा सकता करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल मेडिकल साइंसेज के लिए अर्कांसस विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल संख्या # 3593) की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ समझौते में थे।

1. मानक-कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव की तैयारी (ACSF)

  1. स्टॉक समाधान ए की तैयारी
    1. रसायन जोड़ने से पहले एक स्वच्छ 1 एल बीकर आसुत जल के 700 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. जबकि लगातार 500 मिलीलीटर की एक मात्रा क्रियाशीलता, सोडियम क्लोराइड की 136.75 जी, KCl की 6.99 जी, MgSO 4 की 2.89 ग्राम, और नः 2 4 पीओ की 2.83 ग्राम जोड़ें।
    3. अधिक आसुत जल कमजोर पड़ने के बाद 1 एल के अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए जोड़ें, प्रत्येक परिसर के अंतिम एकाग्रता 117 मिमी NaCl, 4.69 मिमी KCl है, 1.2 मिमी MgSO 4, और 1.18 मिमी नः 2 4 पीओ।
    4. 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें।
  2. स्टॉक समाधान बी की तैयारी
    1. रसायन जोड़ने से पहले एक साफ 1L बीकर आसुत जल के 700 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. जबकि लगातार 500 मिलीलीटर की एक मात्रा क्रियाशीलता, डी ग्लूकोज की 41.45 जी और 3 NaHCO के 41.84 ग्राम जोड़ें।
    3. अधिक आसुत जल कमजोर पड़ने के बाद 1 एल के अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए जोड़ें, प्रत्येक परिसर के अंतिम एकाग्रता 11.5 मिमी डी ग्लूकोज और 24.9 मिमी 3 NaHCO है।
    4. 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें।
    5. एक प्रयोग के मिश्रण से पहले 50 मिलीलीटर शेयर बी के साथ शेयर एक के 50 मिलीग्राम और आसुत जल के साथ 1 एल के लिए लाने के अंतिम एकाग्रता ACSF समाधान प्राप्त करने और जबकि लगातार carbogen (95% हे 2 - 5% सीओ 2 के मिश्रण) के साथ यह oxygenating आरटी पर छोड़ने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए। केवल एक प्रयोग की शुरुआत में अंतिम एकाग्रता aCSF को तैयार है और दिन के अंत में त्यागें।

2. सुक्रोज-कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव की तैयारी(सूक्रोज-ACSF)

  1. स्टॉक समाधान सी की तैयारी
    1. रसायन जोड़ने से पहले एक स्वच्छ 1 एल बीकर आसुत जल के 700 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. जबकि लगातार आसुत जल की 500 मिलीलीटर क्रियाशीलता, सूक्रोज के 240 जी, 3 NaHCO के 6.55 जी, KCl की 0.671 जी, 2 MgCl के 4.88 जी, 2 CaCl के 0.22 जी और एस्कॉर्बिक एसिड की 0.21 ग्राम जोड़ें।
    3. कमजोर पड़ने के बाद 1 एल के अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए और अधिक आसुत जल जोड़ें, प्रत्येक परिसर के अंतिम एकाग्रता 701.1 मिमी सूक्रोज, 78 मिमी NaHCO 3, 9 मिमी KCl, 24 मिमी 2 MgCl, 1.5 मिमी 2 CaCl और 1.2 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड होता है ।
    4. अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान सी रखें।
    5. एक प्रयोग के मिश्रण से पहले आसुत जल अंतिम एकाग्रता में सुक्रोज-ACSF समाधान प्राप्त करने और जबकि लगातार carbogen (95% हे 2 - 5% सीओ 2 के मिश्रण) के साथ यह oxygenating आरटी पर छोड़ने के लिए 600 मिलीलीटर के साथ शेयर सी की 50 मिलीलीटर की 300 मिलीलीटर कम से कम 30 मिनट के लिए।

    3. टुकड़ा तैयारी

    1. बर्फ में 100 मिलीलीटर सुक्रोज-ACSF समाधान के साथ एक साफ बीकर रखें जबकि यह carbogen साथ oxygenating और जब तक 0.1 एम NaOH समाधान की कुछ बूँदें जोड़ने के लिए एक पीएच मीटर का उपयोग कर 7.4 पर पीएच ठीक (जब पीएच <7.4) या 0.1 एम एचसीएल समाधान (जब पीएच> 7.4)।
    2. सुक्रोज-ACSF के साथ एक vibratome की एक काटने कक्ष भरें और इसे आक्सीजन। ग्लिसरॉल आधारित ठंडा करने प्रणाली को काटने चैम्बर के लिए मिलकर चालू करें और इंतजार 15 मिनट में यह 0 से नीचे शांत करने के लिए अनुमति देने के लिए - 4 डिग्री सेल्सियस।
    3. चूहे पिल्ले अक्स के साथ (वयस्क समय गर्भवती Sprague-Dawley चूहों से 12 करने के लिए 9 आयु वर्ग) anesthetize (70 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी, 50 μl अंतिम मात्रा का उपयोग कर <)। जब पिल्ला शांत है, डबल जाँच करें कि पूंछ चुटकी पलटा अनुपस्थित है।
    4. पिल्ले सिर काटना।
      1. एक कार्बन स्टील स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर वापस, और संदंश का उपयोग पक्षों के लिए त्वचा खींचने के लिए सामने से longitudinally सिर की त्वचा में कटौती। मस्तिष्क सुप्रीम कोर्ट चलती को कवर हड्डी कटlaterally issors और पूरी तरह से मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए इसे हटा दें।
      2. फिर, तेजी से मस्तिष्क एक रंग (शुरू में आदेश धीरे सबसे व्याख्यान चबूतरे से मस्तिष्क बाहर धक्का करने के लिए सबसे दुम क्षेत्रों की ओर में घ्राण बल्ब के तहत रखा गया) का उपयोग कर हटा दें। धीरे बर्फ ठंडा ऑक्सीजन सुक्रोज-कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (सूक्रोज-ACSF) में मस्तिष्क धक्का।
    5. दाएँ गोलार्द्ध पर एक parasagittal कटौती (गोलार्द्ध के लगभग एक तिहाई को हटाने) बना है, और एक धातु डिस्क है कि चुंबकीय एक vibroslicer के काटने के चैम्बर के लिए तय हो जाएगा युक्त बाण 400 माइक्रोन वर्गों में कटौती करने पर मस्तिष्क की छंटनी की ओर गोंद pedunculopontine नाभिक (PPN)। 45 मिनट के पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग से पहले के लिए आरटी पर PPN स्लाइस रखें।

    4. PPN स्लाइस में रिकॉर्डिंग्स गामा-बैंड दोलन

    1. पोटेशियम gluconate intracellular समाधान की तैयारी (उच्च + K समाधान)
      1. रखनाआसुत जल 10 मिलीलीटर के साथ एक साफ बीकर बर्फ। कश्मीर + -gluconate, 90.68 मिलीग्राम phosphocreatine di Tris नमक, 47.66 मिलीग्राम HEPES, 1.5 मिलीग्राम EGTA, 40.58 मिलीग्राम 2 मिलीग्राम + -ATP, और 4 मिलीग्राम ना + 2 -GTP: एक ओर जहां लगातार जोड़ने क्रियाशीलता।
      2. KOH के साथ 7.3 (आसुत जल में 100 मिमी) पीएच को समायोजित करें। आसुत जल मे 20 एमएल के अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए। 290 mOsm - यदि आवश्यक हो, 280 होने की सुक्रोज (आसुत जल में 100 मिमी) के साथ osmolarity समायोजित करें। कमजोर पड़ने के बाद, प्रत्येक परिसर के अंतिम एकाग्रता 124 मिमी कश्मीर + -gluconate है, 10 मिमी phosphocreatine di Tris नमक, 10 मिमी HEPES, 0.2 मिमी EGTA 4 मिमी 2 मिलीग्राम + -ATP, और 0.3 मिमी ना + 2 -GTP।
      3. 1 मिलीलीटर ट्यूबों में अशेष intracellular समाधान और फ्रीज -20 डिग्री सेल्सियस पर। प्रति दिन एक विभाज्य का प्रयोग करें और प्रयोगों के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
    2. पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग
      1. एक विसर्जन कक्ष में स्लाइस रखें और उन्हें (1.5 मिलीग्राम / मिनट) ऑक्सीजन के साथ छिड़कना(95% हे 2 - 5% सीओ 2) निम्नलिखित रिसेप्टर विरोधी युक्त aCSF: चयनात्मक NMDA रिसेप्टर प्रतिपक्षी 2 अमीनो-5-phosphonovaleric एसिड (APV, 40 माइक्रोन) के, प्रतिस्पर्धी AMPA / Kainate ग्लूटामेट रिसेप्टर प्रतिपक्षी 6-cyano-7- nitroquinoxaline-2,3-Dione (CNQX, 10μM), ग्लाइसिन रिसेप्टर प्रतिपक्षी बच्छनाग (एसटीआर, 10 माइक्रोन) के विशिष्ट गाबा एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी gabazine (GBZ, 10 माइक्रोन) के, और सोडियम चैनल अवरोधक tetrodotoxin (TTX, 3μM)
        नोट: परिणाम और आंकड़े में, इन विरोधी सामूहिक रूप से synaptic ब्लॉकर्स या एसबीएस करने के लिए भेजा जाता है।
      2. रिकॉर्डिंग पैच pipettes भरें; intracellular उच्च + K समाधान के साथ एक साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पैच-पिपेट fillers का उपयोग कर (प्रतिरोध 2-7 MΩ नियमित रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोटी दीवार borosilicate ग्लास 1.0 मिमी बाहरी व्यास और 0.6 मिमी भीतरी व्यास की केशिकाओं से बना) समाधान फिल्टर। अपने एम्पलीफायर के धारक में पिपेट डालें। एक छोटी सी स्थिति लागू करेंitive दबाव 1 मिलीलीटर एक तीन तरह वाल्व से जुड़े एक सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग पिपेट धारक से जुड़े सिरिंज का उपयोग। एक पैच दबाना एम्पलीफायर को पिपेट धारक के पीछे कनेक्ट करें।
      3. लगभग अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत प्रकाशिकी के लिए संयुक्त एक 4X उद्देश्य का उपयोग PPN नाभिक के पास एक यांत्रिक micromanipulator का उपयोग रिकॉर्डिंग पिपेट ले जाएँ।
        नोट: PPN नाभिक बेहतर अनुमस्तिष्कीय डंठल को स्लाइस पृष्ठीय में मनाया जा सकता है (एससीपी, एक्सोन की एक मोटी बंडल के रूप में नमूदार)। रिकॉर्डिंग pipettes PPN में स्थित थे कॉम्पेक्टा, जो तुरंत स्थित है डंठल के पीछे के अंत करने के लिए पृष्ठीय pars।
      4. जबकि एक 40X पानी विसर्जन लेंस का उपयोग कर कल्पना की एक PPN न्यूरॉन के साथ संपर्क में रिकॉर्डिंग पिपेट ले आओ, और तेजी से सेल के साथ एक सील फार्म नकारात्मक सक्शन लागू होते हैं।
      5. निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर नकारात्मक सक्शन दौरान पिपेट प्रतिरोध की निगरानी के लिए वोल्टेज दबाना मुहर सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
        1. जब नकारात्मक रोंuction धीरे-धीरे बढ़ जाती है और पिपेट की नोक पर पैच दबाना मॉनिटर द्वारा पढ़ने प्रतिरोध मूल्यों में 80 तक पहुंच -, 100 MOhm तेजी से एम वी -50 और नकारात्मक दबाव जारी करने के लिए होल्डिंग क्षमता बदल जाते हैं। लगातार फटने न्यूरॉन की झिल्ली और बिजली के उपयोग पूरे सेल विन्यास में हासिल की है, जब तक नकारात्मक चूषण लागू करने की शुरुआत करें।
        2. अगर वोल्टेज दबाना मुहर सॉफ्टवेयर द्वारा मापा उपयोग प्रतिरोध मूल्यों में 10 MOhm या अधिक कर रहे हैं, तो छोटी मात्रा में नकारात्मक सक्शन को लागू करने के लिए जारी है।
      6. समाई क्षतिपूर्ति वोल्टेज दबाना मोड में और श्रृंखला प्रतिरोध (यानी, धीमी गति से और तेजी से यात्रियों सेल की झिल्ली फटने के बाद मनाया)। वर्तमान दबाना करने के लिए रिकॉर्डिंग मोड स्विच, और तेजी से पुल मूल्यों क्षतिपूर्ति (जैसे, एम्पलीफायर घुंडी ले जाएँ या कंप्यूटर का माउस का उपयोग कर स्वत: मुआवजा मेनू पर क्लिक करें)।
        1. PPN न्यूरॉन की लगातार निगरानी आराम कर झिल्ली क्षमता यू दर्ज की जा रहीनिर्माता प्रोटोकॉल गाते हैं। अगर depolarizing या hyperpolarizing मूल्यों के प्रति झिल्ली क्षमता पारी आराम कर रहा है, तो प्रत्यक्ष वर्तमान की (100 पीए तक) थोड़ी मात्रा का उपयोग इष्टतम -50 एम वी अंतिम मूल्य रखने के लिए।
          नोट: -48 एम वी के एक स्थिर आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) या अधिक hyperpolarized (यानी, आरएमपी <-48 एम वी) के साथ ही PPN न्यूरॉन्स रखें।

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Representative Results

प्रारंभ में, गामा दोलनों वर्ग वर्तमान दालों का उपयोग कर पैदा कर रहे थे। Synaptic ब्लॉकर्स और TTX की उपस्थिति में PPN न्यूरॉन्स की वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग लगातार विश्वास दिलाता हूं कि आराम झिल्ली संभावित ~ -50 एम वी (चित्रा 1 ए) पर स्थिर रखा गया था नजर रखी थी। दो लंबे दूसरा वर्ग वर्तमान दालों रिकॉर्डिंग पिपेट के माध्यम से पैच दबाना एम्पलीफायर द्वारा intracellularly इंजेक्शन थे, 200 PA से 600 फिलीस्तीनी अथॉरिटी (चित्रा 1 ए) के लिए उनके आयाम बढ़ रही है। झिल्ली क्षमता -20 एम वी के करीब वोल्टेज के स्तर को depolarized गया था जब 600 फिलीस्तीनी अथॉरिटी, छोटे आयाम गामा दोलनों में जिसके परिणामस्वरूप। गामा दोलनों की शक्तियों स्पेक्ट्रा बहुत छोटे आयाम मूल्यों प्रस्तुत (यानी, <0.01, चित्रा 1 बी)। दूसरी ओर, दो दूसरी depolarizing वर्तमान रैंप रिकॉर्डिंग पिपेट के माध्यम से पैच दबाना एम्पलीफायर द्वारा intracellularly इंजेक्ट किया गया था, मजबूत गामा दोलनों पैदा(2A चित्रा) है कि बहुत अधिक शक्ति आयाम प्रस्तुत (चित्रा 2 बी)।

पिछला काम 10 वर्ग के बीच मतभेद जुड़ा हुआ है और पूर्व की अचानक विध्रुवण के दौरान वोल्टेज gated पोटेशियम चैनलों की स्ट्रिंग सक्रियण के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल रैंप गया है। धीरे depolarizing रैंप बजाय पोटेशियम चैनलों निष्क्रिय किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. झिल्ली दोलन पूरे सेल में आयाम बढ़ाने के मौजूदा वर्ग दालों का उपयोग PPN न्यूरॉन्स दर्ज की गई। बढ़ती आयाम रिकॉर्डिंग पिपेट के माध्यम से पैच दबाना एम्पलीफायर द्वारा intracellularly इंजेक्शन के 2 सेकंड लंबा वर्ग कदम depolarizing, synaptic ब्लॉकर्स और TTX की उपस्थिति में करने के लिए (ए) प्रतिनिधि झिल्ली क्षमता के हिमायती हैं। (बी) ओवरलैपिंग60 हर्ट्ज bandpass छानने depolarizing कदम से उत्पन्न दोलनों - ए पावर स्पेक्ट्रा में दिखाया वर्ग दालों का उपयोग कर प्राप्त दोलनों के लिए बिजली स्पेक्ट्रा आयाम 20 के बाद एक हैमिंग खिड़की समारोह का उपयोग कर प्राप्त किया गया। PPN न्यूरॉन वर्तमान दबाना विन्यास में दर्ज किया गया था उच्च + K intracellular समाधान और synaptic ब्लॉकर्स + TTX प्रोटोकॉल में वर्णित के संयोजन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. गामा बैंड झिल्ली पूरे सेल में दोलन बढ़ाने आयाम की वर्तमान रैंप का उपयोग कर PPN न्यूरॉन्स दर्ज की गई। Intracellularly रिकॉर्डिंग पिपेट, इस शो के माध्यम से 2 सेकंड लंबा रैंप पैच दबाना एम्पलीफायर द्वारा इंजेक्शन depolarizing करने के लिए (ए) प्रतिनिधि झिल्ली क्षमता की प्रतिक्रियाएं। 60 हर्ट्ज bandpass छानने दोलनों depolarizing रैंप द्वारा उत्पन्न - आईएनजी synaptic ब्लॉकर्स और TTX की उपस्थिति में आयाम में वृद्धि (बी) ए पावर स्पेक्ट्रा में दिखाया रैंप का उपयोग कर प्राप्त दोलनों के लिए बिजली स्पेक्ट्रा आयाम ओवरलैपिंग के बाद 20 एक हैमिंग खिड़की समारोह का उपयोग कर प्राप्त किया गया । PPN न्यूरॉन वर्तमान दबाना विन्यास में दर्ज किया गया था उच्च + K intracellular समाधान और synaptic ब्लॉकर्स + TTX प्रोटोकॉल में वर्णित के संयोजन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

PPN न्यूरॉन्स आंतरिक गुणों है कि उन्हें जानवरों है कि जाग या रेम नींद के दौरान, लेकिन धीमी गति से लहर नींद 2,3,5,13-17 के दौरान नहीं कर रहे हैं से इन विवो रिकॉर्डिंग के दौरान बीटा / गामा बैंड आवृत्तियों पर कार्रवाई क्षमता आग करने की अनुमति है। अन्य लेखकों अधिक पूर्वकाल के स्तर पर है कि मस्तिष्क लेनदेनों से पता चला है की तुलना में PPN ईईजी रिकॉर्डिंग के दौरान गामा आवृत्तियों कम हो। हालांकि, जब मस्तिष्क घावों जहां इस नाभिक स्थित है के लिए पीछे, PPN के प्रत्यक्ष उत्तेजना cortical गामा गतिविधि की अभिव्यक्ति ईईजी 2,3,5,18-21 पर अनुमति दी। गामा बैंड तंत्रिका गतिविधि इन विट्रो 22 में माउस PPN की रिपोर्ट में किया गया है, चूहे रेम नींद प्रेरण क्षेत्र (PPN परियोजनाओं 23 जो करने के लिए) में, विवो 3 में बिल्ली में, प्राइमेट में PPN क्षेत्र में जब 24 locomoting, और 25 घुसने के दौरान मानव में PPN के क्षेत्र में। यही कारण है कि गामा बैंड गतिविधि मैं के लिए पर्याप्त सबूत नहीं है, हैn प्रजातियों भर PPN।

इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत सभी प्रकार के 10 चूहे PPN सेल में उपस्थित गामा दोलनों के विवरण की अनुमति दी। प्रकार मैं, द्वितीय, या तृतीय, या ट्रांसमीटर: वास्तव में, आंतरिक तंत्र अंतर्निहित गामा दोलनों पिछले खेतों में वर्गीकरण या synaptic ट्रांसमीटर प्रकार की परवाह किए बिना हर PPN न्यूरॉन में मौजूद (PPN आसपास की कोशिकाओं है कि संपत्ति का हिस्सा नहीं है, जबकि), होना करने के लिए वर्णित किया गया प्रकार, कोलीनर्जिक, ग्लूटामेटरगिक या GABAergic ही गामा-बैंड संपत्ति 10 पैदा करने का हिस्सा है। वर्तमान रैंप का उपयोग प्रयोग के दौरान आराम कर झिल्ली क्षमता की सतत निगरानी, ​​और स्थायी पुल मुआवजे की आवश्यकता की सीमा है। कुछ मामलों में, रैंप 1 सेकंड से भी कम है, जबकि 5 सेकंड के लिए या अब रैंप durations झिल्ली प्रतिरोध परिवर्तन है कि प्रयोग के दौरान uncompensated रहेगा में हुई पूरी तरह से नहीं करने के लिए मनाया, वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल सक्रिय थे। मामले में nओ गामा दोलनों मनाया गया, रैंप अवधि में छोटे समायोजन गामा बैंड दोलन आयाम में वृद्धि कर सकता है।

विशिष्ट विषाक्त पदार्थों को हम वर्णन किया है कि PPN कोशिकाओं (~ 50%) अवरुद्ध एन और पी / क्यू प्रकार का एक महत्वपूर्ण अनुपात में साथ वर्तमान रैंप depolarizing संयोजन (दोनों का उपयोग कर ω-CgTx और ω-आगा) चैनलों कैल्शियम चैनल को कम गामा दोलन आयाम है, जो हमें उन्हें पी / क्यू और एन प्रकार की कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत करने के लिए अनुमति देते हैं। अन्य कोशिकाओं (20%) में, गामा दोलनों केवल ω-आगा से प्रभावित थे, सुझाव है कि इन कोशिकाओं केवल पी / क्यू प्रकार चैनलों व्यक्त किया। कोशिकाओं (30%) केवल के बाकी हिस्सों में ω-CgTx उन्हें अवरुद्ध है, सुझाव है इन PPN न्यूरॉन्स केवल एन-प्रकार चैनलों था। इन परिणामों के PPN में कोशिकाओं है कि अलग अलग वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल 26,27 की अभिव्यक्ति के माध्यम से गामा बैंड दोलनों प्रकट की उपस्थिति की पुष्टि की। इस नए प्रोटोकॉल भी एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि एक नए PPN सेल typ की शुरूआत की अनुमति दी माना जा सकता हैक्षेत्र के लिए ई वर्गीकरण। वास्तव में, यह सुझाव दिया गया है केवल जागने के दौरान कहा कि एन-प्रकार केवल PPN न्यूरॉन्स REM नींद ( "रेम-ऑन"), पी / क्यू प्रकार के दौरान केवल आग ( "जागो पर"), या एन-प्रकार + P / दोनों जागने और रेम नींद ( "जागो / रेम-ऑन") 26,27 के दौरान क्यू प्रकार। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में oscillatory गतिविधि का वर्णन करने के लिए और उन्हें ट्रिगर आंतरिक गुणों को प्रदर्शित करने के लिए भविष्य प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma-Aldrich S8501 C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6014 NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911 KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma-Aldrich M9272 MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich C3881 CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A5960 C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride Acros Organics 327300025 NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate Sigma-Aldrich G4500 C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt Sigma-Aldrich P1937 C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES Sigma-Aldrich H3375 C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA Sigma-Aldrich E0396 [-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma-Aldrich A9187  C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate Alomone Labs T-550 C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
 DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid Sigma-Aldrich A5282  C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate  Sigma-Aldrich C239 C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine Sigma-Aldrich S0532 C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride Sigma-Aldrich M9020  C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531) Sigma-Aldrich S106 C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride Mylan 67457-001-00
Microscope Nikon Eclipse E600FN
Micromanipulator Sutter Instruments ROE-200
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-200
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
A/D converter Molecular Devices Digidata 1440A
Heater Warner Instruments TC-324B
Pump Cole-Parmer Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge Cole-Parmer Masterflex 7519-85
Pipette puller Sutter Instruments P-97
Camera Q-Imaging RET-200R-F-M-12-C
Vibratome Leica Biosystems  Leica VT1200 S
Refrigeration system Vibratome Instruments 900R
Equipment
microscope Nikon Eclipse E600FN
micromanipulator Sutter Instruments ROE-200
micromanipulator Sutter Instruments MPC-200
amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
A/D converter Molecular Devices Digidata 1440A
heater Warner Instruments TC-324B
pump Cole-Parmer Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge Cole-Parmer Masterflex 7519-85
pipette puller Sutter Instruments P-97
camera Q-Imaging RET-200R-F-M-12-C

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References

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Pedunculopontine नाभिक न्यूरॉन्स में रिकॉर्डिंग गामा बैंड दोलन
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Urbano, F. J., Luster, B. R., D'Onofrio, S., Mahaffey, S., Garcia-Rill, E. Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons. J. Vis. Exp. (115), e54685, doi:10.3791/54685 (2016).

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