Summary
يقع نواة pedunculopontine (PPN) في الدماغ ويتم تنشيط الخلايا العصبية في الحد الأقصى أثناء اليقظة وحركة العين السريعة (REM) النوم الدماغ الدول. يصف هذا العمل المنهج التجريبي لتسجيل في المختبر الفرقة جاما التذبذب غشاء دون العتبي في الخلايا العصبية PPN.
Abstract
ومن المعروف efferents متشابك من PPN لتعديل نشاط الخلايا العصبية من عدة مناطق مهادي داخل الصفيحة (على سبيل المثال، centrolateral / parafascicular، الكلور / الجبهة الوطنية النواة). وقد وصفت تفعيل إما PPN أو نوى الكلورين / الجبهة الوطنية في الجسم الحي للحث على الإثارة من الحيوان وزيادة في النشاط الفرقة جاما في الكهربائي القشري (EEG). الآليات الخلوية لتوليد اهتزازات الفرقة جاما في نظام شبكي تفعيل (RAS) الخلايا العصبية هي نفس تلك التي وجدت لتوليد اهتزازات الفرقة جاما في نوى العقول الأخرى. خلال تسجيلات المشبك الحالي من الخلايا العصبية PPN (من شرائح سهمي من 9 - الفئران من العمر اليوم 25)، واستخدام depolarizing الخطوات مربع تفعيل بسرعة قنوات البوتاسيوم التي تعتمد على الجهد الذي يمنع الخلايا العصبية PPN من يتم استقطابها وراء -25 بالسيارات.
حقن 1-2 ثانية depolarizing طويلة سلالم الحالية استقطابها تدريجيا PPN غشاء الدقة المحتملةتقدر تينغ باتجاه 0 بالسيارات. ومع ذلك، ولدت عن طريق الحقن depolarizing البقول مربع التذبذبات غاما عصابة من غشاء المحتملة التي أظهرت أن تكون أصغر في السعة مقارنة مع التذبذبات التي تم إنشاؤها بواسطة سلالم. أجريت جميع التجارب في وجود قنوات الصوديوم الجهد بوابات وسريعة مستقبلات متشابك حاصرات. ولقد ثبت أن تفعيل قنوات الكالسيوم التي تعتمد على الجهد العالي عتبة تكمن وراء جاما الموجات النشاط متذبذبة في الخلايا العصبية PPN. وصفت التدخلات المنهجية والدوائية محددة هنا، وتوفير الأدوات اللازمة للحث والحفاظ PPN دون العتبي التذبذب الفرقة جاما في المختبر.
Introduction
وتشريحيا وشملت PPN نواة في سقيفة الدماغ المتوسط الذيلية. وPPN هو عنصر أساسي من RAS 1. تشارك PPN في صيانة دول تنشيط السلوكية (أي الاستيقاظ والنوم REM) 2. التحفيز الكهربائي للPPN في الجسم الحي يتسبب التذبذب السريع (20 - 40 هرتز) في EEG القشرية 3، في حين الآفات PPN الثنائية في الفئران خفض أو القضاء REM النوم 4. في حين أن الغالبية العظمى من الخلايا العصبية PPN النار إمكانات العمل في تردد بيتا / غاما النطاق (20-80 هرتز)، وبعض الخلايا العصبية قدمت انخفاض معدلات اطلاق النار التلقائي (<10 هرتز) 5. وعلاوة على ذلك، يبدو أن PPN أن تشارك في جوانب أخرى من السلوك مثل الحافز والاهتمام 6. ارتفاع وتيرة المباشر (40 - 60 هرتز) 7 التحفيز الكهربائي للPPN نواة في الحيوانات فصل الدماغ يمكن أن تعزز الحركة. في السنوات الأخيرة، وقد تم استخدام التحفيز العميق للدماغ (DBS) من PPN لعلاج المرضى الذين يعانون جيئة وذهابااضطرابات م التي تنطوي على العجز المشية مثل مرض باركنسون (PD) 8.
وأظهرت تقارير سابقة أن ما يقرب من جميع الخلايا العصبية PPN يمكن اطلاق النار إمكانات العمل في نطاق التردد جاما عندما استقطابها باستخدام النبضات الحالية مربع 9. بسبب تفعيل جذري للقنوات البوتاسيوم الجهد مسور خلال النبضات اللاإستقطابات depolarizations مربع تصل إلى أو تحت -25 بالسيارات. ونتيجة لذلك، لم يلاحظ أي اهتزازات جاما قوية بعد منع توليد إمكانات العمل باستخدام سم الأسماك الرباعية الأسنان 10. في محاولة لتجاوز هذه المشكلة، 1 - استخدمت 2 ثانية depolarizing طويلة سلالم الحالية. استقطابها سلالم تدريجيا غشاء المحتملة من الراحة القيم يصل إلى 0 بالسيارات، بينما تعطيل جزئيا قنوات البوتاسيوم الجهد مسور. كانت واضحة التذبذبات غشاء الفرقة جاما واضحة ضمن إطار الاعتماد الجهد قنوات الكالسيوم عالية العتبة (أي بين -25 بالسيارات و-0 بالسيارات) 10. وفي الختام، والفرقة جاما activiوقد لوحظ تاي في الخلايا العصبية PPN 9، وكلا P / ** ووN-نوع قنوات الكالسيوم الجهد بوابات تحتاج إلى تنشيط من أجل توليد ذبذبات الموجات جاما في PPN 10.
سلسلة من الدراسات حددت موقع قنوات عالية من الكالسيوم في الخلايا العصبية عتبة PPN. حقن مزيج من الأصباغ، وأظهر ratiometric التصوير مضان العابرين الكالسيوم من خلال قنوات الكالسيوم الجهد بوابات التي يتم تفعيلها في التشعبات المختلفة عندما استقطابها باستخدام سلالم الحالي 11.
وقد اقترحت الخصائص الذاتية للخلايا العصبية PPN للسماح تفعيل المتزامن لهذه الخلايا أثناء اليقظة والنوم REM، مما يحفز عالية التردد متذبذبة نشاط الخلايا العصبية بين RAS والحلقات مهادية قشرية. ويعتبر هذا التفاعل الوصول إلى فترة طويلة لدعم دولة الدماغ قادرة على تقييم موثوق العالم من حولنا بشكل مستمر 12. هنا، نحن تصف التجربةالشروط آل اللازمة لتوليد والحفاظ جاما الفرقة التذبذب في الخلايا PPN في المختبر. لم يتم وصف هذا البروتوكول في وقت سابق، وسيساعد عددا من المجموعات لدراسة خصائص الغشاء الجوهرية التوسط النشاط الفرقة غاما في مناطق أخرى من الدماغ. وعلاوة على ذلك، قد تؤدي الخطوات الحالية إلى الاستنتاج الخاطئ بأن نشاط الفرقة غاما لا يمكن أن تتولد في هذه الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع البروتوكولات التجريبية لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة أركنساس للعلوم الطبية (رقم بروتوكول # 3593) وكان في اتفاق مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. إعداد السائل النخاعي ستاندرد الاصطناعي (ACSF)
- إعداد محلول المخزون ل
- إضافة 700 مل من الماء المقطر لتنظيف الدورق 1 لتر قبل إضافة المواد الكيميائية.
- مع التحريك المستمر لحجم 500 مل، إضافة 136،75 غرام من كلوريد الصوديوم، 6.99 غرام من بوكل، 2.89 غرام من MgSO 4، و2.83 غرام من ناه 2 ص 4.
- إضافة الماء المقطر أكثر للوصول إلى الحجم النهائي من 1 L. بعد التخفيف، وتركيز النهائي لكل مركب هو 117 مم كلوريد الصوديوم، 4.69 ملي بوكل، MgSO 1.2 ملي 4، و1.18 ملي ناه 2 ص 4.
- يحفظ في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- إعداد محلول المخزون B
- إضافة 700 مل من الماء المقطر إلى دورق 1L نظيفة قبل إضافة مواد كيميائية.
- مع التحريك المستمر لحجم 500 مل، إضافة 41.45 غرام من مد الجلوكوز و41.84 غرام من NaHCO 3.
- إضافة الماء المقطر أكثر للوصول إلى الحجم النهائي من 1 L. بعد التخفيف، وتركيز النهائي لكل المركب 11.5 ملي مد الجلوكوز و 24.9 ملم NaHCO 3.
- يحفظ في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- قبل كل مزيج تجربة 50 مل من الأسهم ومع 50 مل الأسهم باء ويرتفع الى 1 لتر بالماء المقطر للحصول على النهائي حل تركيز ACSF وترك في RT بينما بالاكسجين بشكل مستمر مع كربوجين (95٪ O 2-5٪ CO 2 مزيج) لمدة 30 دقيقة على الأقل. إعداد ACSF التركيز النهائي فقط في بداية كل تجربة وتجاهل في نهاية اليوم.
2. إعداد السائل النخاعي السكروز الاصطناعي(السكروز-ACSF)
- إعداد محلول المخزون C
- إضافة 700 مل من الماء المقطر لتنظيف الدورق 1 لتر قبل إضافة المواد الكيميائية.
- مع التحريك المستمر 500 مل من الماء المقطر، إضافة 240 غرام من السكروز، 6.55 غرام من NaHCO 3، 0.671 غرام من بوكل، 4.88 غرام من MgCl 2، 0.22 غرام من CaCl 2 و 0.21 غرام من حامض الاسكوربيك.
- إضافة الماء المقطر أكثر للوصول إلى الحجم النهائي من 1 L. بعد التخفيف، وتركيز النهائي لكل مركب هو 701.1 ملم السكروز، 78 مم NaHCO 3، 9 ملي بوكل، 24 ملي MgCl 2، 1.5 ملي CaCl 2 و 1.2 ملي حمض الاسكوربيك .
- الحفاظ على المخزون حل C في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
- قبل كل مزيج التجربة 300 مل من 50 مل من الأسهم C مع 600 مل من الماء المقطر للحصول على حل السكروز-ACSF في التركيز النهائي وترك في RT بينما بالاكسجين بشكل مستمر مع كربوجين (95٪ O 2-5٪ CO 2 مزيج) لمدة 30 دقيقة على الأقل.
3. إعداد شريحة
- وضع كوب نظيف مع 100 مل محلول السكروز-ACSF في الجليد بينما بالاكسجين مع كربوجين وتحديد درجة الحموضة 7.4 باستخدام مقياس درجة الحموضة مع إضافة بضع قطرات من 0.1 حل M هيدروكسيد الصوديوم (عند درجة الحموضة <7.4) أو 0.1 حل M حمض الهيدروكلوريك (عندما الرقم الهيدروجيني> 7.4).
- تملأ غرفة قطع من vibratome مع السكروز-ACSF والأوكسجين ذلك. تشغيل نظام التبريد القائم على الجلسرين بالإضافة إلى غرفة القطع وانتظر 15 دقيقة للسماح ليبرد إلى 0-4 درجة مئوية.
- تخدير الفئران الوليدة (الذين تتراوح أعمارهم بين 9 إلى 12 من البالغين توقيت الحوامل الفئران سبراغ داولي) مع الكيتامين (70 ملغ / كلغ، والملكية الفكرية، واستخدام <50 ميكرولتر الحجم النهائي). عندما الجرو هو الهدوء، انقر نقرا تأكد من أن رد الفعل قرصة الذيل غائب.
- قطع رأس الجراء.
- قطع جلد الرأس طوليا من الأمام إلى الخلف باستخدام مشرط شفرة الفولاذ الكربوني، وسحب الجلد إلى الجانبين باستخدام ملقط. قطع العظام التي تغطي الدماغ تحريك الشوريissors أفقيا وإزالته تماما لفضح الدماغ.
- ثم، وإزالة بسرعة الدماغ باستخدام ملعقة (وضعت في البداية تحت البصلة الشمية من أجل دفع برفق الدماغ من أكثر منقاري نحو المناطق الأكثر الذيلية). دفع بلطف الدماغ إلى الاوكسيجين السائل النخاعي السكروز الاصطناعي تبريد الجليد (السكروز-ACSF).
- اجراء خفض مجاور للسهمي على النصف الأيمن (إزالة ما يقرب من ثلث نصف الكرة الأرضية)، والغراء الجانب قلص من الدماغ على قرص معدني من شأنها أن تكون ثابتة مغناطيسيا إلى غرفة قطع من vibroslicer لخفض السهمي 400 ميكرون أقسام تحتوي على نواة pedunculopontine (PPN). حافظ على شرائح PPN في RT لمدة 45 دقيقة قبل خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك.
4. التذبذبات تسجيلات غاما النطاق في PPN شرائح
- إعداد البوتاسيوم غلوكونات الحل داخل الخلايا (عالية-K + الحل)
- ضع فيالجليد كوب نظيف مع 10 مل من الماء المقطر. مع التحريك المستمر إضافة: K + -gluconate، 90.68 ملغم فسفوكرياتين دي تريس الملح، 47.66 HEPES ملغ، 1.5 ملغ EGTA، 40.58 ملغ المغنيسيوم 2+ -ATP، و 4 ملغم الصوديوم + 2 -GTP.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع KOH (100 ملي من الماء المقطر). إضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم النهائي من 20 مل. إذا لزم الأمر، وضبط الأسمولية مع السكروز (100 ملي من الماء المقطر) ليكون 280-290 ملي أوزمول. بعد التخفيف، وتركيز النهائي لكل مركب هو 124 ملي K + -gluconate، 10 ملي فسفوكرياتين دي تريس الملح، و 10 ملي HEPES، 0.2 ملي EGTA، 4 مم المغنيسيوم 2+ -ATP، و 0.3 ملي نا + 2 -GTP.
- حلول قسامة داخل الخلايا في 1 مل الأنابيب وتجميد في -20 درجة مئوية. استخدام قسامة واحدة يوميا، والحفاظ على 4 درجات مئوية خلال التجارب.
- خلية كاملة التصحيح تسجيلات المشبك
- وضع شرائح في غرفة الغمر ويروي لهم (1.5 مل / دقيقة) مع المؤكسد(95٪ O 2-5٪ CO 2) ACSF تحتوي على مستقبلات التالية: انتقائية NMDA مستقبلات حمض 2-أمينو-5-phosphonovaleric (APV، 40 ميكرومتر)، قادرة على المنافسة أمبا / Kainate مستقبلات الغلوتامات خصم 6 cyano-7- nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX، 10μM)، الجلايسين مستقبلات الإستركنين (STR، 10 ميكرومتر)، وGABA محددة لمستقبلات gabazine (GBZ، 10 ميكرومتر)، والصوديوم قناة مانع سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 3μM)
ملاحظة: في النتائج والأرقام، ويشار إلى هذه الخصوم جماعي لحاصرات كما متشابك أو الفرعيتين. - ملء ماصات تسجيل التصحيح (المقاومة 2-7 MΩ وجعل من، المتاحة تجاريا الشعيرات الدموية العادية سميكة الجدار البورسليكات الزجاج من القطر الخارجي 1.0 ملم و 0.6 ملم القطر الداخلي) مع الحل الخلايا عالية K + باستخدام المتاحة تجاريا الحشو التصحيح، ماصة مع حل التصفية. إدراج ماصة في حامل مكبر للصوت الخاصة به. تطبيق نقاط البيع الصغيرةضغط مبنيا على إيجابية باستخدام حقنة 1 مل متصلا حامل ماصة باستخدام أنبوب السيليكون متصلة ثلاثية صمام. ربط الجزء الخلفي من حامل ماصة للمكبر للصوت المشبك التصحيح.
- نقل ماصة تسجيل باستخدام micromanipulator الميكانيكية قرب النواة PPN باستخدام الهدف 4X مجتمعة إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة تدخل الفرق النقيض البصريات.
ملاحظة: PPN نواة يمكن ملاحظتها في شرائح ظهري إلى السويقة المخيخية العلوية (SCP، يمكن ملاحظتها كحزمة واحدة سميكة من محاور عصبية). وتقع الماصات تسجيل في PPN بارس المكتنزة، والذي يقع مباشرة الظهرية إلى نهاية الخلفية للساق. - جلب ماصة تسجيل في اتصال مع الخلايا العصبية PPN بينما تصور باستخدام عدسة الغمر 40X المياه، وتطبيق بسرعة شفط سلبي على شكل خاتم مع الخلية.
- استخدام الجهد المشبك البرمجيات ختم لمراقبة المقاومة ماصة أثناء شفط سلبي باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة.
- عندما الصورة السلبيةيتم زيادة uction ببطء والقيم مقاومة قراءة بواسطة جهاز العرض التصحيح، المشبك على طرف ماصة تصل إلى 80-100 MOHM، بسرعة تغيير إمكانية عقد ل-50 بالسيارات والافراج عن الضغط السلبي. بدء تطبيق باستمرار شفط سلبي حتى تمزق غشاء يتحقق والكهربائية وصول الخلايا العصبية في تكوين خلية كاملة.
- إذا قيم المقاومة وصول تقاس بواسطة برنامج ختم الجهد المشبك هي 10 MOHM أو أعلى، ثم مواصلة تطبيق شفط سلبي في كميات صغيرة.
- تعويض السعة (أي، لاحظ العابرين بطيء وسريع بعد تمزق غشاء الخلية) وسلسلة المقاومة في وضع الجهد المشبك. تبديل طريقة لتسجيل المشبك الحالي، وبسرعة تعويض القيم جسر (على سبيل المثال، نقل مكبر للصوت مقبض الباب أو انقر على قائمة التعويض التلقائي باستخدام الماوس جهاز الكمبيوتر؟).
- رصد مستمر يستريح غشاء المحتملة من PPN الخلايا العصبية التي سجلت شالغناء بروتوكول الشركة الصانعة. إذا يستريح غشاء تحول محتمل نحو depolarizing أو hyperpolarizing القيم، ثم استخدام كميات صغيرة من التيار المباشر (ما يصل إلى 100 سنويا) للحفاظ على بالسيارات القيمة النهائية المثلى -50.
ملاحظة: حافظ على الخلايا العصبية PPN الوحيدة مع مستقرة إمكانات غشاء يستريح (RMP) من -48 بالسيارات أو أكثر hyperpolarized (أي RMP <-48 بالسيارات).
- رصد مستمر يستريح غشاء المحتملة من PPN الخلايا العصبية التي سجلت شالغناء بروتوكول الشركة الصانعة. إذا يستريح غشاء تحول محتمل نحو depolarizing أو hyperpolarizing القيم، ثم استخدام كميات صغيرة من التيار المباشر (ما يصل إلى 100 سنويا) للحفاظ على بالسيارات القيمة النهائية المثلى -50.
- وضع شرائح في غرفة الغمر ويروي لهم (1.5 مل / دقيقة) مع المؤكسد(95٪ O 2-5٪ CO 2) ACSF تحتوي على مستقبلات التالية: انتقائية NMDA مستقبلات حمض 2-أمينو-5-phosphonovaleric (APV، 40 ميكرومتر)، قادرة على المنافسة أمبا / Kainate مستقبلات الغلوتامات خصم 6 cyano-7- nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX، 10μM)، الجلايسين مستقبلات الإستركنين (STR، 10 ميكرومتر)، وGABA محددة لمستقبلات gabazine (GBZ، 10 ميكرومتر)، والصوديوم قناة مانع سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 3μM)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في البداية، كان أثار التذبذبات جاما باستخدام النبضات الحالية مربع. تم رصد تسجيل المشبك الحالي من الخلايا العصبية PPN بحضور حاصرات متشابك وTTX بشكل مستمر للتأكد من أن يستريح غشاء المحتملة أبقى مستقرا عند ~ -50 بالسيارات (الشكل 1A). تم حقن اثنين من البقول الحالية مربع طويلة الثانية داخل الخلية بواسطة مكبر للصوت المشبك التصحيح من خلال ماصة تسجيل، وزيادة السعة الخاصة بهم من 200 إلى 600 السلطة الفلسطينية السلطة الفلسطينية (الشكل 1A). تم استقطابها غشاء المحتملة إلى مستويات الجهد أقرب إلى -20 بالسيارات عند 600 السلطة الفلسطينية، مما أدى صغيرة التذبذبات السعة جاما. عرض القوى أطياف التذبذبات غاما القيم السعة صغيرة جدا (أي، <0.01، الشكل 1B). من ناحية أخرى، تم حقن اثنين سلالم الحالية depolarizing الثاني داخل الخلية بواسطة مكبر للصوت المشبك التصحيح من خلال ماصة تسجيل، وتوليد ذبذبات جاما قوية(الشكل 2A) التي قدمت سعة طاقة أعلى من ذلك بكثير (الشكل 2B).
العمل السابق 10 ربطت الخلافات بين الساحة ومنحدر البروتوكولات الحالية في تفعيل سلسلة من قنوات البوتاسيوم الجهد مسور خلال الاستقطاب مفاجئ من السابق. سلالم depolarizing بطيئة بدلا من ذلك قد يتم تعطيل قنوات البوتاسيوم.
الشكل 1. غشاء التذبذبات في كامل الخلية سجلت PPN الخلايا العصبية باستخدام ساحة الحالي البقول من زيادة السعة. الردود (A) الممثل غشاء المحتملة لdepolarizing 2 ثانية الخطوات مربع طويلة لزيادة السعة حقن داخل الخلية بواسطة مكبر للصوت المشبك التصحيح من خلال ماصة تسجيل، بحضور حاصرات متشابك وTTX. (ب) تداخلوقد تم الحصول على سعة أطياف الطاقة للالتذبذبات التي تم الحصول عليها باستخدام نبضات مربع هو مبين في A. الطاقة الأطياف باستخدام وظيفة نافذة المبالغة بعد 20-60 هرتز التذبذبات تصفية ممر الموجة الناتجة عن الخطوات depolarizing. وسجلت PPN الخلايا العصبية في تكوين المشبك الحالي الجمع بين ارتفاع K-+ حل داخل الخلايا وحاصرات متشابك + وصف TTX في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. غاما الفرقة غشاء التذبذبات في كامل الخلية المسجلة الخلايا العصبية PPN باستخدام سلالم الحالية لزيادة السعة. الردود (A) الممثل غشاء المحتملة لdepolarizing 2 ثانية سلالم طويلة حقنها بواسطة مكبر للصوت المشبك التصحيح داخل الخلية عن طريق تسجيل ماصة، وتظهر. جي زيادة السعة في وجود حاصرات متشابك وTTX (ب) تداخل سعة أطياف الطاقة للالتذبذبات التي تم الحصول عليها باستخدام سلالم هو مبين في A. الطاقة الأطياف تم الحصول عليها باستخدام وظيفة نافذة المبالغة بعد 20-60 هرتز التذبذبات تصفية ممر الموجة المتولدة عن منحدر depolarizing . وسجلت PPN الخلايا العصبية في تكوين المشبك الحالي الجمع بين ارتفاع K-+ حل داخل الخلايا وحاصرات متشابك + وصف TTX في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا العصبية PPN لها خصائص الجوهرية التي تسمح لهم لاطلاق النار إمكانات العمل على ترددات الموجات بيتا / غاما خلال في الجسم الحي تسجيلات من الحيوانات التي هي مستيقظا أو أثناء النوم REM، ولكن ليس أثناء بطيئة موجة النوم 2،3،5،13-17. وقد أظهر مؤلفين آخرين أن transections الدماغ في أكثر من مستويات الأمامي من PPN تخفيض الترددات جاما خلال تسجيلات EEG. ومع ذلك، عندما الخلفي آفات الدماغ إلى حيث يوجد هذه النواة، والتحفيز المباشر من PPN يسمح مظهر من مظاهر النشاط جاما القشرية على EEG 2،3،5،18-21. وقد أبلغ جاما الفرقة النشاط العصبي في الماوس PPN في المختبر 22، في الفئران REM منطقة النوم الاستقراء (الذي PPN مشاريع 23)، في القط في الجسم الحي 3، في منطقة PPN في المقدمات عندما locomoting 24، و في منطقة PPN في البشر خلال يخطو 25. وهذا هو، وهناك أدلة وافرة للنشاط الفرقة جاما طن PPN عبر الأنواع.
هذا البروتوكول التجريبي مفصلة هنا يسمح وصف التذبذبات جاما في جميع أنواع الفئران خلية PPN 10. في الواقع، وقد وصفت الآليات الجوهرية التذبذبات جاما الأساسية ليكون حاضرا في كل الخلايا العصبية PPN (في حين أن الخلايا في جميع أنحاء PPN لا يشاركهم هذا العقار)، بغض النظر عن التصنيفات المستخدمة السابقة أو متشابك نوع الارسال: النوع الأول والثاني، أو الثالث، أو الارسال نوع، الكوليني، glutamatergic أو GABAergic يشتركون في نفس جاما الفرقة توليد الملكية 10. استخدام سلالم الحالية لديه الحد من تتطلب المراقبة المستمرة ليستريح غشاء المحتملة، والتعويض جسر دائم في كافة مراحل التجربة. في بعض الحالات، لوحظ سلالم أقصر من 1 ثانية ليست واضحة تماما تنشيط قنوات الكالسيوم الجهد مسور، في حين مدد المنحدر من 5 ثانية أو لفترة أطول أسفرت التغييرات مقاومة الغشاء الذي سيبقى امعاوض أثناء التجربة. في حالة نس لوحظت التذبذبات غاما، تعديلات صغيرة في مدة منحدر يمكن أن يعزز الفرقة جاما سعة التذبذب.
الجمع بين depolarizing سلالم الحالية مع السموم محددة وصفناها أن في نسبة هامة من خلايا PPN (~ 50٪) حجب N-وP / Q-نوع (باستخدام كل ω-CgTx وω-الآغا) قنوات قنوات الكالسيوم خفض التذبذب جاما السعة، والتي تسمح لنا أن تصنف على أنها P / ** ووالخلايا N-نوع. في الخلايا الأخرى (20٪)، والتذبذبات جاما الوحيدة التي أصابها أوم-الآغا، مما يشير إلى أن هذه الخلايا أعربت قنوات فقط P / Q-نوع. في بقية الخلايا (30٪) فقط ω-CgTx بحظره، مما يشير إلى كان لهذه الخلايا العصبية PPN فقط قنوات N-نوع. وأكدت هذه النتائج وجود خلايا في PPN أن تظهر التذبذبات الفرقة جاما من خلال التعبير عن مختلف قنوات الكالسيوم الجهد بوابات 26،27. ويمكن أيضا أن يعتبر هذا البروتوكول الجديد أداة رئيسية أن يسمح إدخال خلية الطباع PPN جديدتصنيف البريد إلى الميدان. في الواقع، فقد قيل أن N-نوع فقط الخلايا العصبية PPN النار إلا أثناء النوم REM ( "REM على")، P / Q-نوع فقط أثناء اليقظة ( "استيقظوا على")، أو N-نوع + P / Q-النوع خلال كل من الاستيقاظ والنوم REM ( "ويك / REM على") 26،27. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول في التجارب المستقبلية لوصف النشاط متذبذبة في مناطق أخرى من الدماغ وإظهار الخصائص الجوهرية التسبب لهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | C12H22O11, molecular weight = 342.30 |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | NaHCO3, molecular weight = 84.01 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | KCl, molecular weight = 74.55 |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | MgCl2 · 6H2O, molecular weight = 203.30 |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | C6H12O6, molecular weight = 180.16 |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | C6H8O6, molecular weight =176.12 |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | NaCl, molecular weight = 58.44 |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | C6H11KO7, molecular weight = 234.25 |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma-Aldrich | P1937 | C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight = 453.38 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | [-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40 |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma-Aldrich | A9187 | C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18 |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18 |
| Tetrodotoxin citrate | Alomone Labs | T-550 | C11H17N3O8, molecular weight = 319.27 |
| DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid | Sigma-Aldrich | A5282 | C5H12NO5P, molecular weight = 197.13 |
| CNQX disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | C239 | C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12 |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | C21H22N2O2, molecular weight = 334.41 |
| Mecamylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M9020 | C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75 |
| Gabazine (SR-95531) | Sigma-Aldrich | S106 | C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23 |
| Ketamine hydrochloride | Mylan | 67457-001-00 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| Pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| Pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200 S | |
| Refrigeration system | Vibratome Instruments | 900R | |
| Equipment | |||
| microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C |
References
- Profice, P., et al. Neurophysiological evaluation of the pedunculopontine nucleus in humans. J. Neural. Transm (Vienna). 118 (10), 1423-1429 (2011).
- Steriade, M., Datta, S., Pare, D., Oakson, G., Curro Dossi, R. C. Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems. J. Neurosci. 10 (8), 2541-2559 (1990).
- Steriade, M., Dossi, R. C., Pare, D., Oakson, G. Fast oscillations (20-40 Hz) in thalamocortical systems and their potentiation by mesopontine cholinergic nuclei in the cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4396-4400 (1991).
- Deurveilher, S., Hennevin, E. Lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus reduce paradoxical sleep (PS) propensity: evidence from a short-term PS deprivation study in rats. Eur. J. Neurosci. 13 (10), 1963-1976 (2001).
- Steriade, M., Pare, D., Datta, S., Oakson, G., Curro Dossi, R. Different cellular types in mesopontine cholinergic nuclei related to ponto-geniculo-occipital waves. J. Neurosci. 10 (8), 2560-2579 (1990).
- Steckler, T., Inglis, W., Winn, P., Sahgal, A. The pedunculopontine tegmental nucleus: a role in cognitive processes? Brain Res. Brain Res. Rev. 19 (3), 298-318 (1994).
- Garcia-Rill, E., Simon, C., Smith, K., Kezunovic, N., Hyde, J. The pedunculopontine tegmental nucleus: from basic neuroscience to neurosurgical applications: arousal from slices to humans: implications for DBS. J. Neural. Transm. 118 (10), 1397-1407 (2011).
- Mazzone, P., et al. Implantation of human pedunculopontine nucleus: a safe and clinically relevant target in Parkinson's disease. Neuroreport. 16 (17), 1877-1881 (2005).
- Simon, C., et al. Gamma band unit activity and population responses in the pedunculopontine nucleus. J. Neurophysiol. 104 (1), 463-474 (2010).
- Kezunovic, N., Urbano, F. J., Simon, C., Hyde, J., Smith, K., Garcia-Rill, E. Mechanism behind gamma band activity in pedunculopontine nucleus (PPN). Eur. J. Neurosci. 34 (3), 404-415 (2011).
- Hyde, J. R., Kezunovic, N., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. Spatiotemporal properties of high speed calcium oscillations in the pedunculopontine nucleus. J. Appl. Physiol (1985). 115 (9), 1402-1414 (2013).
- Llinas, R. R., Leznik, E., Urbano, F. J. Temporal binding via cortical coincidence detection of specific and nonspecific thalamocortical inputs: a voltage-dependent dye-imaging study in mouse brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (1), 449-454 (2002).
- Boucetta, S., Cisse, Y., Mainville, L., Morales, M., Jones, B. E. Discharge profiles across the sleep-waking cycle of identified cholinergic, gabaergic, and glutamatergic neurons in the pontomesencephalic tegmentum of the rat. J. Neurosci. 34 (13), 4708-4727 (2014).
- Datta, S., Siwek, D. F. Single cell activity patterns of pedunculopontine tegmentum neurons across the sleep-wake cycle in the freely moving rats. J. Neurosci. Res. 70 (4), 79-82 (2002).
- Datta, S., Siwek, D. F., Stack, E. C. Identification of cholinergic and non-cholinergic neurons in the pons expressing phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein as a function of rapid eye movement sleep. Neuroscience. 163 (1), 397-414 (2009).
- Kayama, Y., Ohta, M., Jodo, E. Firing of 'possibly' cholinergic neurons in the rat laterodorsal tegmental nucleus during sleep and wakefulness. Brain Res. 569 (2), 210-220 (1992).
- Sakai, K., El Mansari, M., Jouvet, M. Inhibition by carbachol microinjections of presumptive cholinergic PGO-on neurons in freely moving cats. Brain Res. 527 (2), 213-223 (1990).
- Lindsley, D. B., Bowden, J. W., Magoun, H. W. Effect upon the EEG of acute injury to the brainstem activating system. Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 475-486 (1949).
- Moruzzi, G.
- Moruzzi, G., Magoun, H. W. Brain stem reticular formation and activation of the EEG. Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 455-473 (1949).
- Steriade, M., Constantinescu, E., Apostol, V. Correlations between alterations of the cortical transaminase activity and EEG patterns of sleep and wakefulness induced by brainstem transections. Brain Res. 13 (1), 177-180 (1969).
- Ishibashi, M., et al. Orexin receptor activation generates gamma band input to cholinergic and serotonergic arousal system neurons and drives an intrinsic Ca2+ -dependent resonance in LDT and PPT cholinergic neurons. Frontiers Neurol. 6, e120 (2015).
- Brown, R. E., Winston, S., Basheer, R., Thakkar, M. M., McCarley, R. W. Electrophysiological characterization of neurons in the dorsolateral pontine REM sleep induction zone of the rat: intrinsic membrane properties and responses to carbachol and orexins. Neuroscience. 143 (3), 739-755 (2006).
- Goetz, L., et al. On the role of the pedunculopontine nucleus and mesencephalic reticular formation in locomotion in non-human primates. J. Neurosci. 36 (18), 4917-4929 (2016).
- Fraix, V., et al. Pedunculopontine nucleus area oscillations during stance, stepping and freezing in Parkinson's disease. PLOS ONE. 8 (12), e83919 (2013).
- Luster, B., Hyde, J., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. Mechanisms behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN). Abstr Soc Neurosci. 38, 257.20 (2014).
- Luster, B., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. High-threshold Ca2+ channels behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN). Physiol. Rep. 3 (6), e12431 (2015).
