Protocol
NOTA: Para este protocolo, temos nos concentrado em ensaio frequência stromule na epiderme de N. deixa benthamiana. Várias linhas transgénicas estáveis foram gerados que pode ser utilizado para este fim, incluindo a 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 e NRIP1 Cerulean: 6. Ambas estas linhas mostram a expressão robusta de fluoróforos no estroma do cloroplasto de folhas cultivadas sob uma ampla gama de condições. Alternativamente, fluoróforos segmentados por cloroplastos pode ser transitoriamente expresso em N. benthamiana usando Agrobacterium Transformações 13. Isto é menos do que ideal as linhas transgénicas, dado que as infiltrações de Agrobacterium induzem algumas respostas de defesa basais em N. benthamiana e interacções com Agrobacterium pode alterar a frequência stromule na folha 14, potencialmente complicar a interpretação dos resultados. Finalmente, para visualizar a formação stromule in vitro,cloroplastos pode ser extraído a partir de qualquer espécie de planta, utilizando fluoróforos geneticamente codificados ou um corante fluorescente, tal como descrito na secção 5 abaixo. 9,15
NOTA:. Métodos pormenorizados de cultivo de plantas foram previamente descritos 16 Resumidamente, crescer N. plantas benthamiana em 4 potes "preenchidos com qualquer mistura de solo profissional que fornece uma boa drenagem. Cubra mudas com uma cúpula de plástico transparente para os primeiros 10-14 dias para fornecer um ambiente úmido para a germinação. adicionar qualquer combinação de fertilizantes padrão seguindo as instruções do fabricante para 14- plantas dias de idade. Cultive plantas sob luz branca, usando ~ 100 mol fótons m -2 seg -1 intensidade de luz. As plantas aquáticas regularmente.
1. Preparar as amostras de folhas para visualização
NOTA: dinâmica Stromule são afetados por ferindo 8, então a preparação do tecido deve ser realizada imediatamente antes visualizando stromules por microscopia de fluorescência confocal. Idealmente, uma amostra deve ser visualizado com 15 min após remoção a partir da planta.
- Corte uma pequena secção da folha usando uma lâmina de barbear muito afiada. Sempre utilizar a mesma região da folha de consistência, e ter a certeza de visualizar a mesma superfície (adaxial ou abaxial) em todas as experiências.
- Imediatamente após o corte da secção de folha, submergir a secção de folha em 5 ml de uma seringa sem agulha cheia com água, remover o ar a partir da seringa, e aplicar um vácuo, cobrindo o orifício de seringa com um dedo e puxando o êmbolo.
- Solte o êmbolo com cuidado para não danificar a secção de folha. Repetir este duas ou três vezes, ou até a maior parte do ar ter sido retirado e a folha parece ser verde profundo.
NOTA: Este passo remove o ar na folha que pode interferir com a visualização precisa de stromules.
- Solte o êmbolo com cuidado para não danificar a secção de folha. Repetir este duas ou três vezes, ou até a maior parte do ar ter sido retirado e a folha parece ser verde profundo.
- Adicionar uma gota de água para um slide e colocar a folha nesta secção gota. Em seguida, adicione outro drop de água para a parte superior da folha, e colocar uma lamela de cobertura sobre a folha. Se houver quaisquer bolhas de ar, bata suavemente a lamínula até que sejam removidos. O slide está agora pronto para a microscopia, e deve ser visualizada imediatamente.
2. A visualização Stromules com microscopia de fluorescência confocal
- Com luz transmitida, o foco sobre um campo de visão perto do centro da secção de folha (de distância a partir das células danificadas pela lâmina de barbear). Usar uma objectiva 20X de modo que muitos cloroplastos podem ser visualizadas simultaneamente. Guardar uma imagem com luz transmitida de modo que tipos de células podem distinguir-se mais tarde, se necessário.
- Alternar a fonte de iluminação para um laser com filtros de excitação e emissão adequados para o fluoróforo ser utilizado. Por exemplo, excita GFP com um laser de 488 nm e recolher emissões entre 500 nm e 525 nm.
- Usando o software do microscópio, selecione o canal de GFP e clique para ajustar a abertura pinhole a 1 Aiunidade de ry. Escolha de varredura a laser, para começar a visualizar a amostra e, em seguida, clique no canal de GFP para ajustar a intensidade do laser eo ganho de detector para minimizar a potência do laser, enquanto ainda visualizar claramente stromules. Uma vez que essas configurações tenham sido determinadas, mantê-los o mais consistente possível em todos os experimentos.
- Prepare uma experiência -stack z que irá recolher uma série de imagens através da epiderme da folha no campo de visão.
- Para o z -stack, incluir todos os cloroplastos epidérmicas no campo de visão para evitar viés (por exemplo, se os cloroplastos perto da superfície da folha ter mais stromules em condições testadas).
- Captar imagens no intervalo máximo possível, que incluirá todos os stromules mas minimizar o tempo necessário para um -stack z. Por exemplo, se uma unidade de Airy é equivalente a uma secção confocal de focagem é que 2 um de profundidade, tendo uma imagem a cada 2 um é provavelmente ideal.
NOTA: O epidermi folhaS é uma superfície irregular, de modo que a profundidade total do -stack z irá variar, dependendo da amostra; a maioria -stacks z exigirá 10-20 imagens, mas pode incluir mais. - Ajuste a velocidade de digitalização e resolução de imagem conforme necessário para se certificar de que o -stack z é recolhido rapidamente (normalmente dentro de 5-10 min, se possível). Salve o -stack z para análise posterior.
Processamento 3. Imagem
- Determinar a freqüência stromule usando qualquer software de análise de imagem. Para este protocolo, recomendamos a utilização ImageJ, que está disponível ao público a partir do National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), ou o upgrade popular de ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji).
- Mesclar o z -stack em uma única imagem utilizando a projeção de máxima intensidade no software.
- Identificar e contar manualmente todos os cloroplastos na imagem.
- Para cada cloroplasto, determinar visualmente se um ou mais stromulessão vistas estendendo-se desde o cloroplasto na imagem do z mesclada -stack. Para exemplos, ver Figura 1.
Observação: Uma vez que as funções biológicas de stromules não são conhecidos, qualquer, cheio de estroma, extensão tubular fina do cloroplasto pode ser considerado como um "stromule", independentemente do comprimento. Como regra geral, uma extensão cheio de estroma do cloroplasto é um stromule se for menos do que cerca de 1 um de diâmetro ao longo da maioria do seu comprimento 7. Certifique-se que uma pessoa analisa todas as imagens para controlar as diferenças subjetivas para determinar se ou não um cloroplasto tem uma stromule. Um segundo pesquisador deve verificar independentemente as frequências stromule para reduzir ainda mais preconceitos subjetivos.
4. Desenho Experimental e Amostragem
NOTA: Stromule frequência é altamente variável entre as folhas, mas vários relatos sugerem que há pouca variação na frequência stromule dentro de uma indivi9,17 dupla folha.
- Calcular a frequência da folha stromule de um único campo de vista de uma folha. Descarte a folha, e considerar esta uma amostra independente. Não considere campos separados de vista de uma folha como amostras independentes.
NOTA: Não há forte consenso sobre a melhor medida essas mudanças na atividade stromule, e até que a função de stromules é mais claramente definida, os investigadores devem continuar a ser criativo em quantificar a dinâmica stromule. Para a comparação entre a literatura, no entanto, as normas comuns de comunicação de dados deve ser utilizado, além de abordagens mais criativas. No mínimo, sempre relatar a frequência de cloroplastos que têm um ou mais stromules. - Determinar a frequência dos cloroplastos que têm stromules em um campo de visão. Use ImageJ para identificar todos os cloroplastos em um campo de visão. Em seguida, para cada cloroplasto, determinar se o cloroplasto tem formado pelo menos um stromule. frequência stromule relatório como o percentaGE de cloroplastos com um stromule.
NOTA: Alguns pesquisadores transformar a percentagem, por exemplo, com a transformação arco-seno, antes de relatar frequências stromule; enquanto esta é uma opção para a análise estatística, o arco-seno de frequência stromule não é um valor intuitivo e não precisa ser relatado no texto principal ou números de um estudo.- Como abordagem alternativa, contar o número total de stromules, e dividi-lo pelo número total de cloroplastos.
NOTA: Na maioria dos casos, isso irá produzir resultados semelhantes para abordar 4.2; pode superestimar a frequência stromule, no entanto, se um único cloroplasto tem formado muitos stromules. No exemplo mostrado em resultados representativos, por exemplo, vários cloroplastos têm dois ou mais stromules, elevando o número de stromules por cloroplasto para 40/87 (versus uma frequência stromule de 33/87). - Alternativamente, determinar o comprimento, em vez de frequência stromule stromule. O comprimento pode ser medidoem ImageJ, traçando a stromule com a ferramenta de linha à mão livre.
Observação: Uma vez que o papel biológico do stromules permanece desconhecido, não é claro que o comprimento stromule afecta a sua função. Relatam diferenças significativas em comprimento stromule se eles são observados, mas também relatam as frequências stromule (como descrito em 4.2).
NOTA: frequência Stromule pode ser altamente variável entre as folhas diferentes sob as mesmas condições de crescimento. Portanto, embora a determinação frequência stromule pode ser demorado, os experimentos devem ser cuidadosamente projetado para incluir amostras de grande tamanho. Usando conjuntos de dados do nosso laboratório, determinou-se que uma amostra de pelo menos 16 plantas por cada tratamento é geralmente suficientemente poderoso para determinar se existe uma diferença estatisticamente significativa de pelo menos uma alteração de 1,5 vezes na frequência stromule entre duas condições (com a norma α = 0,05 e β = 0,80).
- Como abordagem alternativa, contar o número total de stromules, e dividi-lo pelo número total de cloroplastos.
- A análise estatística dos resultados.
- Para comparar a mimum stromule frequências de dois tratamentos, utilize o teste t de Welch (também conhecido como o teste t ou t heteroscedástico assumindo variância desigual).
NOTA: Este teste não é tão poderoso quanto o teste t de Student convencional, mas o teste t de Welch é vantajoso porque não assume que a variação na distribuição de frequência stromule é semelhante entre os tratamentos.
NOTA: Uma vez que a frequência stromule é uma "proporção", a sua distribuição de amostragem está previsto para ser binomial, em vez do que o normal, o que poderia análise estatística, teoricamente, inclinação, se as amostras são muito baixa ou se a frequência stromule é muito baixo (próximo a 0%) ou muito elevado (perto de 100%). Alguns relatórios têm utilizado arcsine transformações antes da análise estatística, que se destina a transformar uma distribuição binomial a uma distribuição normal, e, assim, satisfazer os requisitos da norma de um teste t de Student ou ANOVA. Na prática, no entanto, umatransformações rcsine têm pouco ou nenhum efeito na análise estatística, e, portanto, não são recomendados. Em vez disso, repetir experiências para aumentar o tamanho da amostra, o que vai aumentar o poder estatístico e reduzir os erros de interpretação de dados. - Independentemente da abordagem estatística é usado, não se esqueça de informar cuidadosamente a estratégia de amostragem, dimensão da amostra, teste estatístico e valor de p para cada experimento.
NOTA: Como com outros campos da biologia, um valor p inferior a 0,05 pode ser considerado "estatisticamente significativa", embora os pesquisadores certamente deve informar o valor p precisa obtido. Se p é ligeiramente acima de 0,05, aumentando o tamanho da amostra com duas ou três experiências podem contribuir para determinar se ou não a diferença observada é reprodutível e estatisticamente significativa.
- Para comparar a mimum stromule frequências de dois tratamentos, utilize o teste t de Welch (também conhecido como o teste t ou t heteroscedástico assumindo variância desigual).
5. Extrair cloroplastos intactos para Visualize Stromule Dynamics
NOTA: Vários métodostêm sido utilizados para isolar os cloroplastos de folhas, incluindo um protocolo ligeiramente diferente num estudo recente sobre a formação in vitro stromule 15. O protocolo detalhado abaixo utiliza um método relativamente simples que não se obter amostras de cloroplastos bioquimicamente puros, mas que em vez disso isolar uma quantidade grande de cloroplastos intactos, 9,18 saudáveis.
- Prepare tampão de extracção a frio: mM Hepes NaOH 50, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, MgCl 1,0 mM 2, e MnCl 1,0 mM 2. Ajustar o pH para 6,9 com NaOH e HCl, e refrigerar antes da utilização.
Nota: Embora não necessário, utilizando tampões frio e manter as amostras em gelo quando possível irá produzir uma proporção mais elevada de cloroplastos intactos. - Preparar tampão de isolamento: 50 mM de Hepes NaOH, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, MnCl 2 1,0 mM, NaCl mM, 1,0 mM de MgCl 2, 10 mM de KCl, e 1,0. Ajustar o pH para 7,6 com NaOH e HCl e refrigerar antes da utilização.
- Se as folhas não sãoexpressando um fluoróforo do estroma geneticamente codificada, diacetato de carboxifluoresceína preparar a solução (CFDA): CFDA solução estoque a 50 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO) (2,3 mg CFDA por 1,0 mL de DMSO).
NOTA: A concentração exacta não é crítica. Manter estoque CFDA no escuro em todos os momentos. Armazenar aliquotas de pequenos CFDA 50 mM a -20 ° C. - Para isolar cloroplastos, remova ~ 5-10 g folhas de várias plantas e lavar brevemente em água fria. transferir imediatamente para 50 ml de tampão de extracção a frio. folhas de moagem, utilizando um liquidificador com vários pulsos curtos. Filtrar através de duas ou três camadas de gaze para remover restos de folhas, dividir os cloroplastos extraídos em dois tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugar durante 1 min a 750 x g.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as cloroplastos verdes em tampão de isolamento 10 ml. Centrifugar novamente durante 1 min a 750 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender cloroplastos em tampão de isolamento para levar o volume final até 5 ml.
- Transferir 201; l dos cloroplastos para um slide, cubra com uma lamela, e começar a microscopia.
NOTA: Os cloroplastos de plantas transgênicas que expressam proteínas fluorescentes segmentadas plastídeo agora está pronto para visualização por microscopia de fluorescência confocal. - Manchar cloroplastos de plantas que não são expressam proteínas fluorescentes segmentadas plastídeo para visualizar stromules.
- Adicionam-se 5 ul de estoque 50 mM de CFDA para os 5 ml de cloroplastos-suspensas em tampão de isolamento. Levar a concentração final de 50 uM.
- Permitir cloroplastos para incubar durante 5 min, e, em seguida, transferir uma pequena alíquota (~ 50 jil) a uma lâmina, coberta com uma lamela, e começar a microscopia.
- Use um conjunto de filtros FITC ou GFP. Use um objetivo 20X para visualizar muitos cloroplastos, simultaneamente, ou um objectivo superior para visualizar um único cloroplasto isolado.
NOTA: CFDA ficam fluorescentes dentro do estroma dos cloroplastos intactos. - Se não houver fundo fluorescência forte, lavar o chloroplasts novamente em 10 ml de tampão de isolamento após a 5 minutos de incubação com CFDA, centrifugar durante 1 minuto a 750 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender em 5 ml de tampão de isolamento.
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Representative Results
Este protocolo foi usado para visualizar a frequência stromule de dia e à noite nos cotilédones de jovens N. mudas benthamiana. Fatias de uma pilha z foram fundidas em uma única imagem (Figura 1A). Para efeitos visuais, que a imagem foi então Saturado e invertido de modo que o estroma aparece negro (Figura 1B). Os cloroplastos foram marcados quer como não tendo stromules asterisco (verde) ou com pelo menos um stromule (asterisco magenta). Dos 87 cloroplastos epidérmicas visualizadas, 33 têm stromules. Assim, a frequência stromule nesta folha é de 37,9%.
Utilizando esta análise, o protocolo foi repetido por mais 21 plantas (uma folha por planta) durante o dia e um total de 24 plantas à noite. Durante o dia, a freqüência média stromule foi de 20,8 ± 1,8%; à noite, a freqüência média stromule foi de 12,8 ± 0,9% (Figura2). Frequência Stromule foi significativamente mais elevado durante o dia, conforme determinado pelo teste t de Welch (n ≥ 22, p <0,0005). Note que, embora mais de 23.000 cloroplastos e várias centenas de células foram observadas, o tamanho da amostra, n, é reportado como 22, o número de plantas independentes examinados.
Utilizando o protocolo descrito aqui, stromules cloroplastos foram observados in vitro, depois do isolamento a partir de folhas de N. benthamiana expressando GFP dirigido ao plastidio (Figura 3A), ou após o uso de CFDA a manchar cloroplastos isolados de N. benthamiana (Figura 3B) ou de Spinacia oleracea (Figura 3C).
Figura 1. A quantificação frequência stromule em N. benthfolhas amiana. (A) A z -stack a partir de um campo de vista parcial da epiderme de N. benthamiana expressar estromal GFP foi incorporada para mostrar todos os cloroplastos epidérmicas e stromules em uma única imagem. (B) Esta imagem foi convertida a preto e branco e invertido para efeitos visuais. Cloroplastos com stromules são indicados por um asterisco magenta; cloroplastos sem stromules são indicados por um asterisco verde. As barras de escala representam 10 um. Modificado de Brunkard et al. 9 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Comparação de frequência em toda stromule condições. Este protocolo foi utilizado para determinar o strfrequência omule em 22 plantas durante o dia e 24 plantas à noite. Frequência Stromule foi significativamente maior durante o dia do que à noite (teste t de Welch, n ≥ 22, p <0,0005). As barras de erro indicam o erro padrão. Modificado de Brunkard et al. 9 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Visualização stromules depois de extrair os cloroplastos intactos de folhas. (A) cloroplastos de N. transgênico benthamiana folhas expressa GFP (verde) orientada para o cloroplasto foram isoladas utilizando os protocolos descritos aqui. (B) Os cloroplastos foram isolados a partir de tipo selvagem N. benthamiana folhas e corados com CFDA, que fluoresces somente dentro intactas, cloroplastos viáveis (mostrada em amarelo). (C) Os cloroplastos podem também ser isolados a partir de outras espécies de plantas, tais como o espinafre (S. oleracea), e depois corado com CFDA (amarelo). Clorofila autofluorescência é mostrado em vermelho. Modificado de Brunkard et al. 9
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Discussion
Ao investigar stromules, três fatores importantes devem ser considerados ao longo de: (i) a manipulação do tecido da planta devem ser mantidos a um mínimo absoluto, (ii) o sistema experimental deve ser mantido consistente, e (iii) estratégias de amostragem devem ser cuidadosamente planejado para assegurar robusto, os dados podem ser reproduzidos são analisados.
Stromules são notavelmente dinâmica: eles podem se estender e retrair rapidamente diante dos olhos de um observador sob o microscópio. Além disso, a frequência stromule varia significativamente em resposta a uma grande variedade de tratamentos, incluindo de estímulos que não podem ser evitadas, a fim de visualizar stromules (como ferimento da folha). A principal solução para este problema, que é dirigida com os protocolos descritos aqui, é a realização de experimentos bem controlados, mantendo todas as variáveis consistente. Isto inclui, por exemplo, a preparação de cada amostra para a visualização imediatamente antes trazendo-o ao microscópio; plantas não devem ser danificadosaté imediatamente antes da visualização. A segunda solução para este problema é o de minimizar a complexidade de protocolos: idealmente, quaisquer tratamentos devem ser aplicadas directamente à planta sem remover a folha ou causar qualquer dano.
Stromules foram estudadas em uma variedade estonteante de espécies e tipos de células, incluindo cabelos trigo raiz, frutos de tomate, e mudas de tabaco estiolados 8,19. Estes estudos pioneiros avançaram a compreensão da dinâmica stromule durante o desenvolvimento da planta e explorou a gama de actividade stromule. Desenho comparações destes vários sistemas experimentais, no entanto, pode conduzir a erros de interpretação, uma vez que diferentes tipos de plastos estão envolvidas em processos biológicos consideravelmente diferentes.
Por exemplo, os cloroplastos fazer stromules em resposta ao estresse oxidativo causado pela cadeia de electrões fotossintéticos, mas uma vez que não possuem a maquinaria leucoplastos fotossintética, que não são sensíveis àmesmo estímulos 9. Qualquer sistema experimental pode ser utilizado para investigar stromules, mas o sistema experimental deve ser mantida consistente ao longo do estudo, se quaisquer comparações são para ser desenhada. Fatores a serem considerados incluem espécies, tipo de célula, estágio de desenvolvimento ou idade da planta, e método de stromules coloração (seja por meio de expressão estável transgene, transgene expressão transitória, ou um fluoróforo externo); mesmo pequenas variações destes fatores podem confundir a interpretação posterior dos resultados.
Finalmente, qualquer estudo da biologia stromule deve usar uma estratégia de amostragem robusta e confiável para garantir que os resultados são reprodutíveis e biologicamente relevante. Amostragem repetidamente a partir de uma única planta, por exemplo, a tomada de imagens de várias regiões de um folha, aparentemente vai melhorar o poder estatístico, mas pode ser enganosa. Como se mostra nos dados representativos acima referidos, a frequência stromule de uma única folha pode variar dramaticamente a partir da frequência média stromuleatravés de muitas folhas: em que folha, que foi visualizado durante o dia, 37,9% de cloroplastos feita stromules, embora a frequência stromule significativo entre as folhas durante o dia era quase metade que, apenas 20,8%.
Além disso, dado o quão pouco se sabe sobre a dinâmica stromule, neste momento, qualquer experiência que deve ser totalmente replicado pelo menos três vezes, e mais, se possível, para assegurar que as variáveis imprevistas não são responsáveis por quaisquer mudanças na atividade stromule que são observados. Acima de tudo, desde o campo stromule biologia está apenas começando a decolar, os pesquisadores devem cuidadosamente documentar e relatar todos os aspectos do design experimental, incluindo desvios criativas do protocolo simples descritos aqui.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
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