Protocol
MERK: For denne protokollen, har vi fokusert på å analysere stromule frekvens i overhuden av N. benthamiana blader. Flere stabile transgene linjer har blitt generert som kan brukes til dette formålet, inkludert 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 og NRIP1: Cerulean 6. Begge disse kurver viser sterk ekspresjon av fluoroforer i kloroplasten stroma av blader dyrket under et bredt område av betingelser. Alternativt kan chloroplast målrettede fluorophores være forbigående uttrykt i N. benthamiana bruker Agrobacterium transformasjoner 13. Dette er mindre ideell enn de transgene linjer, siden Agrobacterium infiltrasjoner indusere noen basale forsvar svar i N. benthamiana og interaksjoner med Agrobacterium kan endre stromule frekvens i bladet 14, potensielt kompliserer tolkningen av resultatene. Til slutt, for å visualisere stromule dannelse in vitro,kloroplaster kan være hentet fra noen plantearter, enten ved hjelp av genetisk kodet fluoroforer eller et fluorescerende fargestoff, som beskrevet i kapittel 5 nedenfor. 9,15
MERK:. Detaljerte metoder for plante dyrking er tidligere beskrevet 16 korthet vokse N. benthamiana planter i 4 "potter fylt med noen profesjonelle jord blanding som gir god drenering. Dekker frøplanter med en klar plast kuppel for de første 10-14 dager for å gi et fuktig miljø for spiring. Legg noen standard gjødsel blanding følge produsentens instruksjoner for å 14- dag-gamle planter. Dyrk planter under hvitt lys, som bruker ~ 100 mikromol fotoner m -2 sek -1 lysintensitet. Vannplanter planter~~POS=HEADCOMP regelmessig.
1. Klar Leaf Prøver for visualisering
MERK: Stromule dynamikk er påvirket av såret åtte, så vev forberedelse bør gjennomføres umiddelbart før visualisere stromules ved confocal fluorescens mikroskopi. Ideelt sett bør en prøve bli visualisert med 15 minutter etter fjerning fra anlegget.
- Skjær en liten del av bladet ved hjelp av en meget skarp barberblad. Bruk alltid samme region av bladet for konsistens, og være sikker på å visualisere samme overflate (adaxial eller abaxial) i alle forsøk.
- Umiddelbart etter klipping bladet delen, senk bladet delen i en 5 ml nålløs sprøyte fylt med vann, fjerne luft fra sprøyten, og bruke et vakuum ved å dekke sprøyten åpningen med en finger og dra stempelet.
- Slipp stempelet forsiktig for å unngå skade på blad delen. Gjenta dette to eller tre ganger, eller inntil det meste av luften er fjernet og bladet ser ut til å være dyp grønn.
MERK: Dette trinnet fjerner luft i bladet som kan forstyrre nøyaktig visualisering av stromules.
- Slipp stempelet forsiktig for å unngå skade på blad delen. Gjenta dette to eller tre ganger, eller inntil det meste av luften er fjernet og bladet ser ut til å være dyp grønn.
- Tilsett en dråpe vann til et lysbilde og plassere bladet avsnittet om dette fallet. Deretter legger en annen drop av vann til toppen av bladet, og plassere et dekkglass over bladet. Hvis det er noen luftbobler, banke forsiktig på dekkglass før de blir fjernet. Sleiden er nå klar for mikroskopi, og skal visualiseres umiddelbart.
2. Visualisering Stromules med Confocal Fluorescensmikroskopi
- Ved gjennomfallende lys, fokusere på et synsfelt nær midten av bladseksjonen (bort fra cellene skadet av barberblad). Bruk en 20X objektiv, slik at mange kloroplaster kan visualiseres samtidig. Lagre et bilde med gjennomfallende lys, slik at celletyper kan skilles senere, om nødvendig.
- Bytte belysningskilden til en laser med passende eksitasjons- og emisjonsfiltre for fluoroforen som brukes. For eksempel, opphisse GFP med en 488 nm laser og samle utslipp mellom 500 nm og 525 nm.
- Ved hjelp av mikroskop programvare, velg GFP kanalen, og klikk for å justere pinhole blenderåpning til en Airy enhet. Velg laserskanning, for å starte visualisere prøven, og klikk deretter GFP kanalen for å justere laser intensitet og detektoren gevinst å minimere laser makt samtidig klart å visualisere stromules. Når disse innstillingene er blitt bestemt, holde dem så konsekvent som mulig gjennom alle forsøk.
- Forbered en z -stack eksperiment som vil samle en rekke bilder gjennom bladet epidermis i synsfeltet.
- For z -stack inkluderer alle epidermal kloroplaster i synsfeltet for å unngå skjevhet (for eksempel hvis kloroplaster nærheten bladet overflaten ha flere stromules under forhold som ble testet).
- Ta bilder med det maksimale intervall mulig som vil omfatte alle stromules men minimere tiden det tar for en z -stack. For eksempel, hvis en Airy enhet er ekvivalent med en i-fokus konfokal seksjon som er 2 um dyp, idet et bilde hver 2 um er sannsynlig ideell.
MERK: Bladet epidermis er en ujevn overflate, slik at den totale dybden av z -stack vil variere avhengig av prøven; de fleste z -stacks vil kreve 10-20 bilder, men kan inneholde mer. - Juster skannehastighet og bildeoppløsning som er nødvendig for å sørge for at z -stack samles raskt (vanligvis i løpet av 5-10 min, hvis mulig). Lagre z -stack for senere analyse.
3. Bildebehandling
- Bestem stromule frekvens ved hjelp av noen bildeanalyse programvare. For denne protokollen, anbefaler vi å bruke ImageJ, som er offentlig tilgjengelig fra National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), eller den populære oppgradering av ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji).
- Flett z -stack til ett bilde med maksimal intensitet projeksjon i programvaren.
- Identifisere og manuelt telle alle kloroplaster i bildet.
- For hver kloroplast, visuelt avgjøre om en eller flere stromulesblir sett som strekker seg fra kloroplast i det sammenslåtte z -stack bilde. For eksempler, se figur 1.
MERK: Siden de biologiske funksjonene stromules ikke er kjent, kan en hvilken som helst tynn, stroma fylt, rørformet forlengelse fra kloroplast anses som en "stromule", uansett lengde. Som en generell regel, en stroma-fylt forlengelse fra kloroplast er et stromule hvis det er mindre enn omtrent 1 pm i diameter langs det meste av sin lengde 7. Sørg for at en person analyserer alle bildene for å kontrollere for subjektive forskjeller i å avgjøre hvorvidt en kloroplast har stromule. En annen forsker bør uavhengig verifisere stromule frekvenser for å ytterligere redusere subjektive skjevheter.
4. Experimental Design og Sampling
MERK: Stromule frekvens er svært variabel mellom bladene, men flere rapporter tyder på at det er lite variasjon i stromule frekvens innenfor en fysiskdual blad 9,17.
- Beregn blad stromule frekvens fra et enkelt synsfelt på ett blad. Kast blad, og vurdere dette et uavhengig utvalg. Ikke vurdere separate felt av utsikten fra ett blad som uavhengige utvalg.
MERK: Det er ingen sterk konsensus om hvordan du best måle endringer i stromule aktivitet, og til funksjonen av stromules blir tydeligere, bør forskere fortsetter å være kreative i å kvantifisere stromule dynamikk. For sammenligning på tvers litteraturen, men felles standarder for rapportering bør brukes i tillegg til mer kreative måter. Som et minimum, alltid rapporterer frekvensen av kloroplaster som har én eller flere stromules. - Bestemme frekvensen av kloroplaster som har stromules i et synsfelt. Bruk ImageJ å identifisere alle kloroplaster i et synsfelt. Deretter, for hver kloroplast, bestemme hvorvidt den kloroplast er dannet minst ett stromule. Rapporter stromule frekvens som Percentage av kloroplaster med stromule.
MERK: Noen forskere forvandle prosent, for eksempel med arcsinus transformasjon, før rapportering stromule frekvenser; mens dette er et alternativ for statistisk analyse, er arcsinus av stromule frekvens ikke en intuitiv verdi, og trenger ikke å bli rapportert i hovedteksten eller tall av en studie.- Som et alternativ tilnærming, telle det totale antall stromules og dividere den med det totale antallet kloroplaster.
MERK: I de fleste tilfeller vil dette gi lignende resultater å nærme seg 4,2; det kan overvurderer stromule frekvens, men hvis en enkelt kloroplast har dannet mange stromules. I det viste eksempel i henhold til representative resultater, for eksempel flere kloroplaster har to eller flere stromules, øke antall stromules pr kloroplast til 40/87 (versus en stromule frekvens på 33/87). - Alternativt kan bestemme stromule lengde istedenfor stromule frekvens. Lengde kan målesi ImageJ ved å spore stromule med frihåndslinje verktøyet.
Merk Fordi den biologiske rolle stromules forblir ukjent, er det ikke klart at stromule lengde påvirker deres funksjon. Rapporterer signifikante forskjeller i stromule lengde dersom de viser seg, men også rapportere stromule frekvenser (som beskrevet i 4.2).
MERK: Stromule frekvensen kan være svært variabel mellom ulike blader under de samme vekstvilkår. Derfor, selv om bestemmelse stromule frekvensen kan være tidkrevende eksperimenter bør være nøye konstruert for å inkludere store prøvestørrelser. Ved hjelp av datasett fra vår lab, fant vi ut at en utvalgsstørrelse på minst 16 planter for hver behandling er vanligvis tilstrekkelig kraftig for å finne ut om det er en statistisk signifikant forskjell på minst 1,5 ganger endring i stromule frekvens mellom to tilstander (med standard α = 0,05 og β = 0,80).
- Som et alternativ tilnærming, telle det totale antall stromules og dividere den med det totale antallet kloroplaster.
- Statistisk analyse av resultatene.
- Å sammenligne megen stromule frekvenser av to behandlinger, bruke Welch t test (også kjent som heteroscedastic t-test eller t-test forutsatt ulik varians).
MERK: Denne testen er ikke så kraftig som den konvensjonelle Student t test, men Welch t test er en fordel fordi det ikke anta at variansen i stromule frekvensfordeling er lik mellom behandlingene.
MERK: Siden stromule frekvens er en "andel", er dens prøvetaking distribusjon spådd å være binomisk snarere enn normalt, noe som kan teoretisk skew statistisk analyse om utvalgsstørrelsene er svært lav eller hvis stromule frekvensen er svært lav (nær 0%) eller svært høy (tilnærmet 100%). Enkelte rapporter har brukt arcsin transformasjoner før statistisk analyse, som er ment å forvandle en binomisk fordeling til en normalfordeling, og dermed tilfredsstiller de krav en Student t test eller ANOVA. I praksis er imidlertid enrcsine transformasjoner har liten eller ingen effekt på statistisk analyse, og anbefales derfor ikke. I stedet gjentar eksperimenter for å øke utvalgsstørrelsen, noe som vil øke statistisk styrke og redusere feil i tolkningen av data. - Uansett statistisk tilnærming blir brukt, må du nøye rapportere prøvetakingsstrategi, utvalgsstørrelse, statistisk test, og p-verdi for hvert forsøk.
MERK: Som med andre innen biologi, kan en p-verdi mindre enn 0,05 anses som "statistisk signifikant", selv om forskere bør absolutt rapportere nøyaktige p-verdi oppnådd. Hvis p er litt over 0,05, øker prøvestørrelsen med to eller tre eksperimenter kan bidra til å klargjøre hvorvidt forskjellen observert er reproduserbar og statistisk signifikant.
- Å sammenligne megen stromule frekvenser av to behandlinger, bruke Welch t test (også kjent som heteroscedastic t-test eller t-test forutsatt ulik varians).
5. Trekke Intakte Kloroplaster å visualisere Stromule Dynamics
MERK: Flere metoderhar blitt brukt til å isolere kloroplaster fra blader, inkludert en litt annen protokoll i en fersk undersøkelse om stromule dannelse in vitro 15. Protokollen beskrevet nedenfor bruker en forholdsvis enkel fremgangsmåte som ikke gir biokjemisk rene chloroplast eksempler, men i stedet isolere store mengder av intakte, sunne kloroplaster 9,18.
- Forbered kald ekstraksjon buffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl2, og 1,0 mM MnCl2. Juster pH til 6,9 med NaOH og HCl, og avkjøle før bruk.
MERK: Selv om det ikke er nødvendig, ved hjelp av kaldt buffere og holde prøvene på is når det er mulig vil gi en høyere andel av intakte kloroplaster. - Fremstille isolasjon buffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MnCl2, 1.0 mM MgCl2, 10 mM KCl og 1,0 mM NaCl. Juster pH til 7,6 med NaOH og HCl og oppbevares i kjøleskap før bruk.
- Hvis bladene ikke eruttrykker en genetisk kodet stromal fluorophore, forberede carboxyfluorescein diacetate (CFDA) løsning: 50 mm CFDA stamløsning i dimetylsulfoksid (DMSO) (2,3 mg CFDA per 1,0 ml DMSO).
NB: Den nøyaktige konsentrasjonen er ikke kritisk. Hold CFDA lager i mørket til alle tider. Lagre små porsjoner av 50 mM cfda ved -20 ° C. - For å isolere kloroplaster, fjerne ~ 5-10 g blader fra flere planter og kort skyll i kaldt vann. Umiddelbart overføres til 50 ml kald ekstraksjon buffer. Grind blader ved hjelp av en blender med flere korte pulser. Filtrer gjennom to eller tre lag av osteklede for å fjerne rusk blad, dele de ekstraherte kloroplaster til to 50 ml sentrifugerør, og sentrifuger i 1 min ved 750 x g.
- Kast supernatanten og resuspender grønne kloroplaster i 10 ml isolasjon buffer. Sentrifuger på nytt i 1 minutt ved 750 xg, kast supernatant og resuspender kloroplaster isolert buffer for å bringe sluttvolumet til 5 ml.
- Transfer 201; l av kloroplastene til et lysbilde, dekk med et dekkglass, og begynne mikroskopi.
MERK: kloroplaster fra transgene planter som uttrykker Plastid målrettede fluorescerende proteiner er nå klar for visualisering av confocal fluorescens mikroskopi. - Flekk kloroplaster fra planter som ikke uttrykker Plastid målrettede fluorescerende proteiner for å visualisere stromules.
- Tilsett 5 mL av 50 mM CFDA lager til 5 ml kloroplaster-suspendert i isolasjon buffer. Bringe sluttkonsentrasjonen til 50 uM.
- Tillat kloroplaster å ruge i 5 min, og deretter overføre en liten delmengde (~ 50 pl) i et lysbilde, dekk med et dekkglass, og begynne mikroskopi.
- Bruk en FITC eller GFP filtersett. Bruk en 20X objektiv for å visualisere mange kloroplaster samtidig, eller en høyere målsetting å visualisere en enkelt isolert kloroplast.
MERK: CFDA vil fluor inne i stroma av intakte kloroplaster. - Hvis det er sterk bakgrunns fluorescens, vaske Chloroplasts på nytt i 10 ml buffer isolert etter 5 minutters inkubasjon med cfda, sentrifuger i 1 min ved 750 xg, kast supernatant og resuspender i 5 ml isolasjonsbuffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen ble brukt til å visualisere stromule frekvens på dagen og om natten i cotyledons av unge N. benthamiana frøplanter. Skiver fra en z-stack ble slått sammen til et enkelt bilde (figur 1A). For visuelle formål, det bildet var så desaturert og omvendt, slik at stroma er svart (figur 1B). Kloroplastene ble merket enten som å ha ingen stromules (grønn stjerne) eller å ha minst én stromule (magenta stjerne). Av de 87 epidermal kloroplaster visualisert, 33 har stromules. Dermed blir stromule frekvens i dette blad er 37,9%.
Ved hjelp av denne analysen, ble protokollen gjentatt i ytterligere 21 anlegg (ett blad per plante) i løpet av dagen og totalt 24 planter om natten. I dag, gjennomsnittlig stromule frekvensen var 20,8 ± 1,8%; om natten, gjennomsnittlig stromule frekvensen var 12,8 ± 0,9% (Figur2). Stromule frekvens var signifikant høyere i løpet av dagen, som bestemmes av den Welch t test (n ≥ 22, p <0,0005). Legg merke til at selv om mer enn 23 000 kloroplaster og flere hundre celler ble observert, prøvestørrelse, n, er rapportert som 22, antallet uavhengige planter undersøkt.
Ved anvendelse av protokollen som er beskrevet her, ble chloroplast stromules observert in vitro etter isolering fra blader av N. benthamiana uttrykker plastidtransittpeptiddel målrettet GFP (figur 3A), eller etter bruk av CFDA å farge kloroplaster isolert fra N. benthamiana (figur 3B) eller Spinacia oleracea (Figur 3C).
Figur 1. Kvantifisering stromule frekvens i N. Benthamiana blader. (A) En z -stack fra en delvis synsfelt på epidermis av N. benthamiana uttrykker stromal GFP ble slått sammen for å vise alle epidermal kloroplaster og stromules i et enkelt bilde. (B) Dette bildet ble konvertert til svart-hvitt og omvendt for visuell formål. Kloroplaster med stromules er indikert med en magentafarget stjerne; kloroplaster uten stromules er angitt med en grønn stjerne. Skala barer representerer 10 mikrometer. Modifisert fra Brunkard et al. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sammenligning av stromule frekvens på tvers av betingelser. Denne protokollen ble anvendt for å bestemme den stromule frekvens i 22 planter i dag og 24 planter om natten. Stromule frekvens var betydelig høyere i løpet av dagen enn om natten (Welch t test, n ≥ 22, p <0,0005). Feilfelt indikere standard feil. Modifisert fra Brunkard et al. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Visualisering stromules etter utpakking intakte kloroplaster fra bladene. (A) kloroplaster fra transgen N. benthamiana forlater uttrykt GFP (grønt) rettet mot kloroplast ble isolert ved hjelp av protokollen beskrevet her. (B) Kloroplaster ble isolert fra villtype N. benthamiana blader og farget med CFDA, som fluoresces bare inne intakte, levedyktige kloroplaster (vist i gult). (C) kloroplaster kan også isoleres fra andre plantearter, slik som spinat (S. oleracea), og deretter farget med cfda (gul). Klorofyll autofluorescence vises i rødt. Modifisert fra Brunkard et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved å undersøke stromules, må tre viktige faktorer tas i betraktning i hele: (i) manipulering av plantevevet må holdes på et absolutt minimum, (ii) det eksperimentelle system må holdes konsekvent, og (iii) prøvetakings strategier må være nøye planlagt sikre robust, er reproduserbare data analysert.
Stromules er bemerkelsesverdig dynamisk: de kan utvide og trekke seg raskt før en observatør øyne under mikroskop. Videre stromule frekvens varierer betydelig som reaksjon på en rekke behandlinger, inkludert stimuli som ikke kan unngås for å visualisere stromules (for eksempel blad såret). Den primære løsning på dette problemet, som er adressert med protokollen beskrevet her, er å utføre godt kontrollerte eksperimenter, holder alle variabler konsekvent. Dette inkluderer for eksempel å forberede hver prøve for visualisering umiddelbart før bringe den til mikroskopet; planter bør ikke være skadettil like før visualisering. Den andre løsning på dette problemet er å minimalisere kompleksiteten av protokoller: ideelt sett bør noen behandlinger påføres direkte på planten uten å fjerne bladet eller forårsake noen skade.
Stromules har blitt studert i en svimlende rekke arter og celletyper, inkludert hvete rothår, tomat frukt og etiolated tobakk frøplanter 8,19. Disse banebrytende studier avansert forståelse av stromule dynamikk under planteutvikling og utforsket området stromule aktivitet. Tegning sammenligninger fra disse forskjellige eksperimentelle systemer, kan imidlertid føre til feiltolkninger, ettersom ulike typer av plastider er involvert i betydelig forskjellige biologiske prosesser.
For eksempel, kloroplaster gjøre stromules som reaksjon på oksidativt stress forårsaket av den fotoelektron kjeden, men ettersom leucoplasts mangler foto maskineri, de er ikke følsomme overforsamme stimuli 9. Enhver eksperimentelt system kan anvendes for å undersøke stromules, men det eksperimentelle system må holdes konsekvent gjennom hele studien hvis eventuelle sammenligninger som skal trekkes. Faktorer å vurdere omfatter arter, celletype, utviklingsstadiet eller alder av anlegget, og metoden for farging stromules (enten gjennom stabil transgene uttrykk, forbigående transgene uttrykk, eller en ekstern fluorophore); selv små variasjoner av disse faktorer kan forvirre senere tolkning av resultater.
Til slutt må enhver studie av stromule biologi bruke en robust, pålitelig prøvetakingsstrategi for å sikre at resultatene er reproduserbare og biologisk relevant. Sampling gjentatte ganger fra en enkelt plante, for eksempel, å ta bilder fra flere regioner i ett blad, vil tilsynelatende bedre statistisk styrke, men kan være misvisende. Som vist i de representative data ovenfor, kan stromule frekvensen for en enkelt blad varierer betydelig fra den midlere frekvens stromulepå tvers av mange blader: i det blad, som ble visualisert i løpet av dagen, 37,9% av kloroplaster laget stromules, selv om den midlere stromule frekvens over bladene i løpet av dagen var nesten halvparten, bare 20,8%.
Dessuten, gitt hvor lite er kjent om stromule dynamikk på denne tiden, bør enhver eksperiment være helt kopiert minst tre ganger, og mer hvis det er mulig, for å sikre at uforutsette variabler er ikke ansvarlig for eventuelle endringer i stromule aktivitet som er observert. Fremfor alt annet, siden stromule biologi feltet er akkurat begynt å ta av, forskere bør nøye dokumentere og rapportere alle aspekter av eksperimentell design, inkludert kreative avvik fra enkel protokoll skissert her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
- Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
- Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
- Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
- Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926 (2012).
- Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
- Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
- Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
- Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
- Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
- Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
- Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
- Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
- Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
- Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).
- Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).
- Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
- Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).
- Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
- Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).
