Protocol
הערה: עבור פרוטוקול זה, התמקדנו מנסה לאמוד תדירות stromule באפידרמיס של נ benthamiana משאיר. כמה שורות מהונדסות יציבות נוצרו, שניתן להשתמש בם למטרה זו, כולל 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 ו NRIP1: 6 Cerulean. שתי שורות אלה מראים ביטוי חזק של fluorophores ב stroma הכלורופלסט של עלים גדלו תחת מגוון רחב של מצבים. לחלופין, fluorophores במיקוד הכלורופלסט עשוי לבוא לידי ביטוי זמני ב נ benthamiana באמצעות Agrobacterium טרנספורמציות 13. זהו פחות אידילי הקווים המהונדסים, מאז חדירות Agrobacterium להשרות כמה תגובות הגנה בסיסיות ב נ benthamiana ואינטראקציות עם Agrobacterium יכול לשנות תדר stromule ב עלה 14, פוטנציאל סיבוך הפרשנות של התוצאות. לבסוף, כדי לחזות היווצרות stromule במבחנה,כלורופלסטים עשוי להיות מופק כל מיני צמחים, באף אחת fluorophores מקודד גנטית או פלורסנט לצבוע, כמפורט בסעיף 5 להלן. 9,15
הערה:. שיטות מפורטות לגידול צמחים תוארו בעבר 16 בקצרה, לגדול נ benthamiana צמחי 4 "סירים מלאים כל תערובת אדמה מקצועית המספקת ניקוז טוב. מכסים שתילים עם כיפת פלסטיק שקופה עבור 10-14 הימים הראשונים לספק סביבה לחה עבור נביטה. להוסיף שום תערובת דשן סטנדרטית הבאים בהוראות היצרן לגבי 14- צמחים בני יומם. לגדל צמחים תחת אור לבן, באמצעות ~ 100 μmol פוטונים מ -2 שניות -1 עוצמת האור. צמחי מים באופן קבוע.
1. דוגמאות ליף הכנות לקראת ויזואליזציה
הערה: דינמיקת Stromule מושפעת ופצע 8, כך הכנת רקמה צריכה להתנהל באופן מיידי לפני חזותי stromuleים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. באופן אידיאלי, מדגם צריך להיות מדמיין עם 15 דקות לאחר הסרה מהמפעל.
- גזור קטע קטן של העלה באמצעות סכין גילוח חד מאוד. השתמש תמיד באותו אזור של העלה לעקביות, ולהיות בטוח לדמיין אותו משטח (adaxial או abaxial) בכל הניסויים.
- מייד לאחר חיתוך החלק עלה, להטביע את הסעיף עלה ב מזרק מחטי 5 מיליליטר מלא מים, להסיר אוויר מן המזרק, ולהחיל ואקום על ידי כיסוי פתח המזרק עם אצבע ומושך את הבוכנה.
- שחרר את הבוכנה בעדינות כדי למנוע נזק בסעיף עלה. חזור על שתיים או שלוש פעמים, או עד שרוב באוויר הוסר ואת העלה שנראה ירוק עמוק.
הערה: צעד זה מסיר האוויר עלה כי יכול להפריע הדמיה מדויקת של stromules.
- שחרר את הבוכנה בעדינות כדי למנוע נזק בסעיף עלה. חזור על שתיים או שלוש פעמים, או עד שרוב באוויר הוסר ואת העלה שנראה ירוק עמוק.
- הוסף טיפה של מים לשקופית ומקום הסעיף עלה על ירידה זו. לאחר מכן, להוסיף עוד drאופ של מים לחלק העליון של העלה, במקום להחליק כיסוי על העלה. אם יש בועות אוויר, לטפוח בעדינות להחליק את המכסה עד שהם יוסרו. השקופית מוכנה כעת מיקרוסקופיה, וצריכה להיות מדמיין מייד.
2. חזותי Stromules עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי Confocal
- עם אור מסור, להתמקד שדה הראייה סמוך למרכז בסעיף עלה (מן התאים שנפגעו סכין גילוח). השתמש אובייקטיבי 20X כך כלורופלסטים רבים ניתן דמיינו בו זמנית. שמירת תמונה עם האור המועבר כך סוגי תאים ניתן להבחין לאחר מכן, במידת הצורך.
- החלף את מקור התאורה כדי ליזר עם מסנני עירור ופליטה מתאימים להיות השתמש fluorophore. לדוגמה, לרגש GFP עם לייזר 488 ננומטר ולאסוף פליטת בין 500 ננומטר ו 525 ננומטר.
- שימוש של תוכנת מיקרוסקופ, בחרו בערוץ GFP ולחץ להתאים את הצמצם חריר עד 1 Aiיחידת ר"י. בחר סריקת לייזר, להתחיל לדמיין את המדגם, ולאחר מכן לחץ על ערוץ ה- GFP כדי להתאים את עוצמת הלייזר ואת רווח גלאי כדי למזער את כוח לייזר תוך ביטוי חזותי stromules בבירור. לאחר הגדרות אלה נקבעו, לשמור אותם עקביים ככל האפשר לאורך כל הניסויים.
- כן ניסוי z -stack כי יאסוף סדרה של תמונות דרך האפידרמיס עלה ב שדה הראייה.
- עבור z -stack, לכלול את כל כלורופלסטים אפידרמיס בתחום במטרה למנוע הטיה (למשל, אם כלורופלסטים קרובים לפני השטח עלה יש יותר stromules בתנאים הנבדקים).
- צלמו תמונות על מקסימום מרווח אפשרי שיכלול את כל stromules אבל למזער את הזמן הנדרש עבור -stack z. לדוגמא, אם 1 היחידה אוורירית שווה קטע confocal פוקוס כי הוא 2 מיקרומטר עמוק, לוקח תמונה כל 2 מיקרומטר הוא אידיאלי סביר.
הערה: עלה epidermiהים הוא משטח אחיד, כך לעומק הכולל של z -stack ישתנה בהתאם המדגם; z ביותר -stacks ידרוש 10-20 תמונות, אך עשוי לכלול יותר. - התאם את מהירות סריקה רזולוציית התמונה לפי הצורך כדי לוודא כי -stack z נאסף במהירות (בדרך כלל תוך 5-10 דקות, אם אפשר). שמור את z -stack לצורך ניתוח מאוחר יותר.
עיבוד תמונה 3.
- לקבוע תדירות stromule באמצעות כל תוכנת ניתוח תמונה. עבור פרוטוקול זה, אנו ממליצים להשתמש ImageJ, אשר זמין בפומבי מן המכונים הלאומיים לבריאות (http://imagej.nih.gov/ij/), או שדרוג הפופולרי של ImageJ, פיג'י (http://fiji.sc / פיג'י).
- מזג את z -stack לתוך תמונה אחת באמצעות הקרנת העוצמה המרבית בתוכנה.
- לזהות באופן ידני לספור את כל כלורופלסטים בתמונה.
- עבור כל הכלורופלסט, ויזואלית לקבוע אם stromules אחד או יותרנראים המשתרעת הכלורופלסט בתמונה -stack z הממוזגת. לדוגמאות, ראה איור 1.
הערה: מאז התפקודים הביולוגיים של stromules אינם ידועים, כל דקה, מלא stroma, רחבת צינורי מן הכלורופלסט יכולה להיחשב "stromule", ללא קשר לאורך. ככלל, סיומת מלא stroma מן הכלורופלסט הוא stromule אם הוא פחות מ כ 1 מיקרומטר קוטר לאורך רוב אורכו 7. ודא כי אדם אחד מנתח את כל התמונות כדי לשלוט על ההבדלים סובייקטיבית בקביעה האם או לא הכלורופלסט יש stromule. חוקר שני צריך לאמת את תדרי stromule עצמאי לצמצם הטיות סובייקטיביות נוספת.
4. עיצוב ניסיוני דגימה
הערה: תדירות Stromule הוא משתנה מאוד בין העלים, אבל כמה דיווחים מראים כי יש וריאציה מעט בתדירות stromule בתוך indivi9,17 עלו כפולים.
- חשב את התדירות עלה stromule של שדה יחיד מבט של עלה אחד. מחק את העלה, ולשקול את זה מדגם עצמאי. אל תחשבו שדות נפרדים של נוף נשקף עלה אחד כמו דגימות עצמאיות.
הערה: אין הסכמה מוצקה לגבי כיצד שינויי המדד הטובים ביותר בפעילות stromule, ועד הפונקציה של stromules מוגדר בצורה ברורה יותר, חוקרים צריכים להמשיך להיות יצירתיים בכימות דינמיקת stromule. לשם השוואה על פני הספרות, לעומת זאת, סטנדרטים משותפים של דיווח אמורים לשמש בנוסף גישות יצירתיות יותר. לכל הפחות, תמיד לדווח על תדירות כלורופלסטים שיש אחד או יותר stromules. - מהי התדירות של כלורופלסטים שיש stromules בתוך שדה הראייה. השתמש ImageJ לזהות כל כלורופלסטים בתוך שדה הראייה. לאחר מכן, עבור כל הכלורופלסט, לקבוע אם הכלורופלסט יצר לפחות stromule אחד. דווח תדירות stromule כמו percentaGE של כלורופלסטים עם stromule.
הערה: יש חוקרים להפוך האחוז, למשל עם שינוי arcsine, לפני דיווח תדרי stromule; בזמן הזה הוא אופציה לניתוח סטטיסטי, הארק-סינוס של תדר stromule אינו ערך אינטואיטיבי, ואינו צריך להיות מדווח בטקסט או הדמויות המרכזיות של המחקר.- כגישה חלופית, לספור את המספר הכולל של stromules, ומחלקים אותו במספר הכולל של כלורופלסטים.
הערה: ברוב המקרים, זו תניב תוצאות דומות להתקרב 4.2; זה יכול להעריך את תדירות stromule, אולם אם היה הכלורופלסט יחיד יצר רבי stromules. בדוגמה המוצגת תחת תוצאות נציג, למשל, כמה יש כלורופלסטים שניים או יותר stromules, העלאת מספר stromules לכל הכלורופלסט כדי 40/87 (לעומת תדר stromule של 33/87). - לחלופין, לקבוע את אורך stromule במקום תדירות stromule. אורך ניתן למדודב ImageJ ידי התחקות stromule עם כלי שורת ביד חופשית.
הערה: מאז התפקיד הביולוגי של stromules נותר עלום, לא ברור כי אורך stromule משפיע על התפקוד שלהם. דווח הבדלים משמעותיים באורך stromule אם הם נצפו, אלא גם לדווח על תדרי stromule (כמתואר 4.2).
הערה: תדירות Stromule יכולה להיות משתנה מאוד בין עלים שונים באותם התנאים לצמיחה. לכן, על אף קביעת תדירות stromule יכול להימשך זמן רב, ניסויים צריכים להיות מתוכננים בקפידה על מנת לכלול מדגמים גדולים. באמצעות מערכי נתונים מהמעבדה שלנו, קבענו כי גודל מדגם של 16 צמחים לפחות עבור כל טיפול הוא בדרך כלל חזק מספיק כדי לקבוע אם קיים הבדל מובהק סטטיסטי של לפחות שינוי פי 1.5 בתדירויות stromule בין שני תנאים (עם תקן α = 0.05 ו β = 0.80).
- כגישה חלופית, לספור את המספר הכולל של stromules, ומחלקים אותו במספר הכולל של כלורופלסטים.
- ניתוח סטטיסטי של תוצאות.
- כדי להשוות את ליתדרי stromule של שני טיפולים, להשתמש במבחן t של וולש (הידוע גם בשם מבחן t בדיקה או לא heteroscedastic בהנחה שונה שוויוני).
הערה: בדיקה זו אינה חזקה כמו מבחן t של הסטודנט הקונבנציונלי, אבל מבחן t של וולש יש יתרון משום שהוא אינו מניח ששונות חלוקת תדר stromule דומות בין טיפולים.
הערה: מאז תדירות stromule היא "פרופורציה", חלוקת הדגימה שלו צפויה להיות הבינומי ולא נורמלי, אשר יכולים באופן תיאורטי ניתוח סטטיסטי מלוכסן אם מדגמים נמוכים מאוד או אם תדירות stromule היא נמוכה מאוד (קרובה ל 0%) או מאוד גבוה (קרוב ל -100%). כמה דיווחים השתמשו טרנספורמציות arcsine לפני ניתוח סטטיסטי, אשר נועד להפוך התפלגות הבינומית על התפלגות נורמלית, ובכך לספק את דרישות תקן של מבחן t של סטודנט או ANOVA. בפועל, עם זאת,יש טרנספורמציות rcsine מעט או אין השפעה על ניתוח סטטיסטי, ולכן אינם מומלצים. במקום זאת, לחזור על ניסויים כדי להגדיל את גודל המדגם, אשר יגדיל כוח סטטיסטי ולהפחית טעויות בפרשנות של נתונים. - לא משנה מה משמש גישה סטטיסטית, הקפד לדווח על אסטרטגית הדגימה בזהירות, גודל מדגם, בדיקה סטטיסטית, וערך p עבור כל ניסוי.
הערה: כמו עם שדות אחרים של ביולוגיה, ערך p פחות מ 0.05 עשוי להיחשב "מובהק סטטיסטי", אם כי חוקרים בהחלט צריכים לדווח על ערך p המדויק שהושג. אם p הוא מעט מעל 0.05, הגדלת גודל המדגם עם ניסויים שניים או שלושה יכול לעזור לברר אם או לא ההבדל שנצפה ניתן לשחזור ומובהק.
- כדי להשוות את ליתדרי stromule של שני טיפולים, להשתמש במבחן t של וולש (הידוע גם בשם מבחן t בדיקה או לא heteroscedastic בהנחה שונה שוויוני).
5. מחלץ כלורופלסטים Intact לדמיין Stromule Dynamics
הערה: מספר שיטותשמש לבודד כלורופלסטים מעלים, כולל פרוטוקול שונה במקצת במחקר שנערך לאחרונה על היווצרות stromule במבחנה 15. הפרוטוקול כמפורט להלן משתמש בשיטה פשוטה יחסית שאינו להניב דגימות הכלורופלסט טהורות מבחינה ביוכימית, אך במקום לבודד כמות גדולה של שלמים, כלורופלסטים בריאים 9,18.
- הכן חיץ מיצוי קר: 50 מ"מ Hepes NaOH, 330 סורביטול מ"מ, 2 מ"מ EDTA, 1.0 מ"מ MgCl 2 ו -1.0 מ"מ MnCl 2. התאם את ה- pH 6.9 עם NaOH ו HCl, ושומרים במקרר לפני השימוש.
הערה: אמנם לא הכרחי, באמצעות מאגרים קר ושמירה על דגימות קרח במידת האפשר תניב שיעור גבוה יותר של כלורופלסטים ללא פגע. - הכן חיץ בידוד: 50 מ"מ Hepes NaOH, 330 סורביטול מ"מ, 2 מ"מ EDTA, 1.0 מ"מ MnCl 2, 1.0 מ"מ MgCl 2, 10 mM KCl, ו 1.0 מ"מ NaCl. התאם את ה- pH ל -7.6 עם NaOH ו HCl ושומרים במקרר לפני השימוש.
- אם העלים אינםהבעת fluorophore סטרומה מקודדים גנטית, להכין diacetate carboxyfluorescein פתרון (CFDA): 50 מניות פתרון מ"מ CFDA ב sulfoxide דימתיל (DMSO) (CFDA 2.3 מ"ג 1.0 מ"ל DMSO).
הערה: הריכוז המדויק אינו קריטי. שמור מניות CFDA בחושך בכל העת. אחסן aliquots קטן של 50 מ"מ CFDA ב -20 ° C. - כדי לבודד כלורופלסטים, להסיר ~ 5-10 עלים גרם מכמה צמחים ולשטוף בקצרה במים קרים. מיד להעביר 50 מ"ל מיצוי חיץ קר. עלים טוחנים באמצעות בלנדר עם כמה פולסים קצרים. סינון דרך שתיים או שלוש שכבות של גזה כדי להסיר שאריות עלים, לחלק את כלורופלסטים חילוץ לשתי צינורות 50 מ"ל צנטריפוגות, צנטריפוגות דקות 1 ב g x 750.
- בטל supernatant ו resuspend כלורופלסטים ירוק חיץ בידוד 10 מ"ל. צנטריפוגה שוב 1 דקות ב 750 XG, להשליך supernatant, כלורופלסטים resuspend במאגר בידוד להביא נפח סופי 5 מ"ל.
- העברת 201; l של כלורופלסטים לשקופית, ומכסים coverslip, ולהתחיל מיקרוסקופיה.
הערה: כלורופלסטים מצמחים מהונדסים המבטא חלבוני ניאון במיקוד פלסטידה מוכנים כעת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. - כתם כלורופלסטים מצמחים שאינם להביע חלבוני ניאון במיקוד פלסטידה לדמיין stromules.
- הוסף 5 μl של 50 המניות מ"מ CFDA אל 5 מ"ל-מושעה כלורופלסטים חיץ בידוד. תביא את הריכוז הסופי 50 מיקרומטר.
- אפשר כלורופלסטים כדי לדגור במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר aliquot קטן (~ 50 μl) לשקופית, ומכסים coverslip, ולהתחיל מיקרוסקופיה.
- להשתמש במערך מסנן FITC או GFP. השתמש אובייקטיבי 20X לדמיין כלורופלסטים רבים בעת ובעונה אחת, או מטרה גבוהה יותר לדמיין הכלורופלסט יחיד מבודד.
הערה: CFDA יהיה לזרוח בתוך stroma של כלורופלסטים ללא פגע. - אם יש קרינת רקע חזקה, לשטוף את Chloroplasts שוב ב 10 חיץ מ"ל בידוד לאחר הדגירה 5 דקות עם CFDA, צנטריפוגות במשך 1 דקות ב 750 XG, להשליך supernatant, ו resuspend במאגר בידוד 5 מ"ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה שימש כדי להמחיש תדירות stromule ביום ובלילה של cotyledons של נ צעירים שתילי benthamiana. פרוסות מתוך ערימת z- מוזגו לתוך תמונה אחת (איור 1 א). למטרות חזותיות, הדימוי הזה היה אז desaturated ונהפך, כך stroma מופיע שחור (איור 1B). כלורופלסטים תויגו גם כחסר stromules (כוכבית ירוקה) או שיש לפחות אחד stromule (כוכבית מגנט). 87 כלורופלסטים אפידרמיס דמיינו, 33 יש stromules. לפיכך, תדר stromule ב עלה זה 37.9%.
באמצעות ניתוח זה, הפרוטוקול חזר על עצמו במשך 21 צמחים אחרים (עלה אחד בכל צמח) במהלך היום וכן סך של 24 צמחים בלילה. באותו היום, תדירות stromule הממוצעת הייתה 20.8 ± 1.8%; בלילה, תדירות stromule הממוצעת הייתה 12.8 ± 0.9% (איור2). תדירות Stromule הייתה גבוהה משמעותי במהלך היום, כפי שנקבע על ידי מבחן t של וולש (n ≥ 22, p <0.0005). שימו לב שלמרות מעל 23,000 כלורופלסטים וכמה מאות תאים נצפו, גודל המדגם, n, הוא כפי שדווחו 22, מספר צמחים העצמאיים בחן.
באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, stromules הכלורופלסט נצפה במבחנה לאחר במנותק מן העלים של נ benthamiana להביע GFP במיקוד פלסטידה (איור 3 א), או לאחר שימוש CFDA להכתים כלורופלסטים מבודדים נ benthamiana (איור 3B) או oleracea Spinacia (איור 3 ג).
באיור 1. כימות תדירות stromule ב נ benthעלי amiana. (א) z -stack מתוך שדה חלקית מבט של האפידרמיס של נ benthamiana להביע סטרומה GFP מוזגה להראות כל כלורופלסטים אפידרמיס stromules בתמונה אחת. (ב) תמונה זו הוסבה שחורה ולבן הפוך למטרות חזותיות. כלורופלסטים עם stromules מסומנים על ידי כוכבית מגנט; כלורופלסטים ללא stromules מסומנים על ידי כוכבית ירוקה. ברי סולם מייצגים 10 מיקרומטר. שונה מן Brunkard et al. 9 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. השוואת תדר stromule פני התנאים. פרוטוקול זה שימש כדי לקבוע את strתדירות omule ב -22 מפעלים היום ו -24 צמחים בלילה. תדירות Stromule היה גבוה משמעותית במשך היום מאשר בלילה (מבחן t של וולש, n ≥ 22, p <0.0005). ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. שונה מן Brunkard et al. 9 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. חזותי stromules לאחר חילוץ כלורופלסטים ללא פגע מן העלים. (א) כלורופלסטים מ נ מהונדס benthamiana משאיר הביע GFP (ירוק) ממוקד הכלורופלסט בודד באמצעות הפרוטוקולים המתואר כאן. (ב) כלורופלסטים בודדו נ wild-type benthamiana עלים מוכתם CFDA, אשר fluoresces רק בתוך שלמים, כלורופלסטים קיימא (בצבע צהוב). (C) כלורופלסטים ניתן לבודד גם מיני צמחים אחרים, כמו תרד (ס oleracea), ולאחר מכן מוכתם CFDA (צהוב). autofluorescence כלורופיל מוצג באדום. שונה מן Brunkard et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאשר חוקרים stromules, שלושה גורמים חשובים חייבים להיחשב לכל אורכו: (i) מניפולציה של רקמות הצמח חייב להישמר עד למינימום הכרחי, (ii) מערכת הניסוי חייבת להישמר עקבית, וכן (iii) אסטרטגיות דגימה חייבות להיות מתוכננות בקפידה כדי להבטיח חזק, מנותחי נתונים לשחזור.
Stromules להפליא דינמי: הם יכולים להאריך לסגת במהירות לנגד עיניו של משקיף תחת מיקרוסקופ. יתר על כן, תדירות stromule משתנית באופן משמעותי בתגובת מגוון רחב של טיפולים, כולל גירויים כי לא ניתן להימנע מכך על מנת להמחיש stromules (כגון פציעת עלה). הפתרון העיקרי לבעיה זו, המופנית עם הפרוטוקולים המתואר כאן, הוא לערוך ניסויים מבוקרים היטב, שמירה על כל המשתנים עקביים. זה כולל, למשל, הכנת כל דגימה להדמיה מיד לפני ולהבאתו המיקרוסקופ; צמחים לא צריכים להיפגעועד סמוך לפני להדמיה. הפתרון השני לבעיה זו היא למזער את המורכבות של פרוטוקולים: באופן אידיאלי, כל הטיפולים צריך להיות מיושם ישירות למפעל מבלי להסיר את העלים או גרימת כל נזק.
Stromules נחקרו מערך מסחרר של מינים וסוגים התא, כולל שערות חיטה שורש, פירות עגבניות, ושתילים טבק מולבן 8,19. המחקרים החלוציים אלה קידמו את הבנת הדינמיקה stromule במהלך התפתחות הצמח וחקרו את טווח הפעילות stromule. בהסתמכו על השוואות ממערכות ניסיוניות השונות אלה, לעומת זאת, יכול להוביל פרשנויות מוטעות, מאז סוגים שונים של plastids מעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים באופן משמעותי.
לדוגמה, כלורופלסטים לעשות stromules בתגובה סטרס חמצוני שנגרם על ידי שרשרת אלקטרונים פוטוסינתטיים, אבל מאז leucoplasts חסרים את מכונות פוטוסינתטיים, הם אינם רגישיםבאותו גירויים 9. כל מערכת ניסיונית ניתן להשתמש כדי לחקור stromules, אבל המערכת הניסיונית חייבת להישמר עקבית לאורך כל תקופת המחקר אם השוואות בכלל הם להיגרר. גורמים שיש לשקול כוללים מינים, סוג תא, שלב התפתחותי או גיל הצמח, ושיטת stromules המכתים (אם באמצעות ביטוי transgene יציב, ביטוי transgene חולף, או fluorophore חיצוני); אפילו שינויים קלים של גורמים אלה יכולים לבלבל פרשנות מאוחרת יותר של תוצאות.
לבסוף, בכל מחקר של ביולוגית stromule חייב להשתמש באסטרטגית דגימה חזקה, אמינה כדי להבטיח כי תוצאות הן לשחזור ביולוגי רלוונטיים. דגימה שוב ושוב מצמח יחיד, למשל, לקחת תמונות מכמה אזורים של עלה אחד, כנראה תשפר כוח סטטיסטי, אבל יכולה להיות מטעה. כפי שניתן לראות בנתוני הנציג לעיל, תדירות stromule של עלה בודד עשויה להשתנות באופן דראמטי מתדירות stromule הממוצעתפני דפים רבים: ב עלה כי, אשר היה דמיין במהלך היום, 37.9% של כלורופלסטים עשו stromules, למרות תדירות stromule הממוצעת על פני עלים במהלך היום הייתה כמעט חצי מזה, רק 20.8%.
יתר על כן, בהתחשב כמה מעט מאוד ידוע על דינמיקת stromule בשלב זה, כל ניסוי צריך להיות משוכפל לחלוטין לפחות שלוש פעמים, ועוד אם אפשר, כדי להבטיח כי משתנה בלתי צפוי אינם אחראים כל שינוי בפעילות stromule כי הם נצפו. מעל לכל דבר אחר, שכן בתחום הביולוגיה stromule רק מתחיל להמריא, החוקרים צריכים לתעד בקפידה ולדווח על כל ההיבטים של תכנון הניסוי, כולל סטיות יצירתיים מן הפרוטוקול פשוט המפורטים כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
- Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
- Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
- Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
- Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926 (2012).
- Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
- Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
- Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
- Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
- Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
- Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
- Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
- Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
- Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
- Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).
- Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).
- Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
- Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).
- Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
- Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).
