Protocol
NOTA: per questo protocollo, si sono concentrati sulla analizzando frequenza stromule nell'epidermide di N. benthamiana lascia. Diverse linee transgeniche stabili sono stati generati che può essere utilizzato per questo scopo, tra cui 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 e NRIP1: Cerulean 6. Entrambe queste linee mostrano robusta espressione di fluorofori nello stroma dei cloroplasti delle foglie cresciute in un'ampia gamma di condizioni. In alternativa, fluorofori cloroplasti mirati possono essere transitoriamente espressi in N. benthamiana utilizzando Agrobacterium trasformazioni 13. Questo è meno ideale che le linee transgeniche, dal momento che le infiltrazioni tumefaciens inducono alcune risposte di difesa basali in N. benthamiana e le interazioni con Agrobacterium possono alterare la frequenza stromule nella foglia 14, potenzialmente complicando l'interpretazione dei risultati. Infine, di visualizzare formazione stromule in vitro,cloroplasti possono essere estratti da tutte le specie vegetali, utilizzando sia fluorofori geneticamente codificati o un colorante fluorescente, come descritto nella sezione 5 di seguito. 9,15
NOTA:. Metodi dettagliati per la coltivazione delle piante sono stati precedentemente descritti 16 In breve, crescere N. piante benthamiana in 4 vasi "riempite con qualsiasi miscela di suolo professionale che fornisce un buon drenaggio. Rivestimento piantine con una cupola di plastica per i primi 10-14 giorni di tempo per fornire un ambiente umido per la germinazione. aggiungere qualsiasi combinazione di fertilizzanti di serie seguendo le istruzioni del produttore per 14- giorno-vecchi impianti. crescere le piante sotto la luce bianca, con ~ 100 micromol fotoni m -2 sec -1 intensità della luce. piante acquatiche regolarmente.
1. Preparazione campioni di foglie per la visualizzazione
NOTA: le dinamiche Stromule sono influenzati da ferendo 8, in modo preparazione dei tessuti deve essere condotta immediatamente prima della visualizzazione stromules mediante microscopia confocale. Idealmente, un campione deve essere visualizzato con 15 min dopo la rimozione dalla pianta.
- Tagliare una piccola sezione della foglia con una lama di rasoio molto tagliente. Utilizzare sempre la stessa regione della foglia di coerenza, ed essere certi di visualizzare la stessa superficie (adaxial o abaxial) in tutti gli esperimenti.
- Subito dopo il taglio della sezione di foglia, immergere la sezione foglia in una siringa da 5 ml senza ago riempita con acqua, rimuovere l'aria dalla siringa, e applicare un vuoto coprendo l'orifizio siringa con un dito e tirando lo stantuffo.
- Rilasciare lo stantuffo delicatamente per evitare di danneggiare la sezione di foglia. Ripetere questo due o tre volte, o fino a quando la maggior parte dell'aria è stato rimosso e la foglia sembra essere verde intenso.
NOTA: Questo passaggio rimuove l'aria nella foglia che può interferire con accurata visualizzazione dei stromules.
- Rilasciare lo stantuffo delicatamente per evitare di danneggiare la sezione di foglia. Ripetere questo due o tre volte, o fino a quando la maggior parte dell'aria è stato rimosso e la foglia sembra essere verde intenso.
- Aggiungere una goccia d'acqua su un vetrino e posizionare la sezione foglia su questo calo. Quindi, aggiungere un altro drop di acqua all'inizio della foglia, e posizionare un vetrino sulla foglia. Se ci sono bolle d'aria, toccare delicatamente il vetrino fino a quando non vengono rimossi. Il vetrino è ora pronto per la microscopia, e dovrebbe essere visualizzato immediatamente.
2. Visualizing Stromules con confocale microscopia a fluorescenza
- Con luce trasmessa, concentrarsi su un campo di vista vicino al centro della sezione del foglio (lontano dalle cellule danneggiate dalla lama di rasoio). Utilizzare un obiettivo 20X modo che molti cloroplasti possono essere visualizzate contemporaneamente. Salvare un'immagine con luce trasmessa in modo che i tipi di cellule possono essere distinti in seguito, se necessario.
- Commutare la sorgente di illuminazione a un laser con opportuni filtri di eccitazione ed emissione per il fluoroforo utilizzato. Ad esempio, eccitare GFP con un laser 488 nm e raccogliere emissioni tra 500 nm e 525 nm.
- Utilizzando il software del microscopio, selezionare il canale GFP e fare clic per regolare l'apertura a foro stenopeico al 1 Aiunità ry. Selezionare scansione laser, per avviare la visualizzazione del campione, e quindi fare clic sul canale GFP per regolare l'intensità del laser e il guadagno del rivelatore per ridurre al minimo la potenza del laser, mentre ancora la visualizzazione chiaramente stromules. Una volta che queste impostazioni sono state determinate, tenerli il più coerente possibile in tutti gli esperimenti.
- Preparare un esperimento impili z che raccoglierà una serie di immagini attraverso l'epidermide foglia nel campo visivo.
- Per la z impili, includere tutti cloroplasti epidermiche nel campo di vista per evitare distorsioni (per esempio, se cloroplasti vicino alla superficie del foglio hanno più stromules in condizioni testate).
- Prendere immagini a l'intervallo massimo possibile che includerà tutti stromules ma ridurre al minimo il tempo necessario per una z impili. Ad esempio, se 1 unità Airy è equivalente ad una sezione confocale a fuoco che è 2 micron profondo, riprendere un'immagine ogni 2 micron è probabile ideale.
NOTA: Il epidermi foglias è una superficie irregolare, per cui la profondità totale del z impili varierà a seconda del campione; la maggior parte -Pile z richiederanno 10-20 immagini, ma possono includere più. - Regolare la velocità di scansione e risoluzione dell'immagine come necessario per assicurarsi che la z impili viene raccolto rapidamente (tipicamente entro 5-10 min, se possibile). Salvare la z impili per una successiva analisi.
Processing 3. Immagine
- Determinare la frequenza stromule utilizzando qualsiasi software di analisi delle immagini. Per questo protocollo, si consiglia di utilizzare ImageJ, che è a disposizione del pubblico dal National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), o l'aggiornamento popolare di ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji).
- Unire la z impili in un'unica immagine utilizzando la sporgenza massima intensità nel software.
- Identificare e contare manualmente tutti i cloroplasti nell'immagine.
- Per ogni cloroplasto, determinare visivamente se uno o più stromulessono visti che si estende dal cloroplasto in immagine z unito impili. Per esempi, vedi Figura 1.
NOTA: Poiché le funzioni biologiche di stromules non sono noti, ogni, stroma-riempite, prolungamento tubolare sottile dal cloroplasto può essere considerato un "stromule", indipendentemente dalla lunghezza. Come regola generale, un'estensione stroma-riempita dal cloroplasto è un stromule se è inferiore a circa 1 micron di diametro lungo la maggior parte della sua lunghezza 7. Assicurarsi che una persona analizza tutte le immagini per controllare le differenze soggettive nel determinare se un cloroplasto ha un stromule. Un secondo ricercatore deve verificare in modo indipendente le frequenze stromule per ridurre ulteriormente pregiudizi soggettivi.
4. Disegno sperimentale e campionamento
NOTA: Stromule frequenza è molto variabile tra le foglie, ma diversi rapporti suggeriscono che c'è una piccola variazione nella frequenza stromule all'interno di un individuale 9,17 foglia.
- Calcolare la frequenza foglio stromule da un unico campo di vista di una foglia. Eliminare la foglia, e considerare questo un campione indipendente. Non considerare campi separati di vista da una foglia come campioni indipendenti.
NOTA: Non vi è ampio consenso sul modo migliore di misurare le variazioni nell'attività stromule, e fino a quando la funzione di stromules è più chiaramente definito, i ricercatori dovrebbero continuare ad essere creativi nel quantificare la dinamica stromule. Per fare un confronto tra letteratura, tuttavia, norme comuni di segnalazione devono essere utilizzati in aggiunta agli approcci più creativi. Come minimo, segnalare sempre la frequenza di cloroplasti che hanno uno o più stromules. - Determinare la frequenza dei cloroplasti che hanno stromules in un campo di vista. Utilizzare ImageJ per identificare tutti i cloroplasti in un campo di vista. Quindi, per ogni cloroplasto, determinare se il cloroplasto è formato almeno un stromule. Rapporto frequenza stromule come Percentage di cloroplasti con stromule.
NOTA: Alcuni ricercatori trasformano la percentuale, per esempio con la trasformazione arcoseno, prima di riportare le frequenze stromule; Anche se questa è una opzione per l'analisi statistica, l'arcoseno di frequenza di stromule non è un valore intuitivo, e non ha bisogno di essere riportato nel testo principale o figure di uno studio.- Come approccio alternativo, contare il numero totale di stromules, e dividerlo per il numero totale di cloroplasti.
NOTA: Nella maggior parte dei casi, questo produrrà risultati simili per avvicinarsi 4.2; può sovrastimare la frequenza stromule, tuttavia, se un solo cloroplasto ha formato molti stromules. Nell'esempio mostrato in risultati rappresentativi, ad esempio, diversi cloroplasti hanno due o più stromules, aumentando il numero di stromules per cloroplasto al 40/87 (rispetto a una frequenza stromule di 33/87). - In alternativa, determinare la lunghezza stromule anziché frequenza stromule. La lunghezza può essere misuratain ImageJ tracciando il stromule con lo strumento linea a mano libera.
NOTA: Dal momento che il ruolo biologico di stromules rimane sconosciuta, non è chiaro che la lunghezza stromule colpisce la loro funzione. Relazione significative differenze di lunghezza stromule se osservati, ma inoltre segnalare le frequenze stromule (come descritto in 4.2).
NOTA: la frequenza Stromule può essere molto variabile tra le foglie diverse alle stesse condizioni di crescita. Pertanto, anche se la determinazione della frequenza stromule può richiedere molto tempo, gli esperimenti devono essere attentamente progettati per includere campioni di grandi dimensioni. Utilizzando set di dati dal nostro laboratorio, abbiamo determinato che un campione di almeno 16 piante per ogni trattamento è di solito sufficientemente potente per determinare se vi è una differenza statisticamente significativa di almeno una variazione di 1,5 volte in frequenza stromule tra due condizioni (con il campione α = 0.05 e β = 0,80).
- Come approccio alternativo, contare il numero totale di stromules, e dividerlo per il numero totale di cloroplasti.
- L'analisi statistica dei risultati.
- Per confrontare il meun frequenze stromule di due trattamenti, utilizzare il test t di Welch (noto anche come il test t test o t heteroscedastic supponendo che la varianza disuguale).
NOTA: Questo test non è potente come test t di Student convenzionale, ma il test t di Welch è vantaggioso perché non si assume che la varianza nella distribuzione di frequenza stromule è simile tra i trattamenti.
NOTA: Dal momento che la frequenza stromule è una "proporzione", la sua distribuzione campionaria è previsto per essere binomio più che normale, che potrebbero analisi statistiche teoricamente skew se le dimensioni del campione sono molto bassi o se la frequenza stromule è molto basso (vicino allo 0%) o molto alta (vicina al 100%). Alcuni report hanno usato trasformazioni arcoseno prima analisi statistiche, che ha lo scopo di trasformare una distribuzione binomiale di una distribuzione normale, e, quindi, di soddisfare i requisiti standard di test t di Student o ANOVA. In pratica, tuttavia, untrasformazioni rcsine hanno poco o nessun effetto sulla analisi statistica, e pertanto non sono raccomandati. Invece, ripetere gli esperimenti di aumentare la dimensione del campione, che consentirà di aumentare la potenza statistica e ridurre gli errori di interpretazione dei dati. - Qualunque sia l'approccio statistico utilizzato, assicurarsi di segnalare con attenzione la strategia di campionamento, la dimensione del campione, test statistico, e il valore di p per ogni esperimento.
NOTA: Come con altri campi della biologia, un valore di p inferiore a 0,05 può essere considerato "statisticamente significativo", anche se i ricercatori dovrebbero certamente riportare il valore p preciso ottenuto. Se p è leggermente superiore a 0.05, aumentando la dimensione del campione con due o tre esperimenti possono aiutare a chiarire se la differenza osservata è riproducibile e statisticamente significativa.
- Per confrontare il meun frequenze stromule di due trattamenti, utilizzare il test t di Welch (noto anche come il test t test o t heteroscedastic supponendo che la varianza disuguale).
5. Estrazione cloroplasti Intact di visualizzare Stromule Dynamics
NOTA: Diversi metodisono stati utilizzati per isolare cloroplasti da foglie, comprendente un protocollo leggermente diverso in un recente studio sulla formazione stromule in vitro 15. Il protocollo descritto di seguito utilizza un metodo relativamente semplice che non cede campioni cloroplasti biochimicamente puri, ma ha invece isolare una grande quantità di intatte, cloroplasti sani 9,18.
- Preparare tampone di estrazione a freddo: 50 mm Hepes NaOH, 330 mm sorbitolo, 2 mM EDTA, 1,0 mm MgCl 2 e 1,0 mm MnCl 2. Regolare il pH a 6,9 con NaOH e HCl, e conservare in frigorifero prima dell'uso.
NOTA: Anche se non è necessario, utilizzando tamponi freddi e mantenere i campioni in ghiaccio, quando possibile, produrrà una percentuale maggiore di cloroplasti intatti. - Preparare buffer di isolamento: 50 mm Hepes NaOH, 330 mm sorbitolo, 2 mM EDTA, 1,0 mm MnCl 2, 1,0 mm MgCl2, 10 mM KCl, e 1,0 mm di NaCl. Regolare il pH a 7,6 con NaOH e HCl e conservare in frigorifero prima dell'uso.
- Se le foglie non sonoesprimendo un fluoroforo stromale geneticamente codificato, preparare carboxyfluorescein diacetato soluzione (CFDA): Soluzione 50 mM CFDA in dimetilsolfossido (DMSO) (2,3 mg CFDA per 1,0 ml DMSO).
NOTA: L'esatta concentrazione non è critica. Mantenere CFDA magazzino al buio in ogni momento. Conservare piccole aliquote di 50 mm CFDA a -20 ° C. - Per isolare cloroplasti, rimuovere ~ 5-10 g di foglie di diverse piante e sciacquare brevemente in acqua fredda. Trasferire immediatamente a 50 ml tampone di estrazione a freddo. foglie Grind utilizzando un frullatore con diversi impulsi brevi. Filtrare su due o tre strati di garza per rimuovere i detriti foglia, dividere i cloroplasti estratti in due 50 ml provette da centrifuga e centrifugare per 1 min a 750 x g.
- Eliminare il surnatante e risospendere le cloroplasti verdi nel buffer di isolamento 10 ml. Centrifugare ancora per 1 min a 750 xg, scartare il surnatante e cloroplasti risospendere in tampone isolamento per portare il volume finale a 5 ml.
- Trasferimento 201, l dei cloroplasti a una diapositiva, coprire con un vetrino, e cominciare la microscopia.
NOTA: cloroplasti da piante transgeniche che esprimono proteine fluorescenti plastid mirati sono ora pronti per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza confocale. - Stain cloroplasti da piante che non esprimono proteine fluorescenti plastid mirati di visualizzare stromules.
- Aggiungere 5 ml di 50 mm CFDA magazzino alle 5 ml cloroplasti-sospese in un tampone di isolamento. Portare la concentrazione finale di 50 mM.
- Consentire cloroplasti di incubare per 5 minuti, e poi trasferire una piccola aliquota (~ 50 ml) a una diapositiva, coprire con un vetrino, e cominciano la microscopia.
- Utilizzare un set di filtri FITC o GFP. Utilizzare un obiettivo 20X di visualizzare molti cloroplasti simultaneamente, o un obiettivo più alto di visualizzare un unico cloroplasto isolato.
NOTA: CFDA sarà fluorescenza all'interno dello stroma dei cloroplasti intatti. - Se vi è una forte fluorescenza di fondo, lavare il chloroplasts di nuovo in 10 ml di tampone di isolamento dopo la 5 min incubazione con CFDA, centrifugare per 1 min a 750 xg, scartare il surnatante, e risospendere in 5 ml di tampone di isolamento.
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Representative Results
Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare la frequenza stromule di giorno e di notte nei cotiledoni di giovane N. piantine benthamiana. Fette da una pila Z sono state fuse in un'unica immagine (Figura 1A). Per scopi visivi, che l'immagine è stata poi desaturata e invertito in modo che appare stroma nero (Figura 1B). I cloroplasti sono stati etichettati o come non avere stromules (asterisco verde) o che hanno almeno un stromule (magenta asterisco). Dei 87 cloroplasti epidermiche visualizzati, 33 hanno stromules. Così, la frequenza stromule in questa foglia è 37,9%.
Utilizzando questa analisi, il protocollo è stato ripetuto per altre 21 piante (una foglia per pianta) durante il giorno e un totale di 24 piante di notte. Nel giorno, la frequenza media stromule era 20,8 ± 1,8%; durante la notte, la frequenza media stromule era 12,8 ± 0,9% (Figura2). Frequenza Stromule era significativamente più alta durante il giorno, come determinato dal test t di Welch (n ≥ 22, p <0,0005). Si noti che sono stati osservati anche oltre 23.000 cloroplasti e diverse centinaia di cellule, la dimensione del campione, n, è riportata in 22, il numero di piante indipendenti esaminato.
Utilizzando il protocollo qui descritto, stromules cloroplasti sono stati osservati in vitro dopo l'isolamento dalle foglie di N. benthamiana esprimendo plastid mirati GFP (figura 3A), o dopo aver usato CFDA a macchia cloroplasti isolati da N. benthamiana (Figura 3B) o Spinacia oleracea (Figura 3C).
Figura 1. Quantificare frequenza stromule in N. Benthfoglie amiana. (A) A z impili da un campo di vista parziale dell'epidermide di N. benthamiana esprimendo stromale GFP è stata fusa per mostrare tutti i cloroplasti epidermiche e stromules in una singola immagine. (B) Questa immagine è stata convertita in bianco e nero e invertita per scopi visivi. Cloroplasti con stromules sono indicati da un asterisco rosso magenta; cloroplasti senza stromules sono indicati da un asterisco verde. Barre di scala rappresentano 10 micron. Modificato da Brunkard et al. 9 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Confronto frequenza stromule tutti condizioni. Questo protocollo è stato utilizzato per determinare la strfrequenza omule in 22 stabilimenti nel corso della giornata e 24 piante di notte. Frequenza Stromule era significativamente più alta durante il giorno che di notte (test t di Welch, n ≥ 22, p <0,0005). Le barre di errore indicano l'errore standard. Modificato da Brunkard et al. 9 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Visualizzazione stromules dopo l'estrazione di cloroplasti intatte dalle foglie. (A) cloroplasti da N. transgenico benthamiana lascia GFP espresso (verde) mirata al cloroplasto sono stati isolati utilizzando i protocolli descritti qui. (B) I cloroplasti sono stati isolati da wild-type N. benthamiana lascia e colorati con CFDA, che fluoresces solo all'interno intatti, cloroplasti vitali (in giallo). (C) cloroplasti possono essere isolati da altre specie vegetali, come spinaci (S. oleracea), e poi colorate con CFDA (giallo). La clorofilla autofluorescenza è mostrato in rosso. Modificato da Brunkard et al. 9
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Discussion
Quando si indaga stromules, tre importanti fattori devono essere considerati durante: (i) la manipolazione del tessuto vegetale deve essere ridotto al minimo, (ii) il sistema sperimentale deve essere mantenuta costante, e (iii) le strategie di campionamento deve essere attentamente pianificata per garantire robusta, i dati vengono analizzati riproducibili.
Stromules sono molto dinamici: possono estendere e ritrarre velocemente davanti agli occhi di un osservatore al microscopio. Inoltre, la frequenza stromule varia significativamente in risposta ad una vasta gamma di trattamenti, tra cui stimoli che non possono essere evitati per visualizzare stromules (come foglia di ferite). La soluzione principale per questo problema, che si rivolge con i protocolli descritti qui, è quello di condurre esperimenti ben controllati, mantenendo tutte le variabili coerente. Questo include, per esempio, la preparazione di ogni campione per la visualizzazione immediatamente prima di portarlo al microscopio; piante non devono essere danneggiatifino a subito prima della visualizzazione. La seconda soluzione a questo problema è quello di minimizzare la complessità dei protocolli: idealmente, eventuali trattamenti dovrebbero essere applicati direttamente alla pianta senza rimuovere la foglia o causare alcun danno.
Stromules sono stati studiati in una vertiginosa serie di specie e tipi di cellule, tra cui i capelli di grano radici, frutti di pomodoro e semi di tabacco eziolati 8,19. Questi studi pionieristici avanzato la comprensione delle dinamiche stromule durante lo sviluppo delle piante e hanno esplorato la gamma di attività stromule. Disegno confronti di questi vari sistemi sperimentali, tuttavia, può portare ad errori di interpretazione, poiché diversi tipi di plastidi sono coinvolti in considerevolmente diversi processi biologici.
Ad esempio, cloroplasti rendono stromules in risposta allo stress ossidativo causato dalla catena elettroni fotosintetico, ma poiché leucoplasti mancano i macchinari fotosintetico, non sono sensibili allastesso stimoli 9. Qualsiasi sistema sperimentale può essere usato per studiare stromules, ma il sistema sperimentale deve essere mantenuto costante durante lo studio se ogni confronto devono essere tratte. I fattori da considerare sono le specie, tipo di cellule, stadio di sviluppo o l'età della pianta, e il metodo di colorazione stromules (sia attraverso l'espressione del transgene stabile, espressione del transgene transitoria, o un fluoroforo esterno); anche lievi variazioni di questi fattori possono confondere tardi interpretazione dei risultati.
Infine, ogni studio della biologia stromule deve utilizzare una robusta strategia di campionamento affidabile, per garantire che i risultati sono riproducibili e biologicamente rilevanti. Campionamento più volte in un singolo impianto, ad esempio, prendere le immagini da diverse regioni d'una foglia, apparentemente a migliorare la potenza statistica, ma può essere fuorviante. Come mostrato nei dati rappresentativi sopra, la frequenza stromule di un singolo foglio può variare notevolmente dalla frequenza media stromulein molti fogli: in quella foglia, che è stato visualizzato durante il giorno, 37,9% dei cloroplasti fatto stromules, anche se la frequenza stromule medio di tutti i fogli durante il giorno era quasi la metà, solo il 20,8%.
Inoltre, visto quanto poco si sa circa la dinamica stromule in questo momento, qualsiasi esperimento dovrebbe essere interamente replicata almeno tre volte, e più se possibile, al fine di garantire che le variabili impreviste non sono responsabili di eventuali modifiche di attività stromule che sono osservati. Sopra ogni altra cosa, dal momento che il campo stromule biologia sta iniziando a decollare, i ricercatori dovrebbero accuratamente documentare e riferire tutti gli aspetti della progettazione sperimentale e, deviazioni creative dal semplice protocollo descritto qui.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
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