Protocol
Примечание: Для этого протокола, мы сосредоточились на опробование стромул частоту в эпидермисе N. benthamiana листья. Несколько устойчивых трансгенных линий были сформированы , которые могут быть использованы для этой цели, в том числе 35S PRO: FNRtp: EGFP , 13 и NRIP1: Cerulean 6. Обе эти линии показывают устойчивую экспрессию флуорофоров в хлоропласт строме листьев, выращенных в широком диапазоне условий. В качестве альтернативы, хлоропластов таргетингом флуорофоры могут быть выражены в скоротечно N. benthamiana с использованием Agrobacterium преобразований 13. Это меньше , чем идеал трансгенных линий, так как Agrobacterium инфильтрацию вызывают некоторые базальные защитных реакций в N. benthamiana и взаимодействия с Agrobacterium может изменять частоту стромул в листе 14, потенциально усложняя интерпретацию результатов. И, наконец, визуализировать стромул образование в пробирке,Хлоропласты могут быть извлечены из любых видов растений, с использованием либо генетически кодируемых флуорофоры или флуоресцентный краситель, как описано в разделе 5 ниже. 9,15
Примечание:. Подробные методы выращивания растений были описаны ранее 16 Вкратце, растут N. benthamiana растения в 4 -х "горшочки , наполненные какой - либо профессиональной почвенную смесь , которая обеспечивает хороший дренаж. Покрыть рассаду с прозрачным пластиковым куполом в течение первых 10-14 дней , чтобы обеспечить влажную среду для прорастания. Добавление любого стандартного смеси удобрений в соответствии с инструкциями производителя по 14- дневного возраста растения. выращивать растения под белым светом, используя ~ 100 мкмоль фотонов м -2 сек -1 интенсивность света. Водные растения регулярно.
1. Подготовка образцов листьев для визуализации
Примечание: динамика стромул страдают от ранив 8, поэтому препарат ткани следует проводить непосредственно перед визуализируя стромулс помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. В идеале, выборка должна быть визуализированы с 15 мин после снятия с завода.
- Вырезать небольшой участок листа с помощью очень острым лезвием бритвы. Всегда используйте один и тот же участок листа для консистенции, и быть уверенным, чтобы визуализировать ту же поверхность (адаксиальная или абаксиальный) во всех экспериментах.
- Сразу же после отрезания секции листа, погрузить раздел листьев в 5 мл безыгольного шприца, наполненного водой, удалить воздух из шприца, и применять вакуум путем покрытия шприца отверстие пальцем и потянув поршень.
- Отпустите поршень осторожно, чтобы не повредить участок листа. Повторите это два или три раза, или пока большая часть воздуха не был удален, и лист, как представляется, темно-зеленый.
Примечание: Этот шаг удаляет воздух в листе, которые могут помешать точной визуализации стромул.
- Отпустите поршень осторожно, чтобы не повредить участок листа. Повторите это два или три раза, или пока большая часть воздуха не был удален, и лист, как представляется, темно-зеленый.
- Добавить каплю воды на предметное стекло и поместите раздел лист на этой капли. Затем добавьте еще один ДрОп воды в верхней части листа, и место покровное стекло над листом. Если есть какие-то пузырьки воздуха, слегка постучите покровное, пока они не будут удалены. Ползун теперь готов к микроскопии, а также должны быть визуализированы немедленно.
2. Визуализация стромул с конфокальной флуоресцентной микроскопии
- С проходящем свете, фокус на поле зрения вблизи центра участка листа (от клеток, поврежденных лезвие бритвы). Используйте объектив 20X, так что многие хлоропласты могут быть визуализированы одновременно. Сохранение изображения с пропускаемого света таким образом, чтобы типы клеток можно отличить позже, если это необходимо.
- Включите источник освещения для лазера с соответствующими возбуждения и эмиссии фильтров для использования флуорофор. Например, возбуждают GFP с 488 нм лазером и собирать выбросы между 500 нм и 525 нм.
- Использование ПО микроскопа, выберите канал GFP и нажмите, чтобы отрегулировать обскуры диафрагму 1 Aiчень блок. Выберите лазерное сканирование, чтобы начать визуализировать образец, а затем нажмите на канал GFP для регулировки интенсивности лазерного излучения и усиления детектора, чтобы минимизировать мощность лазера в то же время четко визуализировать стромул. После того, как эти параметры были определены, держать их как можно более последовательными во всех экспериментах.
- Приготовьте г -stack эксперимент , который будет собирать серию изображений через эпидермы листьев в поле зрения.
- Для г -stack, включают в себя все эпидермальные хлоропластов в поле зрения , чтобы избежать смещения (например, если хлоропласты вблизи поверхности листа имеют больше стромул при условиях испытания).
- Возьмите изображения на максимальный интервал возможно , что будет включать в себя все стромул но сводят к минимуму время , необходимое для г -stack. Например, если 1 Эри единица эквивалентна секции конфокальной в фокусе, который глубоко 2 мкм, принимая изображение каждые 2 мкм, вероятно, идеальным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лист epidermis является неровная поверхность, таким образом, общая глубина г -stack будет варьироваться в зависимости от образца; В большинстве Z -stacks потребует 10-20 изображений, но может включать в себя больше. - Отрегулируйте скорость сканирования и разрешение изображения по мере необходимости , чтобы убедиться , что г -stack собирают быстро (обычно в течение 5-10 мин, если это возможно). Сохраните г -stack для последующего анализа.
3. Обработка изображения
- Определить стромул частоту с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений. Для этого протокола, мы рекомендуем использовать ImageJ, который публично доступен из Национальных институтов здравоохранения (http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj) или популярной модернизации ImageJ, Фиджи (http://fiji.sc /Фиджи).
- Слияние г -stack в одно изображение с использованием максимальной проекции интенсивности в программном обеспечении.
- Определить и вручную пересчитать все хлоропласты в изображении.
- Для каждого хлоропластов, визуально определить, действительно ли один или несколько стромулрассматриваются простирается от хлоропластов в объединенном Z -stack изображения. Для примера смотрите рисунок 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку биологические функции стромул не известны, любой тонкий, стромы заполненный, трубчатое продолжение от хлоропластов можно считать "стромул", независимо от их длины. Как правило, стромы заполненные расширение из хлоропласта является стромул , если оно меньше , чем примерно 1 мкм в диаметре вдоль большей части ее длины 7. Убедитесь в том, что один человек анализирует все изображения для контроля за субъективных различий в определении того, является ли или нет хлоропласта в стромул. Второй исследователь должен самостоятельно проверить частоты стромул для дальнейшего снижения субъективных предубеждений.
4. Экспериментальный дизайн и отбор проб
Примечание: стромул частота сильно варьирует между листьями, но несколько сообщений предполагают, что есть небольшое изменение в стромул частоты в пределах Indiviдвойного листа 9,17.
- Вычислить частоту листьев стромул из одного поля зрения одного листа. Выбросите лист, и рассмотреть это независимый образец. Не рассматривать отдельные поля зрения с одного листа в качестве независимых выборок.
Примечание: Там нет сильного консенсуса о том, как лучшие изменения в стромул мера активности, и до тех пор пока функция стромул не более четко определены, исследователи должны продолжать проявлять творческий подход в количественной оценки динамики стромул. Для сравнения по литературе, однако, использовать общие стандарты отчетности должны быть использованы в дополнение к более творческих подходов. Как минимум, всегда сообщать частоту хлоропластах, которые имеют один или более стромул. - Определить частоту хлоропластов, которые имеют стромул в поле зрения. Используйте ImageJ для идентификации всех хлоропластов в поле зрения. Затем для каждого хлоропластов, определяют хлоропластов сформировал ли по крайней мере один стромул. Частота стромул Доклад как PercentaGE хлоропластов с стромул.
Примечание: Некоторые исследователи преобразовать процент, например, с помощью преобразования арксинуса, прежде чем сообщать частоты стромул; в то время как это вариант для статистического анализа, арксинус стромул частоты не является интуитивно понятным значение, и не нужно сообщать в основном тексте или фигур исследования.- В качестве альтернативного подхода, подсчитать общее количество стромул, и разделить его на общее количество хлоропластов.
Примечание: В большинстве случаев, это даст аналогичные результаты подойти 4.2; он может переоценить частоту стромул, однако, если один хлоропласт сформировал много стромул. В примере, показанном на основании репрезентативных результатов, например, несколько хлоропласты имеют два или более стромул, в результате чего число стромул в хлоропластах до 40/87 (по сравнению с частотой стромул от 33/87). - В качестве альтернативы, определить длину стромул вместо стромул частоты. Длина может быть измеренав ImageJ путем отслеживания стромул с ручным инструментом линии.
Примечание: Так как биологическая роль стромул остается неизвестным, не ясно, что стромул длина влияет на их функцию. Данные о существенных различий в стромул длины, если они наблюдаются, но также сообщают частоты стромул (как описано в разделе 4.2).
Примечание: стромул частота может быть сильно варьирует среди различных листьев в тех же условиях роста. Поэтому, хотя определения частоты стромул может отнимать много времени, эксперименты должны быть тщательно разработаны, чтобы включать в себя большие размеры выборки. Использование наборов данных из нашей лаборатории, мы установили, что размер выборки, по меньшей мере, 16 растений для каждой обработки, как правило, достаточно мощным, чтобы определить, имеется ли статистически значимое различие по меньшей мере, 1,5-кратное изменение стромул частоты между двумя условиями (со стандартными α = 0,05 и β = 0,80).
- В качестве альтернативного подхода, подсчитать общее количество стромул, и разделить его на общее количество хлоропластов.
- Статистический анализ результатов.
- Для сравнения меняА.Н. стромул частоты двух обработок, используют т тест Уэлч (также известный как гетероскедастических т тест или тест т , предполагающей неравную дисперсию).
Примечание: Этот тест не является столь мощным , как т тест обычном Стьюдента, а т тест Уэлша является предпочтительным , так как он не предполагает , что дисперсия в стромул распределения частот аналогично между обработками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку стромул частота является "доля", ее распределение выборки по прогнозам, будет биномиальное, а не нормальное, который теоретически мог бы перекоса статистический анализ, если размеры выборки очень малы или если стромул частота очень низкая (около 0%) или очень высокий (около 100%). В некоторых докладах использовали арксинус преобразования до того статистического анализа, который предназначен для преобразования биномиального распределения к нормальному распределению, и , таким образом , удовлетворяют требованиям стандартов т теста Стьюдента или ANOVA с. На практике, однако,rcsine преобразования имеют мало или вообще не оказывает влияния на статистическом анализе, и поэтому не рекомендуется. Вместо того, чтобы повторить эксперименты, чтобы увеличить размер выборки, что позволит повысить статистическую мощность и уменьшить количество ошибок в интерпретации данных. - Независимо статистический подход используется, не забудьте тщательно сообщать стратегии выборки, размер выборки, статистический тест, р значение для каждого эксперимента.
Примечание: Как и в других областях биологии, значение р меньше 0,05 можно считать «статистически значимым», хотя исследователи , безусловно , должны сообщить точное значение , полученное р. Если р чуть выше 0,05, как увеличение размера пробы с двумя или тремя экспериментами может помочь выяснить , является ли или нет воспроизводима и статистически значимое различие наблюдалось.
- Для сравнения меняА.Н. стромул частоты двух обработок, используют т тест Уэлч (также известный как гетероскедастических т тест или тест т , предполагающей неравную дисперсию).
5. Извлечение интактные хлоропласты визуализировать стромул Dynamics
Примечание: Существует несколько методовбыли использованы для выделения хлоропластов из листьев, в том числе несколько иной протокол в недавнем исследовании стромул образования в пробирке 15. Протокол подробно описаны ниже использует относительно простой метод , который не уступает биохимически чистых образцов хлоропластов, но вместо того, чтобы изолировать большое количество неповрежденных, здоровых хлоропластов 9,18.
- Подготовка холодного буфера для экстракции: 50 мМ Hepes - NaOH, 330 мМ сорбита, 2 мМ ЭДТА, 1,0 мМ MgCl 2, и 1,0 мМ MnCl 2. Доводят рН до 6,9 с помощью NaOH и HCl, и хранить в холодильнике перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, нет необходимости, используя холодные буферы и хранение проб на льду, когда это возможно даст более высокую долю интактных хлоропластов. - Готовят изолирующий буфер: 50 мМ Hepes NaOH, 330 мМ сорбита, 2 мМ ЭДТА, 1,0 мМ MnCl 2, 1,0 мМ MgCl 2, 10 мМ КСl, и 1,0 мМ NaCl. Доводят рН до 7,6 с NaOH и HCl и охладите перед использованием.
- Если листья не являютсяэкспрессирующих генетически кодируемой стромы флуорофор, готовят карбоксифлуоресцеин диацетат раствор (CFDA): 50 мМ CFDA исходного раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) (2,3 мг CFDA на 1,0 мл ДМСО).
Примечание: точная концентрация не имеет решающего значения. Держите CFDA запас в темноте во все времена. Хранить небольшие аликвоты 50 мМ CFDA при -20 ° С. - Для того, чтобы выделить хлоропласты, удалить ~ 5-10 г листьев из нескольких растений и кратко промыть в холодной воде. Немедленно передать в 50 мл буфера для экстракции холодной. Измельчить листья с помощью блендера с несколькими короткими импульсами. Смесь фильтруют через два-три слоя марли, чтобы удалить твердые частицы листьев, делят распакованные хлоропласты в две 50 мл центрифужные пробирки и центрифуги в течение 1 мин при 750 х г.
- Удалите супернатант и ресуспендируют зеленые хлоропласты в буфере изоляции 10 мл. Центрифуга снова в течение 1 мин при 750 мкг, отбросить супернатант и ресуспендирования хлоропласты в буфере изоляции довести конечный объем до 5 мл.
- Передача 201, л хлоропластов на слайде, крышка с покровное и начать микроскопии.
Примечание: хлоропласты из трансгенных растений, экспрессирующих пластид-мишенью флуоресцентные белки теперь готовы к визуализации с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. - Пятно хлоропластов из растений, которые не выражающие пластид-мишенью флуоресцентные белки для визуализации стромул.
- Добавьте 5 мкл 50 мМ CFDA запаса до 5 мл хлоропластов суспендируют в буфере изоляции. Довести конечную концентрацию до 50 мкМ.
- Разрешить хлоропласты инкубировать в течение 5 мин, а затем передать небольшую аликвоту (~ 50 мкл) на слайд, накрыть покровным и начать микроскопии.
- Используйте FITC или GFP набор фильтров. Используйте объектив 20X, чтобы визуализировать много хлоропластов одновременно, или более высокую цель для визуализации одной изолированной хлоропласты.
Примечание: CFDA будет флуоресцировать внутри стромы интактных хлоропластов. - Если есть сильный фон флуоресценции, моют Chloroplasts снова в 10 мл буфера изоляции после 5-минутной инкубации с CFDA, центрифуге в течение 1 мин при 750 мкг, отбросить супернатант и ресуспендируют в 5 мл буфера изоляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был использован для визуализации стромул частоту днем и ночью в семядолях молодых N. benthamiana рассады. Ломтики из z- стека были объединены в одно изображение (рисунок 1А). Для визуальных целей, что изображение было тогда ненасыщенный и перевернутый таким образом , что стромы появляется черный (рисунок 1В). Хлоропласты были помечены либо как не имеющие стромул (зеленая звездочка) или имеющие по меньшей мере один стромул (пурпурные звездочки). Из 87 эпидермальных хлоропластов визуализированных, 33 имеют стромул. Таким образом, частота стромул в этом листе составляет 37,9%.
С помощью этого анализа, протокол был повторен еще 21 заводов (один лист на растение) в течение дня и в общей сложности 24 заводов в ночное время. В день, средняя частота стромул составляет 20,8 ± 1,8%; в ночное время , средняя частота стромул составила 12,8 ± 0,9% (рис2). Стромул частота была значительно выше в течение дня, как определено т тесте Уэлша (п ≥ 22, р <0,0005). Следует отметить , что , хотя наблюдались более 23 000 хлоропласты и несколько сотен клеток, размер выборки, п, сообщается как 22, число независимых исследованных растений.
Используя протокол , описанный здесь, наблюдались хлоропластов стромул в пробирке после выделения из листьев N. benthamiana выражения пластид-целевой GFP (рис 3A), или после использования CFDA для окрашивания хлоропласты , выделенные из N. benthamiana (рис 3B) или Spinacia Oleracea (рис 3C).
Рисунок 1. Количественная стромул частоту в N. Benthamiana листья. (А) г -stack от частичного поля зрения эпидермиса N. benthamiana экспрессии стромальных GFP был слит , чтобы показать все эпидермальные хлоропласты и стромул в одном изображении. (B) Это изображение было преобразовано в черно-белом и перевернутый для визуальных целей. Хлоропласты с стромул обозначаются пурпурным звездочкой; хлоропласты без стромул обозначены зеленой звездочкой. Шкала баров составляют 10 мкм. Измененный Brunkard и др. 9 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Сравнение стромул частоты через условий. Этот протокол был использован для определения улomule частоты в 22 растений в день и 24 растений в ночное время. Стромул частота была значительно выше в течение дня , чем ночью (т тест Уэлча, п ≥ 22, р <0,0005). Отрезки ошибок указывают на стандартные ошибки. Измененный Brunkard и др. 9 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Визуальное стромул после извлечения интактные хлоропласты из листьев. (А) хлоропласты из трансгенной N. benthamiana листья выраженную GFP (зеленый) , ориентированные на хлоропласты были изолированы с использованием протоколов , описанных здесь. (B) Хлоропласты были изолированы от дикого типа N. benthamiana листьев и окрашивали CFDA, который Fluoresces только внутри неповрежденных, жизнеспособных хлоропластов (показаны желтым цветом). (C) Хлоропласты также могут быть выделены из других видов растений, таких как шпинат (С. Oleracea), а затем окрашивали CFDA (желтый). Хлорофилл аутофлуоресценция отображается красным цветом. Измененный Brunkard и др. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При исследовании стромул, три важных фактора должны быть рассмотрены на протяжении: (I) манипуляции ткани растений должны быть сведены к абсолютному минимуму, (б) экспериментальная система должна быть последовательной, и (III) стратегии отбора проб должны быть тщательно спланированы, обеспечить надежные, воспроизводимые данные анализируются.
Стромул удивительно динамичным: они могут распространяться и быстро убирается перед глазами наблюдателя под микроскопом. Кроме того, стромул частота значительно изменяется в ответ на широкий спектр процедур, включая стимулы, которые нельзя избежать того, чтобы визуализировать стромул (например, лист ранении). Основным решением этой проблемы, которое адресовано с протоколами, описанными здесь, является проведение хорошо контролируемых экспериментов, сохраняя все переменные последовательны. Это включает в себя, например, подготовку каждого образца для визуализации непосредственно до приведения его в микроскоп; растения не должны быть поврежденыне только непосредственно перед визуализацией. Второе решение этой проблемы состоит в минимизации сложности протоколов: в идеале, любые методы лечения следует наносить непосредственно на растение, не удаляя лист или причинения каких-либо повреждений.
Стромул были изучены в ошеломляющее количество видов и типов клеток, в том числе пшеницы корневыми волосками, плодах томата и этиолированных рассады табака 8,19. Эти пионерские исследования продвинули понимание динамики стромул в процессе развития растений и исследовал спектр стромул активности. Проводя сравнение этих различных экспериментальных систем, однако, может привести к неправильному толкованию, так как различные типы пластид участвуют в значительно различных биологических процессах.
Например, хлоропласты сделать стромул в ответ на окислительный стресс, вызванный фотосинтетической электронной цепи, но так как лейкопласты отсутствие фотосинтетической машины, они не чувствительны кже стимулы 9. Любая экспериментальная система может быть использована для исследования стромул, но экспериментальная система должна быть постоянной в течение всего исследования, если какие-либо сравнения должны быть сделаны. Факторы, которые следует рассмотреть вид, тип клеток, стадии развития и возраста растений, а также способ окрашивания стромул (будь то путем стабильной экспрессии трансгенов, транзиторной экспрессии трансгенов или внешнего флуорофора); даже незначительные вариации этих факторов могут посрамить поздней интерпретации результатов.
Наконец, любое исследование стромул биологии должны использовать надежные, надежной стратегии выборки, чтобы гарантировать, что результаты являются воспроизводимыми и биологически значимым. Отбор проб неоднократно из одного растения, например, принимая изображения из нескольких областей одного листа, по- видимому , будет улучшить статистическую мощность, но может ввести в заблуждение. Как показано в приведенных выше данных, частота стромул одного листа может значительно отличаться от средней частоты стромулво многих листьев: в этом листе, который был визуализирован в течение дня, 37,9% хлоропластов сделал стромул, хотя средняя частота стромул поперек листьев в течение дня было почти в два раза меньше, только 20,8%.
Кроме того, учитывая то, как мало известно о динамике стромул в это время, любой эксперимент должен быть полностью воспроизведены по крайней мере, три раза, и больше, если это возможно, чтобы гарантировать, что непредвиденные переменные не несет ответственности за любые изменения в стромул активности, которые наблюдаются. Прежде всего, так как поле стромул биология только начинает взлетать, исследователи должны тщательно документировать и сообщать все аспекты экспериментального проектирования, в том числе творческих отклонений от простого протокола, изложенной здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
- Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
- Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
- Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
- Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926 (2012).
- Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
- Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
- Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
- Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
- Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
- Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
- Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
- Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
- Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
- Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).
- Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).
- Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
- Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).
- Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
- Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).
