Abstract
את assay פלטפורמת ביטוי גנים מאפשר כימות חזקים מאוד לשחזור של הביטוי של עד 800 תמלילי (mRNA או miRNAs) בתגובה אחת. את assay מירנה סופרת תמלילים ידי הדמיה במישרין דיגיטלי ספירת מולקולות מירנה כי מסומן עם ערכות בדיקת המינימרקטים ניאון בצבעים (בדיקת כתב בדיקה לכידה). ברקודים הם הכלאה ישירות להבשיל miRNAs כי כבר מוארך ידי ligating תג oligonucleotide ייחודי (miRtag) עד הסוף '3. שעתוק הגברה הפוך של התמלילים אינם נדרשים. בדיקות Reporter להכיל רצף של שש עמדות צבע המאוכלסות באמצעות שילוב של ארבעה צבעי ניאון. ארבעת הצבעים על פני שש עמדות משמשים כדי לבנות רצף ברקוד צבע גן ספציפי. עיבוד פוסט כלאה הוא אוטומטית על תחנת הכנת רובוטית. לאחר כלאה, החלליות העודפות נשטפות, ואת המבנים המשולשים (פרו ללכודחללית-מירנה-עיתונאי להיות) שתוקנה לשקופית streptavidin מצופה באמצעות החללית ללכוד שכותרתו ביוטין. ספירת הדמיה ברקוד נעשית באמצעות נתח דיגיטלי. MiRNAs המינימרקטים המשותק הם דמיינו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ מצלמה, ואת ברקודים הייחודיים מפוענחים ומנה. בקרת איכות נתונים (קוו), נורמליזציה, וניתוח הם הקלו על ידי תוכנה אישית מעוצב עיבוד נתונים וניתוח המלווה את תוכנת assay. את assay מדגים ליניאריות גבוהה על פני טווח רחב של ביטוי, כמו גם רגישות גבוהה. לדוגמא והכנת assay אינה כרוכה תגובות אנזימטיות, שעתוק לאחור, או הגברה; יש כמה צעדים; והוא אוטומטי בעיקר הקטנת השפעה חוקרת וכתוצאה מכך עקביות גבוהה שחזור טכני. כאן, אנו מתארים את היישום של טכנולוגיה זו לזיהוי הפרעות מירנה במחזור תסמונת מעי רגיז.
Introduction
תסמונת המעי הרגיז (IBS) היא האבחנה אשפוז הנפוץ ביותר לגסטרואנטרולוגיה, שפוקדת 10 - 15% מכלל האוכלוסייה וייצוג נטל משמעותי על שירותי בריאות. נכון לעכשיו, אין הם מקובלים סמנים ביולוגיים לאבחון IBS (כלומר, האבחנה מבוססת על תסמינים קליניים ו פוסלים הפרעות אורגניות אחרות, כגון ממאירות במערכת העיכול, מחלות מעי דלקתיות, ומערכת העיכול (GI) זיהומים). כאשר לומדים פרופילי ביטוי גני מצבים שכיחים עם histopathology תת קליני, כגון תסמונת מעי רגיז, רגישות גבוהה ודיוק (שחזור) יש צורך, כמו הפרעות פרופילי ביטוי גנים הן בדרך כלל עדינות 1-3. miRNAs זוהה שני מטרות האבחון הפונקציונליות IBS 4,5, ואנחנו מעוניינים במיוחד בהערכת השימוש שלהם כמו במחזור ביומרקרים של 3,4,6,7 הפרעות ביולוגיות הקשורים IBS. הניצול הקליני של circulaביומרקרים טינג הוא של ריבית הנוכחית בשל הקלות וטבע פולשנית של האוסף של "מקור הסמנים הביולוגיים (למשל, דם היקפי) מחולים.
מבחני פלטפורמת התבטאות גנים, בגלל הכימיה הייחודית שלהם יעילה, זרימת העבודה אוטומטית בעיקר, לספק פלטפורמת microarray המספקת כיסוי רחב להתאמה אישית (800 מטרות לתגובה אחת) של transcriptome על גילוי ממוקד. הם גם להניב דיוק ליניאריות גבוה על פני ספקטרום רחב של רמות ביטוי הכימות של מטרות transcriptomic. את assay אינו מחייב את שעתוק לאחור של RNA, הגברה של וכתוצאה cDNA, או כל תגובות אנזימטיות אחרים. לפיכך, שגיאות פוטנציאליות שהנהיגו את מספרי מחזור הגבוהים של הגברה ממיני RNA עם שפע נמוך או גרסות אחוי נדירות מופחתות על ידי התהליך של ספירה דיגיטלית. משמעות הדבר היא כי מגוון רחב של סוגי מדגם, כגון כולל מטוהריםRNA (כלומר, mRNA + מירנה), RNA מן-מוטבע פרפין קבוע פורמלין (FFPE) דגימות, כמו גם lysates רקמות תאים גולמיים, ניתן להשתמש עם המבחנים.
RNAs של עניין מזוהה באמצעות זוג חלליות (לכידת בדיקות כתב), שכל אחת מהן מכיל רצף מסוים-יעד שמכיר אזור מתאים על RNA היעד. על מנת להבטיח זיהוי של RNAs הקצר (כלומר, miRNAs), רצף מירנה הבוגר מוארך על ידי חישול תג oligonucleotide ייחודי (miRtag) עד סוף '3 של המולקולה. Oligonucleotide גישור, אשר משלים חלק השני של מירנה היעד הבוגר ואת miRtag מירנה הספציפי, משמש כדי להבטיח סגולי רצף. לכידה וכתב בדיקות ולקשור אל 3 'ו 5' מסתיימת של מתחם מירנה-miRtag הבוגרת, בהתאמה. הבדיקות הלכידות יש תווית ביוטין על 'סוף 3, אשר מאפשרת להם לצרף אל פני השטח של שקופיות זכוכית מצופית-streptavidin, fixing במתחם החללי ללכוד בדיקת מירנה-miRtag-כתב לשקופית. זרם חשמלי לאחר מכן נעשה שימוש כדי לכוון את המורכבות על פני שטח השקופיות, המאפשר ברקודים פלורסנט נישאו על ידי חללית הכתב על קצה '5 להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ ומכשיר תשלום מצמיד (CCD) מצלמה. ברקודים נספרים מפוענח, מניב ספירה של miRNAs היעד המבוקש. הברקוד פלורסנט מורכב משש עמדות שניתן שנכבשו על ידי אחד מארבעת בצבעי ניאון, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבנות למעלה מ -4,000 שילובי צבעים-ברקוד, כל קידוד עבור RNA ספציפי.
להכנת דגימות (כלומר, טיהור RNA או הכנת lysate תא / רקמה), כמו גם הכלאה של בדיקות ללכוד כתב, נעשית על הספסל. שנים עשר דגימות יכול להיות מרובבים בשקופית אחת. לאחר ההכלאה בין הלילה, כל הכנת הדגימה הנוספת מבוצעת על ידי תחנת הכנת רובוטית. השקופיות נטענות מועברות לאחר מכן למודעהמנתח igital הדמיה, ספירה, פענוח, ועיבוד נתונים. כתוצאת הנתונים מיובאים התוכנה הנלווית, שם הם מעובדים נוספים עם רמה גבוהה של שליטה של משתמש. הכימיה הייחודית, הכנה פשוטה, טבע אוטומטי, סוג נתונים פשוט (ספירות), ואת זרימת עבודה יעילה כוללת של assay להקל כימות ביטוי גני דיוק גבוה, מה שהופכת אותו לכלי שימושי בלימוד פרופילי ביטוי מירנה במחזור וחתימות בתנאים פונקציונליים, כגון IBS.
Protocol
המחקר המתואר כאן אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של המכונים הלאומיים לבריאות (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).
1. איסוף של דגימות דם מלאות
- לאסוף דגימות דם מלא (2.5 מ"ל) מן המשתתפים במחקר באמצעות venipuncture צינורות איסוף דם המכיל פתרון לייצוב RNA (המאפשר אחסון לטווח ארוך), ולאחסן אותם ב -80 ° C עד לטיהור RNA.
2. טיהור RNA סה"כ
- להפשיר דגירת צינורות הדם עבור שעה 2, ולאחר מכן צנטריפוגות אותם באמצעות הרוטור תנופה-אאוט במשך 10 דקות ב 5000 x גרם. הסר את supernatant על ידי שפיכה בזהירות או pipetting אותו לתוך צינור פסולת, נזהר שלא להפריע את הכדור.
- שטוף את הכדור על ידי הוספת 4 מיליליטר מי RNase ללא, להחליף את המכסה מאובטח, ו מערבולת עד הגלולה היא מומסת בעליל. צנטריפוגה באמצעות הרוטור דלי הנדנדה ב 5000 XG במשך 10 דקות מחדשלהזיז את supernatant, כמתואר בשלב 2.1.
- להוסיף 350 μl של חיץ BM1 (בתנאי) על הגלולה. וורטקס גלולה עד שהוא נמס בעליל ולהעביר אותו צינור עיבוד 2 מ"ל להפקת RNA הכולל אוטומטיות.
- בצע טיהור אוטומטית של RNA התאי, כולל מירנה, מהדם כולו באמצעות ערכת חילוץ RNA זמינה מסחרי, אשר יכול להיות אוטומטית על מערכת מיצוי RNA רובוטית.
הערה: מערכת רובוטית אוטומטית השתמשנו יכול לעבד עשר דגימות בכל פעם, וזה לוקח 3 שעות עבור פרוטוקול טיהור RNA כדי להשלים.- טען את הטיפים פיפטה טעון מראש, צינורות צנטריפוגה, מאגרים, ריאגנטים המסופקים בערכת טיהור RNA למערכת מיצוי RNA רובוטית.
- בחר את הפרוטוקול "חלק א דם מירנה" מתפריט בחירת הפרוטוקול ולהתחיל הריצה.
הערה: ראה חומרים משלימים לתיאור ההליכים האוטומטיים. - לאחר הרובוט יש שיתוףmpleted בחלק א 'של פרוטוקול מירנה טיהור האוטומטי, לרוקן את פח האשפה ולהסיר את הפלסטיק המשמש ומכולות מגיבים ממערכת רובוטית.
- סגור את המכסים על כל הצינורות מיקרו צנטריפוגות המכילים RNA eluted ומניחים אותם למתאם שייקר. בחר "דם מירנה חלק ב" מתפריט הבחירה בפרוטוקול כדי לדגור דגימות ב 65 o צלזיוס למשך 5 דקות.
- לאחר הרובוט השלים ריצה החלק ב 'של פרוטוקול טיהור מירנה, להסיר באופן מיידי את הדגימות ומקרר אותם על קרח.
- לכמת ולהעריך את איכות RNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר.
הערה: על פי המלצות הפרוטוקול עבור assay מירנה, ריכוז מינימאלי של 33 ng / μl נדרשת, וכל הדגימות צריכות להיפגש או תעלינה יחס 280/260 של 1.9 ויחס 260/230 מינימום של 1.8 על מנת להבטיח ההיעדר של זיהום אורגני משמעותי, עלול לפגוע בביצועי assay (להתייחס התייחסות 17). - אחסן את הדגימות ב -80 מעלות צלסיוס
3. הכנת דוגמאות מירנה
- לנרמל 12 דגימות RNA ל -33 ng / μl באמצעות nuclease ללא מים.
- הכין דילול 1: 500 של הבקרות מירנה המסופקות בערכת assay באמצעות nuclease ללא מים. שמור על הקרח.
- מכינים את תערובת מאסטר חישול: לשלב 13 μl של חיץ חישול (מסופק), 26 μl של מגיב miRtag (מסופק), ו -6.5 μl של בקרות מירנה (מוכן בשלב 3.2) באמצעות 10 ו טפטפות 20 μl.
- בעזרת פיפטה 10 μl, להוסיף 3.5 μl של תמהיל חישול הורים ו -3 μl של המדגם RNA (כלומר, 100 ng) לכל אחד עשר צינורות רצועת 0.2 מ"ל. פליק כדי לערבב, ספין למטה באמצעות microcentrifuge מיני benchtop (2,000 XG), ומניחים thermocycler (94 מעלות צלסיוס 1 דקות, 65 o צלזיוס למשך 2 דקות ו -45 o צלזיוס למשך 10 דקות; להחזיק ב 48 מעלות צלסיוס) .
- מכינים את תערובת מאסטר קשירת ידי שילוב 3 μl של למאגר הקשירה (מסופק) ו -19.5 μl של פוליאתילן גליקול (PEG, ובלבד) בעזרת פיפטה 20 μl. להוסיף 2.5 μl של מיקס מאסטר קשירה אחד צינורות רצועת משלב 3.4 בעזרת פיפטה 10 μl.
- מערבבים בעדינות, ספין למטה באמצעות microcentrifuge מיני benchtop (2,000 XG), ולחזור thermocycler ב 48 o צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, בעזרת פיפטה 10 μl, להוסיף 1 μl של האנזים ישירות על צינור אחד של thermocycler דגירה אותם ב 48 o צלזיוס במשך 3 דקות, 47 o צלזיוס במשך 3 דקות, 46 o צלזיוס במשך 3 דקות, 45 o צלזיוס למשך 5 דקות ו -65 מעלות צלסיוס 10 דקות; להחזיק ב 4 מעלות צלסיוס
- הסר את הצינורות מן thermocycler, לערבב אותם בעדינות, ספין אותם באמצעות microcentrifuge מיני benchtop (2,000 XG), ולהוסיף 1 μl של אנזים לנקות קשירת (בתנאי). דגירה צינורות ב thermocycler (37 o צלזיוס במשך 1 שעה ו 70 o C למשך 10 דקות; להחזיק ב 4 o
- הסר את צינורות, בעזרת פיפטה 100 μl, להוסיף 40 μl מים nuclease חינם, לערבב, ספין למטה באמצעות microcentrifuge מיני benchtop (2,000 XG).
4. מירנה כלאה
- להפשיר את הכתב וערכות בדיקה ללכוד (בתנאי) על קרח ספין אותם באמצעות microcentrifuge מיני benchtop (2,000 XG).
- בעזרת פיפטה 200 μl, להוסיף 130 μl של חיץ הכלאה אל הצינור קוד להגדיר הכתב (130 μl) כדי ליצור את תערובת מאסטר הכלאה. מערבבים ומסובב באמצעות microcentrifuge מיני benchtop (2,000 XG).
הערה: Reporter ו לוכד בדיקות ספציפיות ורמה לכל מירנה נכלל בלוח. לוחות מותאמים אישית וערכות ללכוד חללית משתמש מעוצב יכולים להיות מתוכננים. - ב 12 צינורות רצועת 0.2 מ"ל חדש, להוסיף 20 μl של תמהיל הכלאה המאסטר בעזרת פיפטה 20 μl.
- לפגל דגימות מירנה משלב 3.7 ב 85 מעלות צלסיוס FOr 5 דקות ולצנן אותם על הקרח. הוסף 5 μl לכל אחד הצינורות משלב 4.3 בעזרת פיפטה 10 μl.
- תכנת את thermocycler עד 65 מעלות צלסיוס בווליום-מחושב 30 μl טמפרטורה מכסה מחוממת בזמן לנצח הגדרה (לא לתכנת אותו כבש עד 4 מעלות צלסיוס בסוף הריצה).
- בעזרת פיפטה 10 μl, להוסיף 5 μl של החללית ללכוד להגדיר על צינור אחד, לערבב, ספין למטה באמצעות microcentrifuge מיני benchtop (2,000 XG), ומכניסים מיד את thermocycler ב 65 מעלות צלסיוס דגירה של לא פחות מ -12 שעות ולא יותר מ -30 שעות.
5. תחנת הכנה ו Analyzer הדיגיטלי
- טען את תחנת ההכנה.
- פתח את דלת התחנה ולטעון הצלחות המגיבות (מסופק), מחסנית (מסופק), טיפי פיפטה (מסופק), דגימות מוכנות בשנתי עשרה צינורות רצועת 0.2 מיליליטר, ושנתי עשרה צינורות רצועת ריק 0.2 מיליליטר (בתנאי). הסר את פקקי צינור רצועה דיסקיות מגיב. סגור את תחנת ההכנהדלת ולהפעיל את assay המתאים מלוח הבקרה.
הערה: עיבוד הכלאת הודעה זהה, ללא קשר בטווח להיות assay. כל ריאגנטים מרכולתם פלסטיק הם ארוזים מראש ואין צורך בהכנה, למעט והבאתם בטמפרטורת החדר מסתובב למטה מגיב המכיל 96-גם הצלחות XG ב 2000 למשך 2 דקות. כל הרכיבים נטענים בתפקידים מוגדרים בבירור בתחנת ההכנה. ראה משלים חומר תיאור של הפרוצדורות האוטומטיות.
- פתח את דלת התחנה ולטעון הצלחות המגיבות (מסופק), מחסנית (מסופק), טיפי פיפטה (מסופק), דגימות מוכנות בשנתי עשרה צינורות רצועת 0.2 מיליליטר, ושנתי עשרה צינורות רצועת ריק 0.2 מיליליטר (בתנאי). הסר את פקקי צינור רצועה דיסקיות מגיב. סגור את תחנת ההכנהדלת ולהפעיל את assay המתאים מלוח הבקרה.
- דמיינו ולספור את ברקודים של המתחמים המשולשים המשותקים ואינו בכיוון.
- הוצא את המחסנית מתחנת ההכנה, לאטום אותו עם תלושי לכסות ספקו, ולמקם אותו המנתח הדיגיטלי בחריץ מעל אופטיים המצלמה.
- בחר את assay המתאים (assay לוח מירנה) וגרסת assay מצוין על גבי ערכת assay ולהפעיל את התכנית.
הערה: המנתח הדיגיטלי אז לוקח בתחום תמונות שמורים לכל עמדה מדגםאורכי גל T ארבעה עירור, המאפשרים ברקודים הניאון כדי לקרוא ולפענח. ברקודים ספציפיים, מתאימים מירנה ספציפי, נספרים. - לייצא את קבצי הנתונים על USB או ישירות לשרת דרך קישור לאינטרנט.
6. עיבוד וניתוח נתונים
- לחץ על הכרטיסייה "נתונים גולמיים" ובחר "קבצים RCC ייבוא". בחר את התיקייה המכילה קבצי RCC (קבצי נתונים גולמיים) מן ה- USB.
- לחץ על "הבא", בחר את כל תיבות QC, ולחץ על "יבוא".
- לחץ על כרטיסיית "המחקר החדש". שם ולתאר את המחקר ולשמור.
- במסגרת המחקר החדש, בחר את הכרטיסייה "ניסוי חדש" ואת שם ולתאר הניסוי החדש. לחץ על "הבא" ובחר את התיקייה RLF מהחלונית השמאלית שמכילה את קבצי הנתונים הגולמיים הרלוונטיים שהועלו. ברגע שזה כבר נבחר, לחץ על "שמור נבחר", ולאחר מכן לחץ על "הבא".
- לְהוֹסִיףהסברים אם תרצו בכך ולחצו על "הבא".
- בחר את שיטת חיסור רקע; או שליטה שלילית, חיסור נתיב ריק, או חיסור המוגדר על ידי משתמש ניתן לבחור. לאחר שנבחר, לחץ על "הבא".
הערה: בדוק את גישת תיקון רקע המתאימה ביותר בהתבסס על הפרמטרים הטכניים בהקשר ביולוגי של המחקר.
הערה: ספירה היא פחות מדויקת עבור מטרות נמוך שפע. למטרות המחקר מתואר כאן, תהליך עיבוד הנתונים ראשון ללא צורך בתיקון רקע כדי לבחון פרמטרי QC ולבחון וריאצית ספירה עבור מירנה של שכיחותם שונה ברחבי משכפל טכני. נתוני reprocessed מכן באמצעות סף רקע 25-ספירה. - בחר את "Top 100" הנורמליזציה, ולאחר מכן לחץ על "הבא".
- כדי לקבל את נתוני יחס, בחר את פרמטרי היחס, ולאחר מכן לחץ על "הבא".
- "גמור" לחץ.
- הקישו על לשעבר בשםperiment ב בחלונית הימנית כדי לחשוף תפריט נפתח המכיל "Raw", "מנורמל", "מקובצת", "נתוני יחס", ו- "ניתוח נתונים".
- לחץ על "קבצי נתונים" ולבחון דו"ח QC בחלונית הימנית. שימו דגל ליד דגימות שאינם עוברים את הפרמטרים QC מחדל. לבנות "מחקר" חדש אשר אינו כולל את הדגימות המסומנות ועיבוד מחדש כמתואר, או פשוט אל תכלול דגימות מסומנות QC משלב ניתוח הנתונים על ידי בחירה "אל תכלול דגימות ידי דגל QC / נורמליזציה".
- ייצוא "Raw", "מנורמל", או "מקובץ" קבצי נתונים CVS או אחר פורמט קובץ תואם לניתוח אחר תוכנה סטטיסטית או microarray.
- בחר "נתונים מנורמלים" מחלונית עזבה ובחר את הדגימות להיכלל בניתוח בחלונית הימנית.
- לחץ על "ניתוח" ובחר את סוג הניתוח הרצוי (למשל, "מפת חום & #34 ;, "מגרש כינור", "תיבת מגרש", "מגרש פיזור", או "היסטוגרמה מגרש"). בחר בתיבות קריטריוני דרה הרצויות (למשל, לכלול דגימות outlier או גנים, שולל את הדגימות בדגלוני QC, שולל את הגנים המלאים, ו / או לא לכלול חלליות הנורמליזציה מניתוח נתונים).
- בחר דגימות בודדות להיות נכלל בניתוח לפי צורך.
- בחר גנים בודדים להיכלל או נכלל בניתוח לפי הצורך.
- בחר את הפרמטרים עבור המניפולציה להדמיה סטטיסטית או נתונים שנבחרה ולחץ על "סיום".
Representative Results
הפרעות transcriptomic ב והפרעות תפקודיות יכולות להיות עדינות, ועל מנת לזהות את אותם שינויים עדינים באופן אמין ביטוי, כימות של ביטוי גנים צריכה לדייק. מערכת assay פלטפורמת ביטוי גני מפחית רעש טכני דרך הטבע שלה מאוד אוטומטי, והכימיה הייחודית היא משתמשת מייצרת נתוני ביטוי גני דיוק גבוה. טכני משכפל שמוצג באיור 1 להדגים את השחזור הגבוה בשני אנדוגני (נקודות הכחולות) ו מירנה ויראלי (נקודות כתומות; גני משק מיוצגים על ידי נקודות צהובות) כימות ביטוי זה אפשרי באמצעות שיטה זו. באמצעות שיטה זו, ויראלי (איור 2 א) ו אנדוגני (איור 2b) miRNAs המראה סטיית הביטוי צפוי, כפי שהוגדר על ידי משתתפי מחקר בריאים, ניתן לזהות מטרות של עניין IBS. יצוין כי לא ברור אם miRNAs ויראליזוהה כאן נובע גני ויראלי משולבים לתוך הגנום האנושי או עומס נגיפי. כמו assay רק סופרת miRNAs הבוגרת עם ייחוד נוקלאוטיד יחיד, הכלאה צולבת עם miRNAs אדם אנדוגני דומה סבירה. עם זאת, רמות יציבות הפרש של מולקולות אלה הן בעלי העניין כסמנים ביולוגיים. הדיוק של השיטה מאפשר הפרעות בין מטרות ביטוי נמוכות כדי להתגלות, כמו איתור מדויק של תמלילים אלה אינם מוצפים על ידי תמלילים שופעים יותר. הפרעות עדינות גם ניתן לצפות באופן מהימן. איורים 3 ו 4 להראות כמה הפרעות אלה במחזור miRNAs ב IBS ו IBS-תת בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה, ומספרי 5 ו -6 (הוא עיבוד 3) להראות שני miRNAs המשמעותי ביותר דיפרנציאלי הגבוהה (איור 5: מירנה 342-3p, איור 6: מירנה 150). במשתתפים IBS איור 6 הוא דוגמא של הפלט של תוצאות הגרפיים שנוצרו על ידי התוכנה הנלווית.
. איור 1: ספירת מנורמלים שמגיעים שני משכפל טכני משכפל לרוץ על שתי מחסניות נפרדות להראות קשר לינארי גבוה (r 2 = 0.90, y = 1.03x - 0.4) על פני הטווח של המנורמל (מנורמל 100 העליון הביע miRNAs) מירנה ספירה (ספירת log2 על x ו- ציר y). עלילת הפיזור כולל נתונים עבור miRNAs אדם אנדוגני בכחול (654 miRNAs), miRNAs ויראלי אנדוגני בכתום (80 miRNAs), וגני משק בצהובים (8 גנים). miRNAs ויראלי אנדוגני היו זמין על הגירסות קודמות של assay (גרסה 1.4 שמשה כאן), אבל לא כלול כבר על assay הסטנדרטי, אם כי הם זמינים כמו תוספות מותאמות אישית./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. ספירה מנורמלת של נגיפי ו אנדוגני האדם miRNAs ב-עצירות IBS (IBS- C) לעומת קבוצת ביקורת בריאת הפרעות ב (א) ויראלי (כתום) ו- (ב) miRNAs אדם אנדוגני (כחולה) ניכר בדוגמא זו, שם ספירת מירנה (טרנספורמציה log2) של משתתפי IBS-C (ציר y) היא רגרסיה נגד ספירת מירנה (log2 טרנספורמציה) של קבוצת ביקורת בריאה (ציר x). רוב miRNAs להביע מאוד דומה באוכלוסיות שניהם, אבל כמה לסטות בעיקר מן המתאם. סטיות אלה ניכרים בין שתי מטרות נדירים מבוטא בשפע. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. MiRNAs באופן משמעותי והאחיד דיפרנציאלי מתבטא IBS בהשוואה לקבוצת ביקורת דיפרנציאלי הביע miRNAs ב IBS מתגלה בשיטת גודל אפקט ניתוח המבחין ליניארי, המשלבת בדיקות של מובהקות סטטיסטיות עם בודק עקבי בתוך קטגוריות. נא ללחוץ כאן לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. MiRNAs באופן משמעותי ואחיד דיפרנציאלי מתבטא IBS תת סוגים בהשוואה לקבוצת הביקורת miRNAs היו דיfferentially לידי ביטוי IBS-תת (-D: שלשול, -C: עצירות). בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה בשיטת גודל אפקט ניתוח המבחין ליניארי, המשלבת בדיקות של מובהקות סטטיסטיות עם בודק עקבי בתוך קטגוריות אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.
איור 5:. ביטוי דיפרנציאלי של מירנה-342-3p כאבי בטן כרוניים שגורם לה אינו ידוע הוא סימפטום עיקרי של תסמונת מעי רגיז. עלילת התיבה מראה כי miR-342-3p (ספירה מנורמלת על ציר y), מירנה הקשור לכאב שלפוחית שתן כרוני שגורם לה אינו ידוע, נמצאת להיות נוכח במחזור הספירה גבוהה בכל תת IBS בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה. העמודות אלו מייצגות הטווח שאינו outlier, התיבהes בטווח-ברביעון היתר ואת הריבוע הכחול הספירה החציוני. שונה מ 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: ביטוי דיפרנציאלי של מירנה-150 מגרש כינור מראה כי משתתפי IBS היו גבוה משמעותי במחזור miR-150 ספירה לעומת קבוצת ביקורת בריאה (ספירת טרנספורמציה log2 על ציר y).. העקומות לציין את תדירות הספירה בקטגוריה, הקווים האנכיים מייצגים את 1 st ו -3 רבעוני rd, והכיכר האדומה מציינת את ספירת החציוני. שונה מ 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
עבור assay מירנה בפרט, חשוב לא להשתמש lysates unpurified (אלה יכולים לשמש mRNA מבחני חלבון), כמו ריאגנטים שלא היו מותאמים לשימוש עם lysates, ותגובות הכנת המדגם צפויות להיות מעוכב. בנוסף, מזהמים שמקורם השלבים לטיהור תמוגה ו- RNA (למשל, תרכובות guanidinium, אתנול, ו פנולים) יכול לעכב תגובות קשירת מדגם טיהור. RNA באיכות טובה ולכן קריטי רגישות ודיוק של assay מירנה.
באמצעות thermocycler עם מכסה מחומם הוא קריטי כדי להבטיח בקרת טמפרטורה נאותה כדי למטב את הביצועים של כל צעדי התגובה. במהלך שלב 3.5.1, חשוב שלא להסיר את הפסים מן thermocycler על מנת לשמור על הטמפרטורה במהלך התוספת של האנזים. הסרת הרצועות להוסיף את האנזיםיתפשר התגובה. בעת ביצוע השלבים הכולים, הוא קריטי כדי למנוע טלטול נמרץ, pipetting, או מצליף כאשר ערבוב חומרים כימיים בתוך הצינורות, מכיוון שהדבר עלול גזירת חלליות הכתב. כדי להבטיח ביצועים מיטביים ועקביות, חשוב לערבב ריאגנטים ביסודיות צינורות ידי מצליף עדין. תמיד ספין למטה בתגובות לאחר הערבוב, ולהשתמש פיפטה חדש להטות בכל פעם מגיבה הוא חלק כדי להבטיח pipetting מדויק כדי למנוע זיהום צולב בשוגג.
שינויים ופתרון בעיות
מגדיר הקוד יכול להיות מותאם אישית כדי לכלול מטרות רק עניין. בדרך זו, עלויות יכולות להיות מאוזנות כדי לאפשר הבדיקה של ערכות מדגם גדולות כאשר נוסף חוקר או על מנת לאשר ביו-חתימה. בדיקות מותאמות אישית יכולות להיות מיועדות גנים או מטרות לא זמינים מתפריט א-לה-קארט. רגישויות מטרות פחות שופעות או RNA נמוך ריכוז יכולות להיותמניפולציות על ידי הוספת זמן הכלאה ארוכה יותר ו / או באמצעות ספירה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה יותר.
במחקר שלנו השתמשנו בלוח מירנה המוגדר מראש 800 היעד עם RNA הכולל דם כולו; עם זאת, יכולים להיות מותאמים אישית המבחנים לכלול miRNAs פחות אם גישה ממוקדת יותר יש צורך. סך של 24 דגימות ניתן להכין ביום אחד, מעד בשני סטים של 12, כי שתי מחסניות ניתן להעביר בנוחות באמצעות עיבוד פוסט כלאה בתחנת הכנת רובוטיות צלמו על המנתח הדיגיטלי למחרת. עיבוד מדורג של דגימות בקבוצות של 12 חשוב לתקנן את זמן ההכלאה. מחסניות כי כבר צלמו ניתן לשמור ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס ייסרק מחדש אם ניתוחי נתונים מראים כי סריקה ברזולוציה גבוהה יותר עשויה לשפר את זיהוי של miRNAs הנדיר. איתור של מולקולות נדירות עשוי גם להיות משופר על ידי והכלאת דגימות למשך זמן ארוך יותר; עם זאת, הכלאה ממושכת עלולה Result ב oversaturation ועשוי לשפר את התוצאות רק אם ריכוזי RNA החל נמוכים (כמו RNA שלפוחית נגזרות התאי). הרגישות של הפלטפורמה ודיוק לאפשר יחסית miRNAs נמוך שפע ייספר באופן מהימן.
מגבלות של הטכניקה
פלטפורמת assay ביטוי גנים לתאר רק להכיל עד 800 יעדים לכל מערך. לכן הוא לא מתאים ללימודים transcriptome transcriptome-מירנה שלם / כולו. רק ידוע, תאר, ואת היעדים שצוינו ניתן לאתר באמצעות הפלטפורמה, כך שהוא אינו מתאים לגילוי מינים מולקולריים חדשים. שיטות אחרות, כגון RNA-seq או שיטות microarray מסורתיות אחרות, מתאימות יותר ללימודי גישוש transcriptome השלם.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
IBS מאופיין על ידי שילוב של תסמינים, principally כולל כאבי בטן; רגישות יתר קרביים; ושינויים בהרגלי היציאות, כגון שלשולים תכופים, עצירות, או שילוב של שניהם 9,10. אין סיבה אורגנית ידועה סימפטומי IBS, וחולים אינם מציגים עם דלקת משמעות קלינית, פרעות histopathological של רקמות של מערכת עיכול, או סמנים מערכתיים 9-12. מחקרים מראים כי חוסר וויסות ביולוגי IBS הוא עדין, תת קלינית, והטרוגנית, עם המתעוררים נושאים משותפים סביב פונקציה דלקת החיסון 10. לכן, אנחנו צריכים לשלוט וריאציה הציג הנסיין ולהשתמש פלטפורמה הייתה מסוגל לאתר הפרעות עדינות אמינים ביטוי גנים. המאפיינים הייחודיים של assay והמערכת לתקנן עיבוד מדגם ולהפחית הנסיין טיפול באמצעות אוטומציה, צמצום שונה טכני להפיק נתונים לשחזור ביותר. תכונות אלו מאפשרות חקירות ממוקדות לייצר מדויק מאוד rנתוני eplicable. זה מאפשר זיהוי של הפרעות עדינות הפרעות בין מטרות נמוך ביטוי ניתן להתעלם או מוצפות על ידי האותות של מטרות שופעות יותר כאשר משתמשים בשיטות intensity- או מבוסס הגברה. microarrays המבוסס PCR ושיטות RNA-seq חלופות קיימא באמצעות הפלטפורמה תארה ועלול להיות אטרקטיבי כפי חלופי כאשר תפוקה גבוהה יותר נדרשות או כאשר המטרה היא לאפיין את transcriptome השלם או לחפש מולקולות רומן. עם זאת, חלופות לא תתפקדנה היטב במדויק וברגישות איתור quantitating מטרות נדירות הפרעות עדינות.
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו
במחזור ביטוי מירנה המשתתפים IBS הראה מספר הפרעות שנמצאו להיות גם הוא משמעותי ומתואם בתוך קטגוריות. MiRNAs המזוהה נקשר pathwa הרלוונטיys ו במצבים פתולוגיים, לרבות בתנאי כאב תפקודיים (Mir-342-3p: כאב בשלפוחית כרוני) 8 ודלקת (Mir-150) 13. המחקר למשל התבסס על עוקבת גישוש המשמשת להגדרת מטרות ומערכות של עניין. עם מיקוד יותר, מערך מירנה קטן נבנה אז, הפחתת מחיר העלות מדגמת ומאפשר מחזורים הרבה יותר גדול להיות מנותחים באופן חסכוני כדי לאמת ולעדן חתימות סמנים ביולוגיות. מערכת assay פלטפורמת ביטוי הגנים מאזנת בין האופי המסורתי הגישוש של microarray וממוקדת יותר, איסוף נתונים מונחה שערה כדי לשכלל ולבחון חתימות מולקולריות ביומרקרים 14-16. השיטה תשמש לבחון הפרעות מולקולריות חלבון in vivo ו במודלים חוץ גופייה שבה miRNAs היעד המתואר הם ניסיוני ביטוי יתר או עכבות. מבחני ניו לאפשר כימות סימולטני של mRNAs ו- proteins ישירות lysates תאים ורקמות. יתר על כן, על ידי אופטימיזציה של הטיהור של שברים מסוימים של דם היקפי וצואה (למשל, שתן) ועל ידי התאמה אישית ואופטימיזציה פרמטרי assay מסוימים, פרופילים מולקולריים וחתימות שברי ריכוז מולקולרי נמוכים (למשל, שברי exosomal) ייבדק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H.
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).
