Abstract
El ensayo de la plataforma de la expresión de genes permite la robusta y altamente reproducible cuantificación de la expresión de hasta 800 transcripciones de ARNm (o miRNAs) en una sola reacción. El ensayo miARN transcripciones cuenta por imágenes de forma directa y contando digitalmente moléculas de miRNA que están etiquetados con conjuntos codificados por colores fluorescentes con código de barras de la sonda (una sonda reportero y una sonda de captura). Los códigos de barras se hibridan directamente a madurar miRNAs que han sido alargadas mediante la ligación de un oligonucleótido de etiqueta única (miRtag) al extremo 3 '. No se requiere la transcripción inversa y la amplificación de las transcripciones. sondas informadoras contienen una secuencia de seis posiciones de color pobladas usando una combinación de cuatro colores fluorescentes. Los cuatro colores más de seis posiciones se utilizan para construir una secuencia de colores de código de barras específico de gen. El procesamiento posterior a la hibridación está automatizado en una estación de la preparación robótica. Después de la hibridación, las sondas en exceso se eliminan por lavado, y las estructuras tripartitas (Capture Proser-miARN-reporter sonda) están fijados a un portaobjetos recubierta con estreptavidina a través de la sonda de captura marcada con biotina. De imágenes de código de barras y el recuento se realiza mediante un analizador digital. El miRNAs con código de barras inmovilizadas se visualizan y imágenes utilizando un microscopio y la cámara, y los códigos de barras únicos se descodifican y se contaron. control de calidad de los datos (control de calidad), la normalización y el análisis se ven facilitadas por un software de procesamiento y análisis de datos de diseño personalizado que acompaña al software de análisis. El ensayo demuestra una alta linealidad en un amplio intervalo de expresión, así como de alta sensibilidad. Y preparación de muestras de ensayo no implica reacciones enzimáticas, la transcripción inversa, o la amplificación; tiene unos pasos; y está muy automatizado, reduciendo los efectos del investigador y lo que resulta en una alta consistencia y reproducibilidad técnica. A continuación, describimos la aplicación de esta tecnología para la identificación de las perturbaciones que circulan miARN en el síndrome del intestino irritable.
Introduction
Síndrome del Intestino Irritable (SII) es el diagnóstico más común para pacientes ambulatorios en Gastroenterología, que afecta a 10 - 15% de la población general y que representa una carga significativa en los servicios de salud. Biomarcadores de diagnóstico Actualmente, no hay generalmente aceptados para el SII (es decir, el diagnóstico se basa en los síntomas clínicos y descartando otros trastornos orgánicos, tales como malignidad gastrointestinal, enfermedades inflamatorias del intestino, y gastrointestinales (GI) infecciones). Al estudiar los perfiles de expresión de genes en condiciones comunes con histopatología subclínica, tales como IBS, alta sensibilidad y precisión (reproducibilidad) son necesarios, como perturbaciones en los perfiles de expresión de genes son a menudo sutiles 1-3. miRNAs han sido identificados como los dos dianas diagnósticas y funcionales en el SII 4,5, y estamos particularmente interesados en la evaluación de su uso como biomarcadores de 3,4,6,7 perturbaciones biológicas asociadas-IBS circulante. La utilización clínica de Circulabiomarcadores ting es de interés actual debido a la facilidad y la naturaleza mínimamente invasiva de la colección de la fuente de los biomarcadores (por ejemplo, sangre periférica) de pacientes.
Los ensayos de plataforma de expresión de genes, debido a su composición química única y flujo de trabajo racionalizado, sobre todo automatizado, proporcionan una plataforma de microarrays que proporciona cobertura amplia y personalizable (800 objetivos en una sola reacción) del transcriptoma para el descubrimiento de destino. También producen una alta precisión y linealidad en un amplio espectro de niveles de expresión en la cuantificación de los objetivos transcriptomic. El ensayo no requiere la transcripción inversa del ARN, la amplificación del cDNA resultante, o cualquier otras reacciones enzimáticas. Por lo tanto, los posibles errores introducidos por los altos números de ciclos de amplificación a partir de especies de ARN con baja abundancia o variantes de empalme raras son reducidos por el proceso de recuento digital. Esto significa que una amplia variedad de tipos de muestras, tales como Total purificadoRNA (es decir, mRNA + miARN), ARN a partir de muestras fijadas con formalina embebidos en parafina (FFPE), así como el tejido crudo y los lisados celulares, se puede utilizar con los ensayos.
ARN de interés se detectan usando un par de sondas (de captura y sondas informadoras), cada uno que contiene una secuencia específica de la diana que reconoce una región correspondiente en el ARN diana. A fin de garantizar la detección de ARN cortos (es decir, miRNAs), la secuencia de los genes miARN maduro es alargada por recocido de una marca de oligonucleótido único (miRtag) al extremo 3 'de la molécula. Un oligonucleótido puente, que es complementaria de una porción de tanto el objetivo miARN maduro y el miRtag miARN-específica, se utiliza para asegurar la especificidad de secuencia. Captura y sondas informadoras ligate a los 3 'y 5' del complejo madura miARN-miRtag, respectivamente. Las sondas de captura tienen una marca de biotina en el extremo 3 ', que les permiten adherirse a la superficie de un portaobjetos de vidrio revestida con estreptavidina, FIXIng de la captura de la sonda-miARN-miRtag-reportero complejo de la sonda a la diapositiva. Una corriente eléctrica se utiliza para orientar el complejo en la superficie de deslizamiento, lo que permite códigos de barras fluorescentes realizadas por la sonda indicadora en el extremo 5 'que se visualizaron utilizando un microscopio y un dispositivo de acoplamiento de carga de la cámara (CCD). Los códigos de barras se cuentan y decodificados, produciendo un recuento de los miRNAs objetivo específicos. El código de barras fluorescente consta de seis posiciones que pueden ser ocupadas por uno de los cuatro colores fluorescentes, que se pueden utilizar para construir más de 4.000 combinaciones de color de códigos de barras, cada uno de codificación para un RNA específico.
Preparación de la muestra (es decir, la purificación del ARN y / o preparación de lisado de tejido celular), así como la hibridación de las sondas de captura y reportero, se llevan a cabo en el banco. Doce muestras pueden ser multiplexados en una sola diapositiva. Después de la hibridación durante una noche, toda la preparación más espécimen se lleva a cabo por una estación de la preparación robótico. Los portaobjetos cargados se transfieren a adanalizador igital para formación de imágenes, el recuento, la decodificación, y procesamiento de datos. Los datos resultantes se importan al software que lo acompaña, donde se procesan adicionalmente con un alto grado de control del usuario. La química única, una preparación simple, la naturaleza automatizada, tipo de dato simple (cuentas), y flujo de trabajo racionalizado general del ensayo de facilitar la alta precisión de la expresión génica cuantificación, por lo que es una herramienta útil en el estudio que circulan perfiles y firmas de expresión de los genes miARN en condiciones funcionales, tales como IBS.
Protocol
La investigación descrita aquí fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de los Institutos Nacionales de la Salud (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).
1. Recolección de muestras de sangre entera
- Recoger muestras de sangre entera (2,5 ml) de los participantes del estudio a través de la punción venosa en tubos de recogida de sangre que contienen una solución de ARN de estabilización (que permite el almacenamiento a largo plazo), y almacenar a -80 ° C hasta la purificación de ARN.
2. ARN total Purificación
- Descongelar e incubar los tubos de sangre durante 2 horas, y luego centrifúguelas usando un rotor basculante durante 10 minutos a 5.000 x g. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente vertiendo o pipeteando apagado en un tubo de residuos, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
- Lavar el precipitado mediante la adición de 4 ml de agua libre de RNasa, vuelva a colocar la tapa de forma segura, y agitar hasta que el sedimento se disuelve de forma visible. Centrifugar usando un rotor basculantes a 5.000 xg durante 10 min y remover el sobrenadante, tal como se describe en el paso 2.1.
- Añadir 350 l de tampón BM1 (incluido) a la pastilla. Vortex la pastilla hasta que se disuelva y la transfiere a un tubo de procesamiento de 2 ml para la extracción de ARN total automatizado visiblemente.
- Realizar la purificación automatizada de RNA intracelular, incluyendo miRNA, de la sangre entera usando un kit de extracción de ARN disponible comercialmente, que puede ser automatizada en un sistema de extracción de RNA robótico.
NOTA: El sistema robótico automatizado que usamos puede procesar doce muestras a la vez, y se tarda 3 horas para el protocolo de purificación de ARN para completar.- Cargar las puntas de pipeta precargados, tubos de centrífuga, tampones y reactivos incluidos en el kit de purificación de ARN en el sistema de extracción de RNA robótico.
- Seleccione el protocolo "Blood miARN Parte A" en el menú de selección de protocolo y empezar la carrera.
NOTA: Ver Materiales suplementarios para una descripción de los procedimientos automatizados. - Una vez que el robot ha completed la parte A del protocolo de purificación miRNA automatizado, vaciar el recipiente de residuos y eliminar los plásticos utilizados y recipientes de reactivo del sistema robótico.
- Cierre las tapas de todos los tubos de microcentrífuga que contenían ARN eluido y colocarlos en el adaptador de la coctelera. Seleccione "miARN Parte B de sangre" en el menú de selección de protocolo incubar las muestras a 65 ° C durante 5 min.
- Una vez que el robot ha completado la ejecución de la parte B del protocolo de purificación miARN, retire inmediatamente las muestras y se ponen a enfriar en hielo.
- Cuantificar y evaluar la calidad del RNA purificado utilizando un espectrofotómetro.
NOTA: De acuerdo con las recomendaciones del protocolo para el ensayo de miARN, una concentración mínima de 33 ng / l es necesario, y todas las muestras deberá cumplir o superar una relación 280/260 de 1,9 y una razón mínima de 260/230 1.8 para asegurar la ausencia de contaminación orgánica significativa, que puede afectar el rendimiento del ensayo (véase la referencia 17). - Almacenar las muestras a -80 ° C
3. Preparación de la muestra miARN
- Normalizar las 12 muestras de ARN a 33 ng / l usando agua libre de nucleasa.
- Preparar una dilución 1: 500 de los controles miARN proporcionados en el kit de ensayo con agua libre de nucleasa. Mantener en hielo.
- Preparar la mezcla maestra de recocido: combinar 13 l de tampón de hibridación (siempre), 26 l de reactivo miRtag (siempre) y 6,5 l de controles miARN (preparado en el paso 3.2) usando pipetas de 10 y 20-l.
- Usando una pipeta de 10-l, añadir 3,5 l de la mezcla maestra de recocido y 3 l de la muestra de ARN (es decir, 100 ng) a cada uno de doce tiras de tubos 0,2 ml. Flick para mezclar, girar hacia abajo utilizando una mesa de trabajo de mini microcentrífuga (2.000 xg), y el lugar en el termociclador (94 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 2 min y 45 ° C durante 10 minutos; mantenga a 48 ° C) .
- Preparar la mezcla maestra ligadura mediante la combinación de 3 μl del tampón de ligación (siempre) y 19,5 l de polietilenglicol (PEG; siempre) utilizando una pipeta de 20 l. Añadir 2,5 l de la mezcla maestra de la ligadura a cada uno de los tubos de la tira de la etapa 3.4 con una pipeta de 10-l.
- Mezclar suavemente, girar hacia abajo usando un mini microcentrífuga de sobremesa (2.000 xg), y volver a la termociclador a 48 ° C durante 5 min. Después de 5 min, usando una pipeta de 10-l, añadir 1 l de ligasa directamente a cada tubo en el termociclador e incubar ellos en 48 ° C durante 3 min, 47 ° C durante 3 min, 46 ° C durante 3 min, 45 o C durante 5 min, y 65 ° C 10 min; mantener a 4 ° C
- Retire los tubos del termociclador, mezclar suavemente, girar hacia abajo utilizando una mesa de trabajo de mini microcentrífuga (2.000 xg), y añadir 1 l de ligación enzimática de limpieza (suministrado). Incubar los tubos en el termociclador (37 ° C durante 1 hora y 70 ° C durante 10 min; mantener a 4 o
- Retire los tubos y, usando una pipeta de 100 l, añadir 40 l de agua libre de nucleasa, mezclar y centrifugar usando un mini microcentrífuga de sobremesa (2.000 xg).
4. La hibridación miARN
- Descongelar el reportero y conjuntos de sonda de captura (incluidos) en hielo y girar hacia abajo usando un mini microcentrífuga de sobremesa (2.000 xg).
- Usando una pipeta de 200-l, añadir 130 l de tampón de hibridación al tubo de conjunto de códigos de reportero (130 l) para crear la mezcla madre de la hibridación. Mezclar y centrifugar usando un mini microcentrífuga de sobremesa (2.000 xg).
NOTA: Reporter y captura sondas son específicas y estándar para cada miARN incluido en el panel. paneles personalizados y de captura y la sonda conjuntos diseñadas por el usuario pueden ser diseñados. - En 12 nuevas tiras de tubos de 0,2 ml, añadir 20 l de la mezcla maestra hibridación usando una pipeta de 20 l.
- Desnaturalizar las muestras procedentes de la etapa miARN 3,7 a 85 ° C for 5 minutos y enfriar en hielo. Añadir 5 l a cada uno de los tubos de la etapa 4.3 con una pipeta de 10-l.
- Programa el termociclador a 65 ° C en un volumen calculado de temperatura y la tapa se calienta a la siempre el tiempo de fraguado (no programarlo a la rampa abajo a 4 o C en el extremo de la pista) 30-l.
- Con una pipeta de 10 l, añadir 5 l de la sonda de captura fijado a cada tubo, mezclar, hacer girar hacia abajo utilizando una mesa de trabajo de mini microcentrífuga (2.000 xg), y colocar inmediatamente en el termociclador a 65 ° C. Incubar durante no menos de 12 horas y no más de 30 horas.
5. Estación de preparación y analizador digital
- Cargar la estación de la preparación.
- Abra la puerta de la estación y cargar las placas de reactivos (siempre), el cartucho (incluido), puntas de pipeta (incluidos), las muestras preparadas en doce tiras de tubos de 0,2 ml, y doce tiras de tubos vacíos de 0,2 ml (suministrado). Retire las tapas de los tubos tira y cubierta de la placa del reactivo. Cierre la preparación-estaciónpuerta y realiza el ensayo apropiado desde el panel de control.
NOTA: El procesamiento posterior a la hibridación es la misma, independientemente de la prueba que se ejecuta. Todos los reactivos y productos de plástico son envasados y no requieren preparación, aparte de llevarlos a temperatura ambiente y girando hacia abajo las placas de 96 pocillos que contienen reactivo en 2.000 xg durante 2 min. Todos los componentes son cargados en posiciones claramente definidas en la estación de la preparación. Ver Materiales complementarios para una descripción de los procedimientos automatizados.
- Abra la puerta de la estación y cargar las placas de reactivos (siempre), el cartucho (incluido), puntas de pipeta (incluidos), las muestras preparadas en doce tiras de tubos de 0,2 ml, y doce tiras de tubos vacíos de 0,2 ml (suministrado). Retire las tapas de los tubos tira y cubierta de la placa del reactivo. Cierre la preparación-estaciónpuerta y realiza el ensayo apropiado desde el panel de control.
- Visualizar y contar los códigos de barras de los complejos tripartitos inmovilizados y orientados.
- Retire el cartucho de la estación de la preparación, sellarlo con la cubierta se desliza previstas, y lo coloca en el analizador digital en la ranura por encima de la óptica de la cámara.
- Seleccione el ensayo apropiado (ensayo de panel de miARN) y la versión de ensayo indicado en el kit de ensayo y ejecutar el programa.
NOTA: El analizador digital de toma entonces el campo de visión de imágenes para cada posición de la muestra unacuatro longitudes de onda de excitación t, permitiendo que los códigos de barras fluorescentes para ser leídos y descodificados. Códigos de barras específicos, que corresponden a un miARN específica, se cuentan. - Exportar los archivos de datos a un puerto USB o directamente al servidor a través de un enlace de Internet.
6. Procesamiento y Análisis de Datos
- Haga clic en la pestaña "Datos en bruto" y seleccione "Importar archivos RCC". Seleccione la carpeta que contiene los archivos de RCC (archivos de datos en bruto) del puerto USB.
- Haga clic en "Siguiente", seleccione todas las casillas de control de calidad, y haga clic en "Importar".
- Haga clic en la pestaña "Nuevo Estudio". Nombrar y describir el estudio y guardar.
- En el nuevo estudio, seleccionar la pestaña "nuevo experimento" y el nombre y describir el nuevo experimento. Haga clic en "Siguiente" y seleccione la carpeta RLF desde el panel de la izquierda que contiene los archivos de datos brutos pertinentes que se han cargado. Una vez que se ha seleccionado, haga clic en "Mantenga seleccionada" y, a continuación, haga clic en "Siguiente".
- Añadiranotaciones si lo desea y haga clic en "Siguiente".
- Seleccione el método de extracción de fondo; ya sea control negativo, resta carril en blanco, o una resta definida por el usuario se pueden seleccionar. Una vez seleccionado, haga clic en "Siguiente".
NOTA: Establecer el método de corrección de fondo más adecuado en función de los parámetros técnicos y de contexto biológico del estudio.
NOTA: Los condes son menos precisos para los objetivos de baja abundancia. A los efectos de este estudio se describe aquí, los datos se procesa en primer lugar y sin corrección de fondo con el fin de examinar los parámetros de control de calidad y para examinar la variación en el recuento de miARN de diferentes abundancias a través de repeticiones técnicos. a continuación, los datos se vuelve a procesar usando un umbral de fondo 25 de recuento. - Seleccione el "Top 100" normalización y, a continuación, haga clic en "Siguiente".
- Para obtener los datos de relación, seleccione los parámetros de relación y, a continuación, haga clic en "Siguiente".
- Haga clic en "Terminado".
- Haga clic en el ex llamadoperimento en el panel de la izquierda para revelar un menú desplegable que contiene "crudo", "normalizada", "Relación de datos" "agrupados", y "Análisis de Datos".
- Haga clic en "datos brutos" y observar un informe de control de calidad en el panel derecho. Observar una bandera al lado de las muestras que no pasan los parámetros de control de calidad predeterminados. Construir un nuevo "Estudio", que no incluye las muestras marcadas y reprocesar como se ha descrito, o simplemente excluir muestras de control de calidad marcados de la etapa de análisis de datos mediante la opción "Excluir muestras de control de calidad de la bandera / normalización".
- Exportar "en bruto", "normalizados", o archivos de datos "agrupados" en CVS o otro formato de archivo compatible para su análisis en otro software de estadística o de microarrays.
- Seleccione "Datos Normalizados" en el panel izquierdo y seleccione las muestras que se incluirán en el análisis en el panel derecho.
- Haga clic en "Análisis" y seleccione el tipo de análisis deseado (por ejemplo, "mapa de calor & #34 ;, "Violín Plot", "Diagrama de cajas", "gráfico de dispersión", o "histograma"). Seleccione las casillas de criterios de exclusión deseados (por ejemplo, excluir las muestras de valores atípicos o genes, excluir las muestras por las banderas de control de calidad, excluir a los genes de control, y / o excluir las sondas de normalización de análisis de datos).
- Seleccionar muestras individuales que se excluyó del análisis si lo deseas.
- Seleccionar los genes individuales a ser excluidos o incluidos en el análisis si lo deseas.
- Seleccione los parámetros para la manipulación estadística o visualización de datos seleccionado y haga clic en "Finalizar".
Representative Results
perturbación Transcriptomic en los trastornos funcionales puede ser sutil, y con el fin de detectar de forma fiable los cambios sutiles en la expresión, la cuantificación de la expresión génica tiene que ser precisa. El sistema de ensayo plataforma de la expresión de genes reduce el ruido técnica a través de su naturaleza altamente automatizado, y la química única que utiliza produce alta precisión los datos de expresión génica. Técnica replica muestra en la Figura 1 demuestran la alta reproducibilidad en ambos (puntos azules) endógenos y miARN viral (puntos de color naranja; genes de limpieza están representados por puntos amarillos) la expresión de cuantificación que es posible utilizando este método. Usando este método, viral (Figura 2a) y endógena (Figura 2b) miRNAs que muestran la desviación de la expresión era de esperar, tal como se define por los participantes del estudio sanos, puede ser identificado como dianas de interés en el SII. Cabe señalar que no está claro si los miRNAs viralesdetectado aquí se derivan de genes virales integradas en el genoma humano o de la carga viral. Como el ensayo sólo cuenta miRNAs maduros con especificidad de un solo nucleótido, la hibridación cruzada con miRNAs humanos endógenos similares es poco probable. No obstante, los niveles de estado estacionario diferenciales de estas moléculas son de interés como biomarcadores. La precisión del método permite que se detecten perturbaciones entre los objetivos de expresión bajos, como una detección precisa de estas transcripciones no están inundados por más abundantes transcripciones. Perturbaciones sutiles también se pueden observar de forma fiable. Las Figuras 3 y 4 muestran algunas de estas perturbaciones en circulación miRNAs en IBS y SII-subtipos en comparación con controles sanos, y las figuras 5 y 6 (ambos adaptado de 3) muestran los dos miRNAs diferencialmente elevados más significativos (Figura 5: miARN 342-3p, Figura 6: miARN 150). participantes en la figura 6 SII es un ejemplo de la representación gráfica de los resultados generados por el software asociado.
. Figura 1: recuentos normalizados de dos repeticiones técnica Técnica replica ejecuta en dos cartuchos separados muestran alta correlación lineal (r 2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) en el rango de la normalizada (normalizada a los 100 primeros expresó miRNAs) miARN conteos log2 (cuentan en la ejes X e y). El gráfico de dispersión incluye los datos de miRNAs humanos endógenos en azul (654 miRNAs), miRNAs virales endógenas en naranja (80 miRNAs), y los genes de limpieza en amarillo (8 genes). miRNAs virales endógenas estaban disponibles en versiones anteriores del ensayo (versión 1.4 se utiliza aquí), pero ya no se incluyen en el ensayo estándar, aunque están disponibles como adiciones personalizados./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Recuentos normalizados de viral y endógenos miRNAs humanos en el SII-estreñimiento (IBS- C) frente a controles sanos Las perturbaciones en (a) viral (naranja) y (b) miRNAs humanos endógenos (azul) son evidentes en este ejemplo, donde conteos miARN (log2 transformado) de los participantes del IBS-C (eje y) se regresan en contra de los recuentos de miARN (log2 transformada) de los controles sanos (eje x). La mayoría de los miRNAs expresar de manera muy similar en ambas poblaciones, pero algunos se apartan notablemente de la correlación. Estas desviaciones son evidentes entre ambos objetivos raras y abundantemente expresado. Por favor,clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. MiRNAs son significativamente y de manera uniforme expresados diferencialmente en el SII En comparación con los controles sanos diferencialmente expresado miRNAs en el SII se revelan utilizando el método de tamaño lineal discriminante efecto de análisis, que combina las pruebas de significación estadística con los controles de consistencia dentro de las categorías. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. MiRNAs son significativamente y de manera uniforme expresados diferencialmente en el SII subtipos En comparación con los controles sanos fueron miRNAs differentially expresado en IBS-subtipos (-D: diarrea, -C: estreñimiento). comparación con los controles sanos, utilizando el método de tamaño lineal discriminante efecto de análisis, que combina las pruebas de significación estadística con los controles de consistencia dentro de las categorías Haga clic aquí para ver una más grande versión de esta figura.
Figura 5:. Expresión diferencial de los genes miARN-342-3p dolor abdominal crónico de etiología desconocida es un síntoma principal de IBS. El diagrama de caja muestra que el miR-342-3p (recuentos normalizados en el eje Y), un miRNA asociados con el dolor crónico de la vejiga, de etiología desconocida, se encontró a estar presentes en la circulación con recuentos más altos en todos los subtipos de SII en comparación con los controles sanos. Las barras representan el rango no atípico, el cuadroes el rango intercuartil y el cuadrado azul de la mediana del recuento. Modificado de 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: expresión diferencial de los genes miARN-150 Un gráfico del violín que muestra que los participantes con SII tenían significativamente más alta que circula miR-150 conteos en comparación con los controles sanos (log2 recuentos transformado en el eje Y).. Las curvas indican la frecuencia de los recuentos en la categoría, las barras verticales representan el 1 ° y 3 rd cuartiles, y el cuadrado rojo indica la mediana del recuento. Modificado de 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Para el ensayo de miARN en particular, es crítico a no utilizar lisados no purificados (estos pueden ser utilizados en el ARNm y los ensayos de proteínas), ya que los reactivos no se han optimizado para su uso con lisados, y las reacciones de preparación de muestras son susceptibles de ser inhibido. Además, los contaminantes transferirse de pasos de lisis y purificación de ARN (por ejemplo, compuestos de guanidinio, etanol, y fenoles) puede inhibir la ligadura y la Purificación de la muestra reacciones. RNA de buena calidad, por lo tanto es crítico para la sensibilidad y la exactitud del ensayo miRNA.
El uso de un termociclador con una tapa calentada es crítica para asegurar el control de temperatura adecuada para optimizar el rendimiento de todas las etapas de reacción. Durante el paso 3.5.1, es importante no eliminar las tiras de la termociclador con el fin de mantener la temperatura durante la adición de la ligasa. La eliminación de las tiras para agregar la ligasapondrá en peligro la reacción. Al llevar a cabo las etapas de hibridación, es fundamental para evitar una agitación vigorosa, pipeteado, o prender cuando se mezclan los reactivos en los tubos, ya que esto podría romper las sondas indicadoras. Para garantizar un rendimiento óptimo y la consistencia, es importante para mezclar completamente los reactivos en los tubos con un movimiento rápido suave. Siempre de girar reacciones después de la mezcla, y el uso de una nueva pipeta de punta cada vez que un reactivo se dispensa para asegurar el pipeteo preciso y para evitar la contaminación cruzada accidental.
Modificaciones y solución de problemas
Los conjuntos de códigos pueden ser personalizados para incluir sólo los objetivos de interés. De esta manera, los costos pueden ser equilibradas para permitir la comprobación de grandes conjuntos de la muestra cuando se investiga más o validación de un bio-firma. Sondas personalizadas pueden ser diseñadas para los genes o no los objetivos disponibles en el menú a la carta. La sensibilidad para objetivos menos abundantes o ARN de baja concentración puede sermanipulado por lo que permite un tiempo de hibridación más largo y / o mediante el uso de recuento digital de mayor resolución.
En nuestro estudio hemos utilizado el panel de destino predefinido 800 miRNA con el ARN total a partir de sangre entera; Sin embargo, los ensayos pueden ser personalizados para incluir un menor número de miRNAs si se necesita un enfoque más específico. Un total de 24 muestras se puede preparar en un solo día, escalonados en dos series de 12, debido a que dos cartuchos cómodamente se pueden pasar a través del procesamiento posterior a la hibridación en la estación de la preparación robótica y la imagen en el analizador digital de al día siguiente. procesamiento escalonada de las muestras en lotes de 12 es importante para estandarizar el tiempo de hibridación. Los cartuchos que han sido fotografiadas pueden ser guardados y almacenados a volver a escanear 4 ° C si los análisis de datos sugieren que una exploración de una resolución más alta puede mejorar la detección de miRNAs más raras. La detección de moléculas más raras también puede mejorarse mediante la hibridación de muestras durante más tiempo; Sin embargo, la hibridación prolongada puede Result en la sobresaturación y sólo pueden mejorar los resultados si las concentraciones de partida de ARN son bajos (como en el ARN extracelular de vesículas derivado). la sensibilidad y la precisión de la plataforma permiten relativamente baja abundancia miRNAs a ser contados de forma fiable.
Limitaciones de la Técnica
La plataforma de ensayo de expresión génica se describe solamente tiene capacidad para hasta 800 objetivos por conjunto. Por lo tanto, no es adecuado para los estudios del transcriptoma enteros toda miARN-transcriptoma /. Sólo conocidos, descritos, y los objetivos especificados se pueden detectar usando la plataforma, por lo que no es adecuado para el descubrimiento de nuevas especies moleculares. Otros métodos, como RNASeq u otros métodos tradicionales de microarrays, son más adecuadas para toda transcriptoma estudios exploratorios.
Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes
IBS se caracteriza por una combinación de síntomas, prinincluyendo palmente dolor abdominal; hipersensibilidad visceral; y cambios en los hábitos intestinales, como diarrea frecuente, estreñimiento, o una combinación de ambos 9,10. Los síntomas del SII no tienen una causa orgánica conocida, y los pacientes no presentan con la inflamación clínicamente significativa, perturbaciones gastrointestinales histopatológicas de tejidos o marcadores sistémicos 9-12. La investigación sugiere que la desregulación biológica en el SII es sutil, subclínica y heterogénea, con temas comunes que emerge en torno inflamación y la función inmune 10. Por lo tanto, teníamos que controlar la variación experimentador a introducir y utilizar una plataforma que fue capaz de detectar de forma fiable las perturbaciones sutiles en la expresión génica. Los atributos únicos del ensayo y el sistema de procesamiento de la muestra estandarizar y reducir experimentador manipulación a través de la automatización, reduciendo la variación técnica para producir datos altamente reproducibles. Estas características permiten investigaciones enfocadas y producen altamente preciso y replicable datos. Esto permite la detección de las perturbaciones sutiles y perturbaciones entre los objetivos de bajo de expresión que pueden ser pasados por alto o inundado por las señales de los objetivos más abundantes utilizando intensidad- o basados en la amplificación métodos. microarrays basados en la PCR y métodos RNAseq son alternativas viables a través de la plataforma se describe y pueden ser atractivos como alternativa cuando se requieren mayores rendimientos o cuando el objetivo es caracterizar todo el transcriptoma o para buscar nuevas moléculas. Sin embargo, las alternativas pueden no funcionar tan bien en la detección y cuantificación de objetivos nobles y perturbaciones sutiles con precisión y sensibilidad.
Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica
Que circula miARN expresión en los participantes de IBS mostró una serie de perturbaciones que se han encontrado para ser significativa y coherente dentro de las categorías. El miRNAs identificados fueron asociados con pathwa relevanteys y condiciones patológicas, incluyendo una condición funcional del dolor (miR-342-3p: el dolor crónico de la vejiga) 8 y la inflamación (miR-150) 13. El estudio ejemplo se basa en una cohorte de exploración se utiliza para definir los objetivos y sistemas de interés. a continuación, se construyó una, más pequeña gama miARN más específico, la reducción del coste de la muestra y por ser analizada de manera rentable a fin de validar y refinar las firmas y los biomarcadores que permite para las cohortes más grandes. El sistema de ensayo plataforma de expresión génica establece un equilibrio entre la naturaleza exploratoria tradicional de la micromatriz y más específico, la recopilación de datos basadas en hipótesis de refinar y evaluar las firmas moleculares y biomarcadores 14-16. El método se puede utilizar para examinar perturbaciones moleculares y proteína en in vivo y en modelos in vitro, donde los miRNAs objetivo descritos son experimentalmente sobre-expresado o inhibe. Nuevos ensayos permiten la cuantificación simultánea de mRNAs y proteins directamente a partir de lisados de células y tejidos. Además, mediante la optimización de la purificación de las fracciones específicas de la sangre periférica y los excrementos (por ejemplo, orina) y por personalizar y optimizar ciertos parámetros del ensayo, perfiles moleculares y las firmas de fracciones de concentración molecular bajo (por ejemplo, fracciones exosomal) se examinarán.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
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