We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Genuttrykket plattform analysen åpner for robust og svært reproduserbare kvantifisering av uttrykk for opptil 800 transkripsjoner (mRNA eller mirnas) i en enkelt reaksjon. Den miRNA analysen teller transkripsjoner av direkte bildebehandling og digitalt telle miRNA molekyler som er merket med fargekodede fluorescerende strekkode probe sett (en reporter probe og en fange probe). Strekkoder blir hybridisert direkte til modne mirnas som har blitt forlenget med ligering av en unik kode oligonukleotid (miRtag) til 3'-enden. Revers transkripsjon og amplifikasjon av transkriptene er ikke nødvendig. Rapportør prober inneholder en sekvens av seks farge stillinger befolket ved hjelp av en kombinasjon av fire fluorescerende farger. De fire farger enn seks stillinger blir brukt til å konstruere et gen-spesifikk farge strekkode sekvens. Post-hybridisering prosessering er automatisert på en robot prep stasjon. Etter hybridisering, overflødig sondene er vasket bort, og tredelt strukturer (capture provære-miRNA-reporter probe) er festet til en streptavidin-belagt lysbilde via biotin-merket fangst probe. Bildebehandling og strekkode telling gjøres ved hjelp av en digital analysator. De immobiliserte strekkode mirnas er visualisert og avbildes ved hjelp av et mikroskop og kamera, og de unike strekkoder dekodes og telles. Data kvalitetskontroll (QC), normalisering og analyse er tilrettelagt av en spesialdesignede dataprosessering og analyse programvare som følger med analysen programvare. Analysen demonstrerer høy linearitet over et bredt område av ekspresjon, så vel som høy følsomhet. Prøve og analyse forberedelse ikke involverer enzymatiske reaksjoner, revers transkripsjon, eller forsterkning; har noen få skritt; og er i stor grad automatisert, noe som reduserer etterforsker effekter og resulterer i høy konsistens og teknisk reproduserbarhet. Her beskriver vi anvendelsen av denne teknologien for å identifisere sirkulerende miRNA forstyrrelser i irritabel tarm syndrom.
Irritabel tarm syndrom (IBS) er den vanligste poliklinisk diagnose i gastroenterologi, som rammer 10-15% av befolkningen og som representerer en betydelig belastning for helsetjenesten. For tiden er det ingen allment aksepterte diagnostiske biomarkører for IBS (dvs. er diagnosen basert på kliniske symptomer og utelukker andre organiske lidelser, for eksempel GI malignitet, inflammatoriske tarmsykdommer, og gastrointestinal (GI) infeksjoner). Når man studerer genuttrykk profiler i vanlige tilstander med subklinisk histopatologi, som IBS, høy følsomhet og nøyaktighet (reproduserbarhet) er nødvendig, som forstyrrelser i genuttrykk profiler er ofte subtil 1-3. mirnas har blitt identifisert som både diagnostiske og funksjonelle mål i IBS 4,5, og vi er spesielt interessert i å vurdere sin bruk som sirkulerende biomarkører av IBS-assosiert biologiske perturbasjon 3,4,6,7. Den kliniske utnyttelse av opplagskaps biomarkører er aktuelt på grunn av enkel og minimal invasiv natur samling av de biomarkører 'kilde (f.eks perifert blod) fra pasienter.
Genekspresjon plattform analyser, på grunn av deres unike kjemi og strømlinjeformet, for det meste automatisk arbeidsflyt, tilveiebringe en microarray plattform som gir bred og tilpasses dekning (800 mål i et enkelt reaksjons) av transkriptomet for målrettet oppdagelse. De gir også høy presisjon og linearitet over et bredt spektrum av ekspresjonsnivåer i kvantifisering av transcriptomic mål. Analysen ikke krever revers transkripsjon av RNA, forsterkningen av resulterende cDNA, eller andre enzymatiske reaksjoner. Således er potensielle feil introdusert av de høye syklus antallet amplifikasjon fra RNA-arter med lav overflod eller sjeldne spleisevarianter redusert ved fremgangsmåten i digital telling. Dette betyr at en lang rekke prøvetyper, slik som renset totalRNA (dvs. mRNA + miRNA), RNA fra formalin-fikserte parafininnstøpte (FFPE-prøver), så vel som et ubehandlet vev og cellelysatene, kan brukes med analysene.
RNA av interesse blir detektert ved hjelp av et par av prober (fangst og rapportør prober), hver inneholdende en mål-spesifikk sekvens som gjenkjenner et tilsvarende område i target RNA. For å sikre deteksjon av korte RNA (dvs., mirnas), blir den modne sekvens miRNA langstrakte å varmebehandle en unik kode oligonukleotid (miRtag) til 3'-enden av molekylet. En brodannende oligonukleotid, som er komplementære til en del av både den modne mål miRNA og miRNA-spesifikke miRtag, blir brukt for å sikre sekvens spesifisitet. Fangst og reporter prober ligere til 3'- og 5'-endene av de modne miRNA-miRtag kompleks, respektivt. Fangst sonder har en biotin etikett på 3 'enden, som tillater dem å feste seg til overflaten av et streptavidin-belagt glass slide, fixing fangst probe-miRNA-miRtag-reporter probe komplekse til raset. En elektrisk strøm blir så brukt til å orientere kompleks på glideflate, slik at fluorescerende strekkoder som bæres av reporter-proben på 5'-enden for å bli visualisert ved hjelp av et mikroskop og CCD (CCD) kamera. Strekkoder telles og dekodet, noe som gir et tall for spesifikke målet miRNAs. Det fluorescerende strekkode består av seks posisjoner som kan være okkupert av en av fire fluorescerende farger, som kan brukes til å konstruere over 4000 farge-strekkode kombinasjoner, som hver koder for en spesifikk RNA.
Prøvepreparering (dvs. RNA-rensing eller celle / vev-lysat fremstilling), samt hybridisering av fangst og reporter prober, er gjort på benken. Tolv prøver kan multiplekset på et enkelt lysbilde. Etter over natten hybridisering, er all videre prøven forberedelse utført av en robot prep stasjon. De lastet lysbildene blir deretter overført til annonsenigital analysator for bildebehandling, telling, dekoding, og databehandling. De resulterende dataene blir importert til den medfølgende programvare, hvor de blir ytterligere behandlet med en høy grad av brukerkontroll. Den unike kjemi, enkel forberedelse, automatisert natur, enkel datatype (teller), og samlet strømlinjeformet arbeidsflyt av analysen lette høy presisjon genekspresjon kvantifisering, noe som gjør det til et nyttig verktøy i å studere sirkulerende miRNA uttrykk profiler og signaturer i funksjonelle forhold som IBS.
Kritiske trinn i protokollen
For miRNA analysen i særdeleshet, er det viktig å ikke bruke urensede lysater (disse kan brukes i mRNA og proteinanalyser), som reagensene ikke har blitt optimalisert for bruk med lysater, og prøvefremstillingsreaksjoner er sannsynlig å bli hemmet. I tillegg forurensninger overført fra lyse og RNA-rensetrinn (f.eks guanidinium-forbindelser, etanol, og fenoler) kan hemme ligerings og prøverensings reaksjoner. God kvalitet RNA er derfor kritisk for følsomheten og nøyaktigheten av miRNA analysen.
Ved hjelp av en termosykler med en oppvarmet lokk er kritisk for å sikre riktig temperaturkontroll for å optimalisere ytelsen av alle reaksjonstrinn. Under trinn 3.5.1, er det viktig ikke å fjerne strimlene fra thermocycler for å opprettholde temperaturen under tilsetningen av den ligase. Fjerne strips for å legge til ligasevil kompromittere reaksjonen. Ved utføring av hybridiserings-fremgangsmåten, er det viktig å unngå kraftig risting, pipettering, eller knipse ved å blande reagensene i rørene, da dette kan skjære rapportør prober. For å sikre optimal ytelse og konsistens, er det viktig å grundig blande reagenser i rørene ved forsiktig flicking. Alltid spinne ned reaksjoner etter blanding, og bruke en ny pipette tips hver gang en reagens utlevert for å sikre nøyaktig pipettering og for å unngå utilsiktet krysskontaminering.
Modifikasjoner og feilsøking
Kodesettene kan tilpasses til å omfatte kun mål av interesse. På denne måte kan kostnadene balansert for å tillate testing av store prøvesett når ytterligere å undersøke eller validere et bio-signatur. Custom prober kan være konstruert for gener eller målene ikke tilgjengelig fra a la carte meny. Følsomhet for mindre rikelig mål eller lav konsentrasjon RNA kan væremanipulert ved å tillate en lengre hybridisering tid og / eller ved anvendelse av høyere oppløsning digital telling.
I vår studie har vi brukt den forhåndsdefinerte 800 mål miRNA panel med total RNA fra fullblod; kan imidlertid analysene tilpasses til å omfatte færre mirnas om en mer målrettet tilnærming er nødvendig. Totalt 24 prøver kan være forberedt på en enkelt dag, forskjøvet i to sett av 12, fordi to patroner kan godt være gått gjennom post-hybridisering prosessering på robot prep stasjon og avbildes på digital analysator neste dag. Forskjøvet behandling av prøvene i grupper av 12 er viktig for å standardisere hybridisering tid. Kassetter som har blitt avbildet kan lagres og oppbevares ved 4 o C som skal skannes på nytt ved data analyser tyder på at en høyere oppløsning skanning kan forbedre deteksjonen av sjeldne miRNAs. Påvisning av sjeldne molekylene kan også bli forbedret ved hybridisering av prøver for lengre; men kan forlenges hybridisering Result i oversaturation og kan bare forbedre resultat hvis utgangs RNA-konsentrasjoner er lave (som i ekstracellulære vesikkel-avledet RNA). Plattformen følsomhet og presisjon tillate relativt lav overflod mirnas å bli pålitelig telles.
Begrensninger av teknikken
Den beskrevne genuttrykk analyseplattform plass til bare opp til 800 mål per array. Det er derfor ikke egnet for hele miRNA-transkriptom / hele transkriptom studier. Eneste kjente, beskrevet, og gitte mål kan påvises ved hjelp av plattformen, slik at det ikke er egnet til oppdagelsen av nye molekylarter. Andre metoder, som for eksempel RNASeq eller andre tradisjonelle microarray metoder, er mer egnet til hele transkriptom utforskende studier.
Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder
IBS er preget av en kombinasjon av symptomer, prinsaklig inkludert magesmerter; visceral hypersensitivitet; og endringer i avføringsvaner, slik som hyppig diaré, forstoppelse, eller en kombinasjon av begge deler 9,10. IBS symptomer har ingen kjent organisk årsak, og pasienter ikke presentere med klinisk signifikant betennelse, histopatologiske forstyrrelser av gastrointestinale vev, eller systemiske markører 9-12. Forskning tyder på at biologisk feilregulering i IBS er subtile, subklinisk, og heterogen, med felles temaer dukker opp rundt betennelser og immunforsvar 10. Derfor trengte vi å kontrollere experimenter-introdusert variasjon og bruke en plattform som var i stand til på en pålitelig måte å oppdage subtile forstyrrelser i genuttrykk. De unike egenskapene til analysen og systemet standardisere utvalgets behandling og redusere eksperimentator håndtering gjennom automatisering, redusere teknisk varians for å produsere svært reproduserbare data. Disse funksjonene tillater fokuserte undersøkelser og produsere svært presis og replicable data. Dette gjør det mulig for påvisning av små forstyrrelser og forstyrrelser hos lav-uttrykk mål som kan overses eller overbelastet av signaler fra mer rikelig mål ved bruk av Intensitetsmodulert eller amplifikasjons-baserte metoder. PCR-baserte mikromatriser og RNAseq metoder er levedyktig alternativ til å bruke den beskrevne plattform og kan være attraktive som alternativ når høyere hastigheter er nødvendig, eller når målet er å karakterisere hele transkriptomet eller for å lete etter nye molekyler. Men alternativer kan ikke utføre så vel i nøyaktig og sensitiv påvisning og kvantifisering av sjeldne mål og subtile forstyrrelser.
Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Sirkulerende miRNA ekspresjon i IBS deltakerne en rekke perturbasjoner som ble funnet å være både større og konsekvent innenfor kategoriene. De identifiserte mirnas var assosiert med relevant pathways og patologiske tilstander, inkludert en funksjonell smerte tilstand (MIR-342-3p: kronisk blæresmerter) 8 og betennelse (MIR-150) 13. Eksempelet Studien var basert på en utforskende kohort brukes til å definere mål og systemer av interesse. En mer målrettet, mindre miRNA utvalg ble deretter konstruert, senke per prøve kostnader og åpner for mye større kohorter som skal analyseres i en kostnadseffektiv måte for å validere og raffinere signaturer og biomarkører. Genuttrykket plattformen analysesystem treffer en balanse mellom det tradisjonelle utforskende natur microarray og mer målrettet, hypotese-drevet datainnsamling for å avgrense og teste molekylære signaturer og biomarkører 14-16. Fremgangsmåten vil bli brukt til å undersøke molekylære og protein forstyrrelsene i in vivo og in vitro-modeller hvor de beskrevne mål mirnas er eksperimentelt overuttrykt eller hemmet. Nye analyser tillate samtidig kvantifisering av mRNA og proteins direkte fra celler og vev lysatene. Videre ved å optimalisere rensing av spesielle fraksjoner av perifert blod og ekskrementer (f.eks urin) og ved å tilpasse og optimalisere visse analyseparametere, molekylære profiler og signaturer av molekylære konsentrasjons fraksjoner (f.eks exosomal fraksjoner) lav vil bli undersøkt.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
nSolver | Nanostring | N/A | Essential |