We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Den genekspression platform analysen muliggør en robust og meget reproducerbar kvantificering af ekspressionen af op til 800 transkripter (mRNA eller miRNA) i en enkelt reaktion. Den miRNA-analysen tæller udskrifter ved direkte imaging og digitalt tælle miRNA molekyler, der er mærket med farvekodede fluorescerende stregkodede probe sæt (en reporter probe og en capture sonde). Stregkoder hybridiseres direkte til modne miRNA, der er blevet forlænget med ligering af et unikt oligonucleotid tag (miRtag) til 3'-enden. Revers transskription og amplifikation af transkripter er ikke nødvendige. Reporter prober indeholde en sekvens af seks farver positioner befolkede anvendelse af en kombination af fire fluorescerende farver. De fire farver over seks positioner anvendes til at konstruere et gen-specifik farve stregkode sekvens. Post-hybridisering behandling er automatiseret på en robot prep station. Efter hybridisering de overskydende sonder vaskes bort, og de trepartsstrukturer (capture provære-miRNA-reporter probe) er fastgjort til en streptavidin-overtrukket objektglas via biotinmærket opfangningsprobe. Imaging og stregkode optælling sker ved hjælp af en digital analysator. De immobiliserede stregkodede miRNA visualiseres og filmede med et mikroskop og kamera, og de unikke stregkoder afkodes og tælles. Data, kvalitetskontrol (QC), normalisering og analyse lettes ved en specialdesignede databehandling og analyse software, der følger med analysen software. Assayet demonstrerer høj linearitet over et bredt område af ekspression, såvel som høj følsomhed. Prøve og assay forberedelse ikke involverer enzymatiske reaktioner, revers transkription, eller forstærkning; har få skridt; og er i høj grad automatiseret, hvilket reducerer investigator effekter og resulterer i høj konsistens og teknisk reproducerbarhed. Her beskriver vi anvendelsen af denne teknologi til at identificere cirkulerende miRNA forstyrrelser i irritabel tyktarm.
Irritabel tyktarm (IBS) er den mest almindelige ambulante diagnose i Gastroenterology, plager 10 – 15% af den almindelige befolkning, og som repræsenterer en betydelig byrde for sundhedsvæsenet. I øjeblikket er der ingen generelt accepterede diagnostiske biomarkører for IBS (dvs. er diagnosen baseret på kliniske symptomer og udelukke andre organiske lidelser, såsom GI malignitet, inflammatoriske tarmsygdomme, og gastrointestinale (GI) infektioner). Når man studerer genekspressionsprofiler i fælles betingelser med subklinisk histopatologi, såsom IBS, høj følsomhed og nøjagtighed (reproducerbarhed) Der er behov for, som perturbationer i genekspression profiler er ofte subtile 1-3. miRNA er blevet identificeret som både diagnostiske og funktionelle mål i IBS 4,5, og vi er særligt interesseret i at vurdere deres anvendelse som cirkulerende biomarkører for IBS-associerede biologiske forstyrrelser 3,4,6,7. Den kliniske anvendelse af omløbTing biomarkører er af aktuel interesse på grund af den lethed og minimalt invasiv karakter af indsamlingen af biomarkører 'kilde (f.eks perifert blod) fra patienter.
Genekspression platform assays, på grund af deres unikke kemi og strømlinet, hovedsagelig automatiseret workflow, give et mikroarray platform, der giver bredt og kan tilpasses dækning (800 mål i en enkelt reaktion) af transkriptomet for målrettet opdagelse. De giver også høj præcision og linearitet over et bredt spektrum af ekspressionsniveauer i kvantificeringen af transkriptomisk mål. Assayet kræver ikke revers transkription af RNA, amplifikation af resulterende cDNA, eller andre enzymatiske reaktioner. Således er potentielle fejl indført ved de høje cyklus antal forstærkning fra RNA-arter med lav tæthed eller sjældne splejsningsvarianter reduceret med processen med digital optælling. Det betyder, at en lang række prøvetyper, såsom oprenset samledeRNA (dvs. mRNA + miRNA), RNA fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) prøver samt rå vævs- og cellelysater, kan anvendes med de assays.
RNA af interesse detekteres ved hjælp af et par af prober (opsamling og reporter sonder), som hver indeholder en target-specifik sekvens, der genkender en tilsvarende område på målet RNA. For at sikre påvisning af korte RNA'er (dvs. miRNA), er den modne miRNA sekvensen forlænget ved annealing en unik oligonucleotid tag (miRtag) til 3'-enden af molekylet. Et brodannende oligonukleotid, der er gratis til en del af både det modne mål miRNA og miRNA-specifikke miRtag, anvendes til at sikre sekvensspecificitet. Capture og reporter prober ligere til 3'- og 5'-ender af det modne miRNA-miRtag kompleks hhv. Indfangningsproberne har en biotinmærke ved 3 'enden, som giver dem mulighed for at vedhæfte til overfladen af en streptavidin-overtrukket objektglas, Fixing indfangningsproben-miRNA-miRtag-reporter sonde komplekset til dias. En elektrisk strøm anvendes derefter til at orientere kompleks på glidefladen, hvilket tillader fluorescerende stregkoder bæres af reporter sonde på 5'-enden, der skal visualiseres ved mikroskopi og charge-coupled device (CCD) kamera. Stregkoder tælles og afkodes, hvilket giver en optælling af de specifikke mål miRNA. Den fluorescerende stregkode består af seks positioner, der kan benyttes af en af fire fluorescerende farver, som kan anvendes til at konstruere flere end 4.000 farve-stregkode kombinationer, hver koder for et specifikt RNA.
Prøve forberedelse (dvs. RNA rensning eller celle / væv lysat forberedelse), samt hybridisering af capture og reporter sonder, er færdig på bænken. Tolv prøver kan multiplekses på en enkelt dias. Efter natten over hybridisering, er alle yderligere forberedelse eksemplar udført af en robot prep station. De fyldte objektglas overføres derefter til annonceigital analysator til billeddannelse, optælling, afkodning og databehandling. De resulterende data importeres til den medfølgende software, hvor de videreforarbejdes med en høj grad af brugerkontrol. Den unikke kemi, simple metoder, automatiseret natur, simpel datatype (tæller), og den samlede strømlinet arbejdsgang for analysen lette høj præcision genekspression kvantificering, hvilket gør det til et nyttigt redskab i at studere cirkulerende miRNA udtryk profiler og underskrifter i funktionelle forhold såsom IBS.
Kritiske trin i protokollen
På miRNA assayet især det kritisk ikke at bruge urensede lysater (disse kan bruges i mRNA og protein assays), som reagenserne ikke er blevet optimeret til brug med lysater, og prøveforberedelse reaktioner sandsynligvis vil blive inhiberet. Derudover forureninger fremført fra lysis og RNA oprensningstrin (f.eks guanidinium forbindelser, ethanol og phenoler) kan inhibere ligerings- og prøve rensning reaktioner. God kvalitet RNA er derfor afgørende for følsomheden og nøjagtigheden af miRNA-analysen.
Ved hjælp af en thermocycler med et opvarmet låg er afgørende for at sikre korrekt temperaturkontrol at optimere ydeevnen for alle reaktionstrin. Under trin 3.5.1, er det vigtigt ikke at fjerne strimlerne fra thermocycler for at holde temperaturen under tilsætningen af ligasen. Fjernelse strimlerne at tilføje ligasevil kompromittere reaktionen. Ved afprøvning af hybridiseringstrin, er det afgørende at undgå kraftig omrystning, pipettering eller flicking ved blanding reagenser i rørene, da dette kan forskyde reporter prober. For at sikre optimal ydeevne og konsistens, er det vigtigt at grundigt at blande reagenser i rørene ved forsigtig zappe. Altid spin ned reaktioner efter blanding, og brug en ny pipettespids hver gang et reagens dispenseres at sikre nøjagtig pipettering og for at undgå utilsigtet krydskontaminering.
Ændringer og fejlfinding
De kodesæt kan tilpasses til at omfatte kun mål af interesse. På denne måde kan omkostningerne være afbalanceret for at give mulighed for afprøvning af store prøvesæt når yderligere efterforskning eller validering af en bio-signatur. Brugerdefinerede prober kan designet til gener eller mål ikke tilgængelig fra a la carte menu. Følsomhed for mindre rigelige mål eller lav koncentration RNA kan væremanipuleres ved at tillade en længere hybridisering tid og / eller ved anvendelse højere opløsning digital tælling.
I vores undersøgelse har vi brugt den foruddefinerede 800 target miRNA panel med total RNA fra fuldblod; dog kan analyserne tilpasses til at omfatte færre miRNA, hvis der behov for en mere målrettet tilgang. kan tilberedes i alt 24 prøver på en enkelt dag, forskudt i to sæt af 12, fordi to patroner mageligt kan føres gennem post-hybridisering behandling på robot prep station og afbildet på det digitale analysator den næste dag. Forskudt behandling af prøverne i partier af 12 er vigtigt at standardisere hybridiseringstiden. Patroner, der er blevet afbildet kan gemmes og opbevares ved 4 ° C til scannes igen, hvis data analyser tyder på, at en højere opløsning scanning kan forbedre påvisningen af sjældnere miRNA. Påvisning af sjældnere molekyler kan også forbedres ved at hybridisere prøverne i længere tid; dog kan forlænges hybridisering Result i overmætning og kan kun forbedre resultat, hvis den RNA-koncentrationerne er lav (som i ekstracellulær vesikel-afledt RNA). Platformens følsomhed og præcision tillader relativt lav overflod miRNA troværdigt tælles.
Begrænsninger af teknikken
Det beskrevne genekspression assay platform kun kan rumme op til 800 mål pr array. Den er derfor ikke egnet til hele miRNA-transkriptom / hele transkriptom undersøgelser. Eneste kendte, beskrives, og kan påvises specifikke mål ved hjælp af platformen, så det er ikke egnet til opdagelsen af nye molekylære arter. Andre metoder, såsom RNASeq eller andre traditionelle microarray metoder, er mere egnet til hele transkriptom forundersøgelser.
Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder
IBS er kendetegnet ved en kombination af symptomer, prinmært herunder mavesmerter; visceral hypersensitivitet; og ændringer i afføringsvaner, såsom hyppig diarré, forstoppelse, eller en kombination af begge 9,10. IBS symptomer har ingen kendt organisk årsag, og patienterne ikke udgør med klinisk signifikant inflammation, histopatologiske forstyrrelser af mave-tarm væv eller systemiske markører 9-12. Forskning tyder på, at den biologiske dysregulering i IBS er subtile, subklinisk, og heterogene, med fælles temaer opstå omkring betændelse og immunforsvar 10. Derfor havde vi brug for at styre eksperimentator-introduceret variation og bruge en platform, der var i stand til pålideligt at detektere subtile forstyrrelser i genekspression. De unikke egenskaber af assayet og systemet standardisere prøvebehandling og reducere eksperimentatoren håndtering gennem automatisering, hvilket reducerer teknisk varians til at producere meget reproducerbare data. Disse funktioner giver mulighed for fokuserede undersøgelser og producere meget præcis og replicable data. Dette muliggør detektion af subtile perturbationer og perturbationer blandt lav-ekspressionsvektorer mål, kan blive overset eller oversvømmet af signalerne fra mere rigelige mål ved brug intensity- eller amplifikation-baserede metoder. PCR-baserede microarrays og RNAseq metoder er brugbare alternativer til anvendelse af den beskrevne platform og kan være attraktiv som alternativ, når større gennemløb er påkrævet, eller når formålet er at karakterisere hele transkriptom eller at lede efter nye molekyler. Dog kan alternativer ikke så godt i præcist og nænsomt detektering og kvantificering sjældne mål og subtile forstyrrelser.
Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering denne teknik
Cirkulerende miRNA udtryk i IBS deltagerne viste en række forstyrrelser, der blev fundet at være både væsentlig og konsekvent under kategori. De identificerede miRNA var forbundet med relevante pathways og patologiske tilstande, herunder en funktionel smertetilstand (miR-342-3p: kronisk blære smerter) 8 og inflammation (miR-150) 13. Eksemplet Undersøgelsen var baseret på en sonderende kohorte bruges til at definere mål og systemer af interesse. En mere målrettet, mindre miRNA vifte blev derefter konstrueret, sænke per prøve omkostninger og giver mulighed for meget større kohorter, der skal analyseres i en omkostningseffektiv måde for at validere og forfine underskrifter og biomarkører. Den genekspression platform analysesystem en balance mellem det traditionelle sonderende karakter af microarray og mere målrettet, hypotese-drevet dataindsamling at forfine og afprøve molekylære signaturer og biomarkører 14-16. Fremgangsmåden vil blive anvendt til at undersøge molekylære og protein perturbationer i in vivo og in vitro modeller, hvor de beskrevne target miRNA er eksperimentelt overudtrykt eller inhiberes. Nye assays mulighed for samtidig kvantificering af mRNA'er og proteins direkte fra celler og væv lysater. Desuden vil ved at optimere rensningen af specifikke fraktioner af perifert blod og ekskrementer (fx urin) og ved at tilpasse og optimere visse analyseparametre, molekylære profiler og underskrifter lave molekylære koncentration fraktioner (f.eks exosomal fraktioner) undersøges.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
nSolver | Nanostring | N/A | Essential |