We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
유전자 발현 분석 플랫폼은 단일 반응에서 최대 800 사체 (mRNA의 또는의 miRNAs)의 발현을 강력하고 재현성 정량을 허용한다. miRNA의 분석은 직접 이미징 및 디지털 색으로 구분 형광 바코드 프로브 세트 (기자 프로브 및 포획 프로브)으로 표시되는 miRNA의 분자를 계산하여 성적 증명서를 계산합니다. 바코드는 3 '말단에 고유 올리고 뉴클레오티드 태그 (miRtag)을 결찰에 의해 연장 된 miRNA가 성숙 직접 하이브리드된다. 역전사 및 성적 증명서의 증폭이 필요하지 않습니다. 리포터 프로브는 네 개의 형광 색의 조합을 사용하여 채워 6 색 위치의 시퀀스를 포함한다. 여섯 자리 위에 4 색은 유전자 특이 컬러 바코드 시퀀스를 구성하는데 사용된다. 후 하이브리드 처리 로봇 준비 스테이션에서 자동으로 진행됩니다. 하이브리드, 여분의 프로브는, 멀리 세척하고 노사정 구조 (캡처 프로 후피의 miRNA-리포터 프로브)을 비오틴 표지 된 포획 프로브를 통하여 스트렙 타비 딘 코팅 된 슬라이드에 고정된다. 이미징 및 바코드 계수는 디지털 분석기를 사용하여 수행됩니다. 고정 된 바코드의 miRNAs는 시각과 현미경과 카메라를 사용하여 몇 군데, 그리고 고유 바코드를 디코딩 및 집계된다. 데이터 품질 제어 (QC), 정규화 및 분석은 분석 소프트웨어를 수반 맞춤 디자인 데이터 처리 및 분석 소프트웨어에 의해 촉진된다. 분석 표현의 폭 넓은 범위에서 높은 선형성 및 고 감도를 보여준다. 샘플 및 분석 준비 효소 반응, 역전사, 또는 증폭을 포함하지 않는다; 몇 가지 단계가 있습니다; 크게 탐정 효과를 줄이고 높은 일관성 및 기술 재현성의 결과로, 자동화된다. 여기서, 우리는 과민성 대장 증후군에서 순환 miRNA의 섭동을 식별하는이 기술의 적용을 설명한다.
일반 인구의 15 %와 의료 서비스에 큰 부담을 나타내는 – 과민성 대장 증후군 (IBS)은 10을 괴롭히는, 소화기에서 가장 일반적인 외래 환자의 진단이다. IBS에 대한 현재, 일반적으로이 허용되지 않습니다 진단 바이오 마커 (즉, 진단은 임상 증상에 따라 이러한 위장관 악성 종양, 염증성 장 질환, 위장관 (GI) 감염과 같은 다른 유기 질환을 배제한다). 이러한 IBS, 높은 감도 및 정확도 (재현성) 등 무증상 병리 일반 조건에서의 유전자 발현 양상을 연구 할 때 유전자 발현 프로필의 섭동은 종종 1-3 미묘한로서 필요하다. 의 miRNAs는 IBS 4,5 모두 진단 및 기능 대상으로 확인 된, 우리는 IBS 관련 생물 교란의 -10- 메의 바이오 마커를 순환 등의 사용을 평가에 특히 관심이 있습니다. circula의 임상 활용팅 바이오 마커 인해 용이성과 환자의 바이오 마커 '소스 (예를 들어, 말초 혈액)의 컬렉션의 최소 침습 자연에 현재의 관심이다.
유전자 발현 플랫폼 분석은, 그들의 독특한 화학 및 간소화, 대부분 자동화 된 워크 플로우의 타겟 발견에 대한 사체의 폭 사용자 지정 범위 (하나의 반응 800 목표)를 제공하는 마이크로 어레이 플랫폼을 제공합니다. 또한 transcriptomic 대상의 정량화에 발현의 광범위에 걸쳐 고정밀 선형성을 얻었다. 상기 분석은 RNA의 역전사 cDNA를, 또는 다른 효소 반응 결과의 증폭을 필요로하지 않는다. 따라서, 낮은 풍부 또는 희귀 스플 라이스 변종 RNA 종으로부터 증폭 높은 사이클 번호에 의해 도입 된 전위의 디지털 오차 계산의 방법에 의해 감소된다. 이는 정제 총량 샘플 타입의 다양한 수단(즉, mRNA의 miRNA의 +) RNA는 RNA은 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 시편뿐만 아니라 조 조직 및 세포 용 해물에서의 분석에 이용 될 수있다.
관심 RNA를 각각 타겟 RNA에 상응하는 영역을 인식 표적 특이 서열을 포함하는 프로브 (캡처 및 리포터 프로브)의 쌍을 이용하여 검출된다. 짧은 RNA를 (즉,의 miRNAs)의 검출을 보장하기 위하여, 성숙 된 miRNA 서열은 분자의 3 '말단에 독특한 뉴클레오티드 태그 (miRtag)를 어닐링함으로써 연장된다. 성숙한 타겟의 miRNA와 miRNA에 특이 miRtag 모두의 일부분에 상보 가교 올리고 뉴클레오티드, 서열 특이성을 확인하기 위해 사용된다. 캡쳐 리포터 프로브는 각각의 miRNA-성숙한 miRtag 착체 끝 3 '및 5'에 결찰. 포획 프로브들을 스트렙 타비 딘 – 코팅 슬라이드 글라스의 표면에 부착 할 수 있도록, 3 '말단에 바이오틴 라벨을 갖고, fixi슬라이드에 캡처 프로브의 miRNA-miRtag-기자 프로브 복잡한 ng를. 전류는 5 '말단에 기자 프로브에 의해지지 형광 바코드 현미경 및 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 이용하여 가시화 될 수 있도록 슬라이드 표면에 복잡한 방향을 위해 사용된다. 바코드는 특정 대상의 miRNAs의 수를 산출, 계산 및 디코딩된다. 형광 바코드 위에 4000 컬러 바코드의 조합, 특정 RNA 각 부호화를 구축하는데 사용될 수있는 네 개의 형광 색 중 하나에 의해 점유 될 수있는 6 위치, 구성된다.
샘플 제제 (즉, RNA 정제 또는 세포 / 조직 파쇄 조제)뿐만 아니라 리포터 캡쳐 프로브의 혼성화는 벤치에서 수행된다. 십이 시험편 단일 슬라이드에 다중화 될 수있다. 밤새 혼성화 한 후, 상기 모든 시료 제제 로봇 준비 스테이션에 의해 수행된다. 로드 된 슬라이드는 다음 광고로 전송됩니다이미징 계수, 복호 및 데이터 처리 igital 분석기. 얻어진 데이터는 이들이 상기 사용자 제어의 고도 처리 첨부 소프트웨어에 반입된다. 독특한 화학, 간단한 제조 자동화 사이트, 단순한 데이터 유형 (카운트)이고, 분석의 전체 유선형 흐름은 고정밀 유전자 발현의 정량을 용이 같은 기능적 상태에서 순환의 miRNA 발현 양상 및 서명 공부에서에게 유용한 도구를 만들기 IBS.
프로토콜 내에서 중요한 단계
특히 miRNA의 분석을 위해, 시약 용 해물에 사용하기 위해 최적화되지 않은 같은 (이들의 mRNA 및 단백질 분석에 사용될 수있다) 정제 된 용 해물을 사용하지 않는 것이 중요하고, 시료 전처리 반응을 억제 할 것으로 보인다. 또한, 오염 물질은 결찰 샘플 정제 반응을 억제 할 수있다 (예를 들면, 구 아니 디늄 화합물, 에탄올, 페놀)의 용해 및 RNA 정제 단계 이월. 좋은 품질의 RNA는 miRNA의 분석의 감도와 정확도에 따라서 중요합니다.
가열 뚜껑 열 순환기를 사용하면 모든 반응 단계의 성능을 최적화하기 위해 적절한 온도 조절을 위해 중요하다. 3.5.1 단계 동안, 상기 리가 아제를 첨가하는 동안 온도를 유지하기 위해 열 순환기에서 스트립을 제거하지 않는 것이 중요하다. 스트립을 제거하면 리가 아제를 추가하려면반응을 손상됩니다. 하이브리드 화 단계를 수행 할 때, 튜브의 시약을 혼합하는 경우가 리포터 프로브 전단 있으므로, 격렬히 진탕 피펫 또는 긋기을 방지하는 것이 중요하다. 최적의 성능과 일관성을 보장하기 위해서는 철저하게 부드러운 긋기에 의해 튜브의 시약을 혼합하는 것이 중요하다. 항상 혼합 한 후 반응을 스핀 다운, 새로운 펫이 시약은 정확한 피펫을 보장하고 실수로 교차 오염을 방지하기 위해 분배 될 때마다 팁을 사용합니다.
수정 및 문제 해결
코드 세트는 관심의 대상을 포함하도록 사용자 정의 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 비용은 추가로 조사 또는 생체 서명을 검증 할 때 큰 샘플 세트의 테스트를 균형있게 할 수있다. 사용자 정의 프로브는 일품 요리 메뉴에서 사용할 수있는 유전자 또는 대상 있지을 위해 설계 될 수있다. 덜 풍부 대상 또는 저농도 RNA 감도가 될 수및 / 또는 고해상도 디지털 계수를 이용하여보다 긴 시간 혼성화시킴으로써 조작.
우리의 연구에서 우리는 전체 혈액에서 총 RNA와 미리 정의 된 800 대상 miRNA의 패널을 사용; 그러나, 분석은 더 타겟 접근 방식이 필요한 경우 적은 수의 miRNAs을 포함하도록 사용자 정의 할 수 있습니다. 두 개의 카트리지 편안 로봇 준비 스테이션 후 혼성화 처리 통과 다음날 디지털 분석기에 묘화 될 수 있기 때문에 24 샘플의 총 12 두 세트에 엇갈리게 한 날을 제조 할 수있다. (12)의 배치에서의 샘플의 시차를 처리 혼성화 시간을 표준화하는 것이 중요하다. 이미지화 된 카트리지 저장 및 데이터 분석은 높은 해상도 스캔 희소의 miRNAs의 검출을 향상시킬 수 있음을 시사하는 경우 다시 스캔 4 ℃로 저장 될 수있다. 희소 분자의 검출은 또한 이상 샘플을 혼성화함으로써 개선 될 수있다; 그러나, 연장 하이브리드 있습니다 END_STRONG_1 수 있습니다과포화에서 t과 시작 RNA 농도는 (세포 외 소포 유래 RNA에서와 같이) 낮은 경우에만 결과를 향상시킬 수 있습니다. 플랫폼의 감도와 정밀도가 상대적으로 미량의 miRNAs 안정적으로 계산 할 수 있습니다.
기술의 한계
상술 한 유전자 발현 분석 플랫폼은 단지 어레이 당 800 대상을 수용. 그것은 따라서 전체의 miRNA-전 사체 / 전체 사체 연구에 적합하지 않습니다. 단지 공지 된 바와 지정된 타겟 플랫폼을 이용하여 검출 할 수 있으므로, 새로운 분자 종의 발견에 적합하지 않다. 이러한 RNASeq 또는 다른 기존의 마이크로 어레이 방법 등의 다른 방법으로는, 전 사체 탐색 연구에 더 적합하다.
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
IBS 증상의 요구에 맞는 우수한 서비스를 제공, 인쇄용cipally 복통 등; 내장 과민 반응; 이러한 빈번한 설사, 변비 또는 둘 9,10-의 조합으로서 대장 습관의 변화. IBS의 증상은 알려진 유기 원인이없고, 환자는 임상 적으로 유의 한 염증, 위장 조직, 또는 전신 마커 9-12의 조직 병리학 적 섭동에 존재하지 않습니다. 연구 IBS의 생물학적 조절 곤란이 공통 테마 염증과 면역 기능 (10)의 주위에 신흥로, 미묘한 무증상, 이기종 있음을 시사한다. 따라서 실험 도입 된 변형을 제어하고 안정적으로 유전자 발현의 미묘한 섭동을 검출 할 수 있었던 플랫폼을 사용할 필요가 있었다. 분석 시스템의 독특한 특성은 시료 처리를 표준화 및 재현성 높은 데이터를 생성하는 기술의 분산을 감소 자동화를 통해 처리 실험을 감소시킨다. 이러한 기능은 집중 조사를 허용하고 매우 정확하고 연구 생산eplicable 데이터. 세기 – 또는 증폭 – 기반 방법을 사용할 때 더 풍부 대상의 신호에 의해 간과하거나 압도 될 수 저 발현 타겟 간의 미묘한 섭동 및 교란의 검출을 허용한다. PCR 기반의 마이크로 어레이 및 RNAseq 방법은 기술 플랫폼을 사용하여 실행 가능한 대안과 높은 처리량이 요구 될 때 또는 다른 매력이 될 수있는 목표는 전체 사체의 특성을하거나 새로운 분자를 찾을 때. 그러나 대안이 정확하고 민감하게 감지하고 희귀 한 목표와 미묘한 동요를 정량으로도 수행 할 수 있습니다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
IBS 참가자 순환 miRNA의 발현은 유의과 범주 내에서 일관 둘 것으로 나타났다 섭동들을 보였다. 식별의 miRNAs는 관련 pathwa과 관련이YS와 기능 통증 조건 (은 miR-342-3p : 만성 방광 통증)을 포함한 병리학 적 조건, 8, 염증 (은 miR-150) 13. 예제 연구 목표와 관심의 시스템을 정의하는 데 사용되는 탐색 적 코호트 기반으로했다. 보다 구체적으로 타겟팅 miRNA의 작은 어레이는 샘플 당 비용 절감과 검증하고 서명과 바이오 마커를 수정하기 위해 비용 효율적인 방법으로 분석 할 더 큰 집단을 허용 제조 하였다. 유전자 발현 플랫폼 분석 시스템은 마이크로 어레이의 전통 탐구 자연과 수정 및 분자 서명 및 바이오 마커 14-16을 테스트하기 위해 더 많은 대상, 가설 기반 데이터 수집 사이의 균형을 친다. 이 방법은 상술 한 타겟 miRNAs의 발현을 통해 또는 억제 실험적 어디에 생체 내 및 시험 관내 모델에서 분자와 단백질 섭동을 검사하는 데 사용된다. 새로운 분석은의 mRNA 및 P의 동시 정량 허용직접 세포 및 조직 해물에서 roteins. 또한, 말초 혈액과 배설물 (예컨대, 소변)의 특정 분획의 정제를 최적화 및 사용자 특정 분석 파라미터 분자 프로파일 및 저분자 농축 분획 (예 exosomal 분획)의 서명을 최적화함으로써 조사한다.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
nSolver | Nanostring | N/A | Essential |