We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Genuttryck plattform analysen möjliggör robust och mycket reproducerbar kvantifiering av uttrycket av upp till 800-transkript (mRNA eller miRNA) i en enda reaktion. Mirna analysen räknar transkriptioner genom direkt avbildning och digitalt räkna miRNA molekyler som är märkta med färgkodade fluorescerande streckkod probuppsättningar (en reporter sond och en infångningsprob). Streckkoder hybridiseras direkt till mogna miRNA som har långsträckta genom ligering av ett unikt oligonukleotidmarkör (miRtag) till 3'-änden. Omvänd transkription och amplifiering av transkripten är inte nödvändiga. Reportersonder innehålla en sekvens av sex färger positioner befolkade med användning av en kombination av fyra fluorescerande färger. De fyra färgerna över sex positioner används för att konstruera en gen-specifik färg streckkod sekvens. Post-hybridisering bearbetning är automatiserat på en robot prep station. Efter hybridisering överskjutande prober tvättas bort, och de trepartsstrukturer (infångnings provara-miRNA-reportersond) är fästa vid en streptavidin-belagd slid via biotinmärkt infångningsprob. Imaging och streckkod räkning sker med hjälp av en digital analysator. De immobiliserade streckkod miRNA visualiseras och avbildas med ett mikroskop och kamera, och de unika streckkoder avkodas och räknas. Data kvalitetskontroll (QC), normalisering och analys underlättas av en bearbetning och analys skräddarsydda uppgifter programvara som medföljer analysprogramvara. Analysen demonstrerar hög linjäritet över ett brett område av uttryck, samt hög känslighet. Prov och analys förberedelse inte innebär enzymatiska reaktioner, omvänd transkription, eller förstärkning; har några steg; och är till stor del automatiserad, vilket minskar utredare effekter och resulterar i hög koncentration och teknisk reproducerbarhet. Här beskriver vi tillämpningen av denna teknik för att identifiera cirkulerande miRNA störningar i colon irritabile.
Irritable Bowel Syndrome (IBS) är den vanligaste poli diagnos i Gastroenterology, drabbar 10-15% av befolkningen i allmänhet och representerar en betydande börda för hälso- och sjukvården. För närvarande finns det ingen allmänt accepterad diagnostiska biomarkörer för IBS (dvs. är diagnosen baserad på kliniska symptom och utesluta andra organiska sjukdomar, såsom GI malignitet, inflammatoriska tarmsjukdomar, och gastrointestinala (GI) infektioner). När man studerar genuttryck profiler i gemensamma villkor med subklinisk histopatologi, såsom IBS, hög känslighet och precision (reproducerbarhet) behövs, eftersom störningar i genuttryck profiler är ofta subtila 1-3. miRNA har identifierats som både diagnostiska och funktionella mål i IBS 4,5, och vi är särskilt intresserade av att bedöma deras användning som cirkulerande biomarkörer för IBS-associerade biologiska störningar 3,4,6,7. Den kliniska användningen av cirkulationsting biomarkörer är aktuellt på grund av den lätthet och minimalinvasiv karaktär insamlingen av biomarkörer "källa (t.ex. perifert blod) från patienter.
Genuttryck plattform analyser på grund av deras unika kemi och strömlinjeformad, mestadels automatiserat arbetsflöde ger en microarray plattform som ger brett och anpassnings täckning (800 mål i en enda reaktion) av transkriptom för målinriktad upptäckt. De ger också hög precision och linjäritet över ett brett spektrum av expressionsnivåer vid kvantifieringen av transcriptomic mål. Analysen kräver inte den omvända transkriptionen av RNA, amplifieringen av resulterande cDNA, eller andra enzymatiska reaktioner. Sålunda är potentiella fel som införs genom de höga cykelantal av amplifiering från RNA-species med låg förekomst eller sällsynta splitsvarianter minskas genom förfarandet av digital räkning. Detta innebär att ett stort antal olika provtyper, såsom renat totaltRNA (dvs mRNA + miRNA), RNA från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) prover, såväl som rå vävnad och cell-lysat, kan användas med analyserna.
RNA av intresse detekteras med användning av ett par av prober (infångning och reportersonder), var och en innehållande en målspecifik sekvens som känner igen en motsvarande region på mål-RNA. För att säkerställa detektering av korta RNA (dvs., miRNA), är den mogna miRNA sekvensen långsträckt genom glödgning en unik oligonukleotidmarkör (miRtag) till 3'-änden av molekylen. En överbryggande oligonukleotid, som är komplementär till en del av både den mogna mål miRNA och miRNA-specifika miRtag, används för att säkerställa sekvensspecificitet. Avskiljning och reportersonder ligera till 3'- och 5'-ändarna av den mogna miRNA-miRtag komplex, respektive. Infångningsproberna har en biotinmärkning vid 3'-änden, som tillåter dem att fästa på ytan av en streptavidinbelagd glasskiva, Fixing infångningsproben-miRNA-miRtag-reporter sond komplexet till bilden. En elektrisk ström används sedan för att orientera den komplexa på glidytan, vilket tillåter fluorescerande streckkoder som bärs av reportern sond på 5'-änden som skall visualiseras med ett mikroskop och laddningskopplad anordning (CCD) kamera. Streckkoder räknas och avkodas, vilket gav en räkning av de specifika mål miRNA. Den fluorescerande streckkod består av sex positioner som kan upptas av en av fyra fluorescerande färger, som kan användas för att konstruera över 4000 färg streckkod kombinationer, varje kodar för en specifik RNA.
Provberedning (dvs RNA rening eller cell / vävnads lysat preparat), liksom hybridisering av infångnings och reportersonder, görs på bänken. Tolv prover kan multiplexeras på en enda bild. Efter hybridisering över natt, all ytterligare provberedning som utförs av en robot prep station. De laddade diabilder överförs sedan till annonsdigital analysator för avbildning, räkning, avkodning, och databehandling. De resulterande data som importeras till den bifogade programvaran, där de bearbetas ytterligare med en hög grad av användarkontroll. Den unika kemi, enkel beredning, automatiserad natur, enkel datatyp (räknas) och övergripande effektivt arbetsflöde för analysen underlättar hög precision genuttryck kvantifiering, vilket gör det till ett användbart verktyg för att studera cirkulerande miRNA uttryck profiler och underskrifter i funktionella förhållanden såsom IBS.
Kritiska steg i protokollet
För miRNA analys i synnerhet är det viktigt att inte använda orenade lysat (dessa kan användas i mRNA och proteinanalyser), eftersom reagenserna inte har optimerats för användning med lysat, och provberedning reaktioner kan komma att hämmas. Dessutom kontaminanter som överförts från lysering och RNA-reningssteg (t.ex. guanidiniumsalter föreningar, etanol, och fenoler) kan hämma ligerings- och provreningsreaktioner. God kvalitet RNA är därför avgörande för känsligheten och noggrannheten hos miRNA analysen.
Med hjälp av en termo med en uppvärmd lock är avgörande för att säkerställa en korrekt temperaturkontroll för att optimera prestanda för alla reaktionssteg. Under steg 3.5.1, är det viktigt att inte ta bort remsorna från termo för att hålla temperaturen under tillsatsen av ligas. Ta bort remsorna att lägga ligaskommer att kompromissa reaktionen. När du utför hybridiserings steg, är det viktigt att undvika kraftig skakning, pipettering, eller snärta vid blandning reagens i rören, eftersom detta kan klippa reportersonder. För att säkerställa optimal prestanda och konsekvens, är det viktigt att blanda reagens i rören genom försiktig rulla. snurra alltid ner reaktioner efter blandning, och använda en ny pipettspets varje gång ett reagens dispens att säkerställa korrekt pipettering och för att undvika oavsiktlig korskontaminering.
Ändringar och felsökning
De koduppsättningar kan anpassas till att omfatta endast mål av intresse. På detta sätt kan kostnaderna balanseras för att möjliggöra testning av stora provmängder när ytterligare utredning eller validering av en bio-signatur. Anpassade prober kan utformas för gener eller mål inte är tillgängliga från à la carte-meny. Känslighet för mindre rikliga mål eller låg koncentration RNA kan varamanipuleras genom att tillåta en längre hybridisering tid och / eller genom att använda högre upplösning digital räkning.
I vår studie har vi använt den fördefinierade 800 mål miRNA panel med total RNA från helblod; dock kan analyserna anpassas till att omfatta färre miRNAs om det behövs en mer målinriktad strategi. Sammanlagt 24 prover kan framställas på en enda dag, förskjutna i två uppsättningar av 12, eftersom två patroner kan bekvämt föras genom efter hybridisering bearbetning på robot prep stationen och avbildas på den digitala analysatorn nästa dag. Staggered bearbetning av proverna i satser av 12 är viktigt att standardisera hybridisering tiden. Patroner som har avbildade kan sparas och lagras vid 4 ° C till skannas in på nytt om dataanalyser tyder på att en högre skanningsupplösning kan förbättra upptäckten av sällsynta miRNA. Detektion av sällsynta molekyler kan också förbättras genom hybridisering prover för längre; kan dock långvarig hybridisering Result i övermättnad och kan bara förbättra resultat om start RNA koncentrationerna är låga (som i extracellulärt blås härledda RNA). Plattformen känslighet och precision tillåter relativt låg överflöd miRNA tillförlitligt räknas.
Begränsningar av tekniken
Den beskrivna genuttryck analysplattform rymmer endast upp till 800 mål per matris. Det är därför inte lämpade för hela miRNA-transkriptom / hela transkriptom studier. Endast kända, beskrivna och angivna mål kan detekteras med hjälp av plattformen, så det är inte lämpade för upptäckten av nya molekylära arter. Andra metoder, såsom RNASeq eller andra traditionella microarray metoder, är mer lämpade för hela transkriptom förberedande studier.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
IBS karaktäriseras av en kombination av symptom, principally inklusive buksmärtor, visceral överkänslighet; och förändringar i tarmvanor, såsom ofta diarré, förstoppning, eller en kombination av båda 9,10. IBS symtom har ingen känd organisk orsak, och patienter inte uppvisa kliniskt signifikant inflammation, histopatologiska störningar av gastrointestinala vävnader eller system markörer 9-12. Forskning tyder på att den biologiska dysreglering i IBS är subtil, subklinisk och heterogen, med gemensamma teman framväxande runt inflammation och immunförsvar 10. Därför behövde vi för att kontrollera försöks introducerade variation och använder en plattform som kunde tillförlitligt detektera subtila störningar i genuttryck. De unika egenskaperna hos analysen och systemet standardisera urval bearbetning och minska försökshantering genom automatisering, minska tekniska varians att producera mycket reproducerbara data. Dessa funktioner gör det möjligt för fokuserade undersökningar och producerar mycket exakt och replicable data. Detta gör det möjligt för detektion av subtila störningar och störningar bland låg-expressions mål som kan förbises eller översvämmas av signalerna i rikligare mål när man använder intensity- eller amplifierings-baserade metoder. PCR-baserade microarrays och RNAseq metoder är livskraftiga alternativ till användning av den beskrivna plattformen och kan vara attraktiva som alternativ när högre genomströmningar som krävs eller när syftet är att karakterisera hela transkriptom eller att leta efter nya molekyler. Emellertid kan alternativen inte fungerar lika bra i noggrant och känsligt att detektera och kvantifiera sällsynta mål och subtila störningar.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter Mastering denna teknik
Cirkulerande miRNA uttryck i IBS deltagarna visade ett antal störningar som konstaterades vara både betydande och konsekvent inom kategorierna. De identifierade miRNAs var förknippade med relevant pathways och patologiska tillstånd, inklusive en funktionell smärttillstånd (MIR-342-3p: kronisk smärta i urinblåsan) 8 och inflammation (MIR-150) 13. Exemplet Studien bygger på en förberedande kohort används för att definiera mål och system av intresse. Ett mer målinriktat, mindre miRNA array konstruerades sedan, sänka per prov kostnaden och möjliggör mycket större kohorter som skall analyseras i ett kostnadseffektivt sätt för att validera och förfina signaturer och biomarkörer. Genuttryck plattform analyssystem skapar en balans mellan det traditionella förberedande karaktär microarray och mer riktade, hypotesdriven datainsamling att förfina och testa molekylära signaturer och biomarkörer 14-16. Den metod som ska användas för att undersöka molekylära och protein störningar i in vivo och in vitro-modeller där de beskrivna mål miRNA är experimentellt överuttrycks eller hämmas. Nya analyser tillåter samtidig kvantifiering av mRNA och proteins direkt från cell- och vävnads lysat. Genom att optimera reningen av specifika fraktioner av perifert blod och avföring (t.ex. urin) och genom att anpassa och optimera vissa analysparametrarna, molekylära profiler och underskrifter låga fraktioner molekylär koncentration (t.ex. exosomal fraktioner) kommer att undersökas.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
nSolver | Nanostring | N/A | Essential |