Summary
这里我们描述了一种新方法，以产生抗原特异性T细胞受体（TCR）通过配对现有的TCR的TCRα或TCRβ，具有感兴趣的抗原特异性，与外周T细胞受体库的补充hemichain。 从头产生的TCR保留抗原特异性有不同的亲和力。
Abstract
T细胞受体（TCR）在临床上用于指导T细胞的特异性靶向肿瘤免疫疗法的一个有前途的方式。因此，具体的关于各种肿瘤相关抗原的克隆的TCR一直是许多研究的目标。以引发有效的T细胞应答，T细胞受体必须认识到与最佳亲和力的靶抗原。然而，这种克隆的TCR一直是一个挑战，许多可用的TCR具有对同源抗原次优的亲和力。在这个协议中，我们描述了克隆使用现有的TCR通过利用hemichain为中心从头高亲和力的抗原特异性的TCR的方法。众所周知，对于某些的TCR，每个TCRα或TCRβhemichain不相等，以抗原识别贡献，显性hemichain被作为中心hemichain提及。我们已经表明，通过配对与反链从原来的反链不同的中心hemichain，我们能够保持抗原小号pecificity，而调节其作用强度为同源抗原。因此，一个给定的TCR的治疗潜力可通过优化中心和计数器hemichains之间的配对的提高。
Introduction
T细胞受体（TCR）是由T淋巴细胞表达异二聚体适应性免疫受体，一个TCRα和TCRβ链组成。它们通过V（D）J基因片段，其产生能识别的HLA /肽复合物的几乎无限的构型的高度多样化剧目体重排产生的。在临床上，改造为表达克隆型的TCR特异性的肿瘤相关抗原的T细胞在多种癌症1已经证明效力。但是，克隆用于此目的的许多的TCR缺乏感兴趣的抗原，这限制了它们的治疗应用足够的亲和力。
在这里，我们描述了通过利用链为中心克服这种限制对于现有的TCR的方法。已经报道，一个TCR hemichain可以发挥识别靶抗原2的更主要的作用，这里称为为中心。晶体结构分析表明，一个中心一个TCR的hemichain可能占大多数的MHC /肽复合物3,4的足迹。使用这一概念，我们先前已经证明了SIG35αTCRα可以与TCRβ链的多样剧目配对，并保持反应性对抗由HLA-A2 5提出的MART1 27-35肽。类似的结果与TAK1 TCR，其中该中心TCRβhemichain配对与各种TCRα链和维持反应对由HLA-A24 6提出的WT1 235-243肽得到。既MART1和WT1是肿瘤相关抗原。链为中心也被用于研究CD1d的限制不变的自然杀伤（的iNKT）的TCR的抗原识别，通过配对不同Vβ11TCRβ链7人的iNKT的TCR的不变Vα24-Jα18（Vα24i）TCRα链。
在任何情况下，我们能够通过跨产生的TCR的从头剧目ducing的中心的TCR hemichain到外周血T细胞，其中该引入hemichain与内源TCRα或TCRβ计数器链配对。在本质上，中心hemichain作为可用于确定适当的反链，其一起使用时形成保持目的抗原的特异性的TCR，但在亲和力改变一个诱饵。从这些新的全集，我们能够克隆型的TCR与抗相比预先存在的TCR对靶抗原改进相互作用强度隔离。因此，我们认为这种方法将加快确定最佳的TCR为临床应用的管道。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.准备逆转录病毒构建利益编码TCR Hemichain
- 线性PMX矢量，以允许在随后的步骤的TCR基因的插入。消化用EcoRI和NotI限制性内切酶的质粒DNA在37℃下3小时（ 表1）8。
- 开展1.2％琼脂糖凝胶的消化的质粒的电泳。的约4500个碱基对（BPS）消费税乐队，稀释成30微升无菌水使用市售凝胶提取试剂盒9。
- 设计5'和3'引物对感兴趣的TCR基因也编码15-20 bps的重叠PMX矢量，分别为8的EcoRI和NotI消化位点。
- 扩增TCR基因引物。如步骤1.2中所述进行的约1,000个基点的PCR产物和洗脱带电泳。
- 克隆的TCR基因导入消化的载体由每个线性片段与可商购的质粒组合装配主混合试剂，并在50℃温育1小时。
注：参见制造商的协议对于每个组件的相对体积。这种装配方法是基于最初由Gibson等 10中所述的技术。 - （可选的）标记的TCR基因标为转导的细胞与人神经生长因子受体的截短形式（ΔNGFR，氨基酸1-277）11由弗林蛋白酶切割位点，丝氨酸-甘氨酸接头分开，和图2A序列12,13。设计引物编码序列重叠片段末端，并按照步骤1.3-1.5描述组装质粒。
注意：这些序列可参考11-13找到。 - 变换化学感受态大肠杆菌具有下列制造商的协议14组装质粒。在琼脂平板上的种子转化的细菌（20毫克/毫升LB培养基（LB），15毫克/毫升琼脂和1微克/毫升氨苄青霉素），在37°C孵育18小时。 培养单个菌落在50毫升LB培养基（20毫克/毫升的LB和1微克/毫升氨苄青霉素），用于在振荡培养箱16小时，在37℃和200转每分钟。
- 净化用以下制造商的协议市售中提试剂盒的质粒。质粒稀释到大约1微克/μL的浓度。
注：质粒纯化协议基于碱性提取方法15。
2.生成稳定的包装细胞系
注：两个293GPG和PG13细胞贴壁。在Dulbecco氏改良Eagle培养基（DMEM）中培养的细胞在补充有10％胎牛血清（FCS）和50μg/ ml庆大霉素。培养293GPG细胞转染前1微克/毫升四环素。孵育细胞在37℃，5％的CO 2的所有步骤之间。
- 转染293GPG包装细胞中，在步骤1.9，USI得到的hemichain编码矢量的T75烧瓶16培养纳克市售的转染试剂依照制造商的方案1 7。注：转染细胞293GPG在50-60％汇合。
- 对于293GPG细胞吸中，加入10毫升新鲜DMEM培养基后1天转染。
- 嘉实步2.2转增培养基注射器，并通过0.45微米的过滤器后第2天瞬时产生病毒转染的细胞293GPG。
注：病毒可以立即使用或储存于-80℃以备将来使用。 - 培养1×10 5个 PG13细胞的T25烧瓶中。算使用血球细胞。一天后，吸培养基，并添加1.5 293GPG源性病毒的溶液从步骤2.3和1.5毫升DMEM培养基中，以8微克/毫升聚凝胺的沿。
- 4天每天一次在步骤2.4所描述的改变介质，以建立编码目的TCR hemichain稳定PG13包装细胞系制备逆转录病毒。
- 吸媒体和替换为PG13细胞系进行进一步培养上一次感染后24小时的新鲜DMEM培养基。
注：冻结或子培养细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液脱离。 - 至如在步骤2.33天接种细胞后描述产生从转导PG13细胞系的病毒，培养2×10 6个细胞在T75用10ml DMEM培养基烧瓶中，收获病毒。
注：病毒立即最好使用，但可存储在-80℃达两个月。
3.激活和人类T细胞的转导
注意：人的样品，获得并根据机构伦理委员会批准的方案使用。罗斯韦尔园区纪念研究所培养原代人细胞补充有10％人血清，而不是FCS和50μg/ ml庆大霉素（RPMI）培养基。孵育细胞在37℃，5％的CO 2的所有步骤之间。
- 分离人外周血单核细胞（PBMC）通过密度依照制造商的协议18梯度分离。
- 活化T细胞以诱导对逆转录病毒感染所需的增殖。每孔培养2×10 7个新鲜或解冻的PBMC在6孔板，在5毫升与100IU / ml重组人白介素-2（的rhIL-2）和50ng / ml的抗CD3单克隆抗体的RPMI培养基中的（克隆OKT3）。
- 三天后的刺激，在350 XG吹打，离心收集T细胞4分钟。弃上清和种子每孔0.5-1×10 6个 T细胞再悬浮于1ml PG13病毒从步骤2.7 24孔板，1补充有200单位/毫升的rhIL-2的RPMI培养基中。在1000 xg离心离心机板和32℃下1小时。
- 24小时后，收集T细胞吹打，离心350 XG 4分钟。丢弃上清，重悬细胞于1ml PG13病毒从步骤2.7和1补充有200单位/毫升的rhIL-2的RPMI培养基中。重复此步骤，总共6侵染的离子。
注：感染数量应根据由包装细胞系产生的病毒的滴度进行优化。如果需要的话，通路T细胞每天除去细胞的20-30％，以防止过度生长。 - 最后在感染后24小时，收集T细胞吹打，离心350 XG 4分钟。丢弃与100IU / ml的重组人IL-2的用于进一步培养RPMI培养基上清，重悬细胞。
- 步骤3.5，染色的T细胞在4℃，15分钟，4℃，30分钟，然后加入抗人CD3的HLA多聚和共受体的单克隆抗体（mAb）后2-3天。通过流式细胞仪分析。使用多聚体无关和/或细胞未转染为阴性对照（ 见图1 - 3）19。
- 如果所引入的中心hemichain是TCRα链，使用市售的Vβ特异性抗体面板通过流式细胞仪20分析的从头多聚阳性细胞的Vβ的使用。
4.克隆德诺 TCR反hemichains
- 排序从头多聚积极步骤3.6流辅助细胞分选的人口。
- 从使用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方法21,2 2排序的T细胞分离RNA。
注：RNA可被储存在-80℃，但应使用尽快生成的cDNA。 - 使用以下制造商的协议23,24市售逆转录酶-PCR试剂盒从提取的RNA合成cDNA文库。
- 如果克隆TCRβ反链，设计Vβ基因和TCRβ恒定区特异性的引物，如在步骤3.7确定的，并克隆全长TCRβ步骤1.3-1.9中描述的基因作为。请参阅步骤4.5，如果反链TCRα，否则继续执行步骤5.1。
- 市售Vα特异性抗体有限，因而Vα基因的使用不能通过流式细胞仪来确定。通过cDNA末端（RACE）25 5'-快速扩增克隆TCRα反链，使用市售5'RACE包6。
- 合成从在步骤4.2中提取的RNA下列制造商的协议5'RACE兼容的cDNA。
- 如表2所示进行第一轮PCR。
- 进行PCR产物的电泳和洗脱的约1,100个基点带，如在步骤1.2中描述。
- 如表3中所述，使用第一轮PCR产物作为模板进行第二轮PCR。
注：下表3所示的引物序列被设计用于克隆到EcoRI和NotI消化PMX载体。 - 进行PCR产物的电泳和洗脱的大约1000个基点带，如在步骤1.2中描述。
- 克隆TCRα基因插入EcoRI和NotI消化PMX载体和普里FY质粒如步骤1.5-1.9中描述。
5.重建新的抗原特异性TCR克隆
注：培养的Jurkat 76细胞和随后的细胞系在RPMI培养基中补充有10％FCS和50μg/ ml的庆大霉素。孵育细胞在37℃，5％的CO 2的所有步骤之间。
- 转导的Jurkat 76细胞26（或同等学历TCR - / -人类T细胞系）用在步骤2.3生产293GPG病毒中心TCR hemichain。对Jurkat细胞76，种子，每孔5×10 4个细胞在24孔板用1ml病毒和1ml RPMI培养基中。在1000 xg离心离心机板和32℃下1小时。
- 感染后24小时，收集hemichain转导的Jurkat 76细胞吹打，离心350 XG 4分钟。弃上清，重悬在进一步培养新鲜RPMI培养基。
- 净化转导细胞如果hemichain分子是5.2步后2-3天标记，通过染色ING与荧光团共轭抗神经生长因子受体单克隆抗体其次是流动，协助或磁辅助细胞分选（可选）27。
- 以下步骤2.1至2.3，生产293GPG病毒编码TCR反链从步骤4.4或4.5克隆。
- 要完全重建的TCR，转导T细胞系稳定表达使用病毒从步骤5.4步骤5.1-5.3产生的TCR为中心hemichain。按照步骤5.1-5.2描述执行传导。
- 净化使用抗CD3磁辅助细胞分选CD3 +转以下制造商的协议，步5.5 27后2-3天。
- 为了验证抗原特异性，染色表达与各种反链配对的中心的TCR hemichain组成克隆型的TCR，用抗CD3和/或共受体的mAb，和HLA多聚的转染子，3-5天后CD3的纯化。分析通过流式细胞术（ 图4 - 5）细胞19。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
没有先验知识其中hemichain的是链为中心，在TCRα和TCRβ链应分开克隆，并转到外周血T细胞，将其在HLA-A24 / WT1反应TAK1 TCR的（ 图1）的情况下完成的。 TAK1β的转导产生抗原特异性T细胞的显着更高的频率。相反，非中心hemichain转导不会产生从头多聚体阳性T细胞，所看到与TAK1α链（ 图1）。在分析过程中，对NGFR +细胞的大门，如果TCR基因被标记为具体分析转导的细胞（ 图1 - 2）。另一方面，单中心hemichain可以，如果它被称为是占主导地位的被转导，例如SIG35α和不变Vα24TCRα链（ 图2和3）。特异于各自COGN T细胞吃抗原在一个中心TCRαhemichain转导的频率增加。 （ 图2 - 3）。总之，这些数据表明，引入一个中心TCRα或TCRβhemichain的外周血T细胞可以产生与所关注的抗原特异性从头的TCR。
抗原特异性群可通过流动辅助细胞分选进行排序，并作为在协议部分4克隆型T细胞受体的反链可以在稳定表达中心hemichain一个T细胞系单独重构描述TCR hemichains可以克隆。 76 Jurkat细胞转染，表达新克隆的TAK1β或SIG35α中心hemichain导的T细胞的独特的TCR，具备了相应的同源抗原不同的亲和力，如HLA /肽多聚体染色5,6确定。具体来说，我们能够隔离从头 TCRα反链Ť当与TAK1β配对帽与由WT1抗原复合物比亲TAK1αβ配对或较低或较高的强度（ 图4）进行染色。同样，SIG35α搭配独特的反链公认的HLA-A2 / MART1中度至高度的亲和力（ 图5）。 SIG35α克隆独立一个TCRαβ异二聚体5，因此对于这个hemichain亲配对是用于比较的不可用。重要的是，这些数据表明，有可能通过配对与各种反链的中心hemichain调制对靶抗原的亲和力。
图1：TAK1β作为 HLA-A24 / WT1反应TAK1 TCR的HLA限制性TCRβ中心hemichainTCRα或TCRβhemichains 的一个例子是具有标记截断神经生长因子RECEptor（ΔNGFR），并单独转导到末梢血的T细胞。转染子与PC5缀合的抗CD8（133倍稀释）和FITC缀合的抗NGFR（20倍稀释的）的单克隆抗体（mAb）染色，并表示HLA-A24多聚（5微克/毫升），以下抗原特异性两次刺激。 6捐助者共进行了测试。所有的数据进行门控上NGFR +细胞。图重新打印许可参考6。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：SIG35α作为HLA限制性TCRα中心hemichain的一例 SIG35αTCRα链具有标记ΔNGFR，或单独的标签，转导到外周血T细胞。转用PC5共染色njugated抗CD8（133倍稀释）和FITC缀合的抗NGFR（20倍稀释）的mAb，并表示HLA-A2多聚（8微克/毫升）。 4捐助者共进行了测试。所有的数据进行门控上NGFR +细胞。图重新印有从基准5（ 版权2015年免疫学家的美国协会，公司 ）的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：不变的自然杀伤T（的iNKT）细胞受体Vα24（Vα24i）作为CD1d的限制TCRα中心hemichain的例子 Vα24iTCRα链转外周血T细胞。转染用FITC缀合的抗-CD3（20倍稀释）的mAb染色，并指示CD1d的多聚体（5微克/毫升）。卸载CD1d的莫lecules从HEK293细胞内源性存在未知的自我脂质产生。的iNKT TCR由识别CD1d的呈递α-神经酰胺或其类似物的PBS-57中定义。 4捐助者共进行了测试。图重新打印许可参考7。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：从TAK1β克隆代表TCRα计数器链转导的T细胞 TCRα克隆T262，A262，A186，A133，和T4，从HLA-A24 / WT1克隆的多聚体阳性TAK1β转导外周T细胞，对Jurkat 76细胞分别重构。表达CD8，与TAK1β链一起。转染子与PC5共轭的抗CD8单克隆抗体（133倍稀释）染色，并表示HLA-A24多聚体（5微克/毫升）。数据代表两个独立的实验。误差棒表示范围。图重新打印许可参考6。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：从SIG35α克隆代表TCRβ计数器链转导的T细胞 TCRβ克隆413，523，788，1086，794，和830，从HLA-A2 / MART1克隆阳性SIG35α多聚体转导的外周T细胞，并单独重构对Jurkat。 76细胞中表达CD8，与SIG35α链一起。 DMF5是以前克隆的高亲和力的TCR识别HLA-A2 / MART1。转染子与PC5共轭的抗CD8单克隆抗体（133倍稀释）染色，并表示HLA-A2多聚（2微克/立方米1）。数据代表两个独立的实验。误差棒表示范围。图重新印有从基准5（ 版权2015年免疫学家的美国协会，公司 ）的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：。试剂和各卷均会显示安装程序PMX矢量消化 请点击这里查看此表的放大版本。
表2：设置为第一 轮5'RACËPCR检测试剂和各自的体积，PCR设置和引物序列显示， 请点击这里查看此表的放大版本。
表3：设置第二 轮5'RACE PCR试剂和各自的体积，PCR设置和引物序列显示。 请点击此处查看该表的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这种方法的成功应用的第一个要求是实现初级T细胞与感兴趣的hemichain足够的转导效率。根据我们的经验，使用PG13作为包装细胞系和PMX如在人原代T细胞中导入基因的稳定，高效表达逆转录病毒载体的结果的组合。 PG13包装细胞可以是单细胞克隆以选择高滴度包装细胞，以提高转导效率。此外，还需要通过逆转录病毒高转导效率的T细胞的增殖。在所描述的协议中，刺激用可溶性抗CD3单抗OKT3，具有的rhIL-2的高浓度沿，提供了必要的激活信号，以诱导细胞分裂。单核细胞所必需的可溶OKT3的刺激能力，可能通过与Fc受体的结合。因此，散装的PBMC，并没有纯化的T细胞，需要这个特定的刺激方案。 ŧ细胞应培养在RPMI补加人类血清的最佳实验的结果。这里描述的所有其它细胞可以是在胎牛血清存在下培养。
第二，表达细胞从头生成抗原特异性的TCR必须是可检测的。对于某些TCR hemichains，如TAK1β， 从头的TCR表达细胞与抗原冲激的抗原呈递细胞（APC）刺激后仅检测到。因此，如果不为中心hemichain转导后立即检测抗原特异性的TCR，他们可能是由的APCs膨胀后可检测的。注意非中心hemichain的转导甚至后的APC抗原特异性膨胀不会产生从头抗原特异性T细胞，与TAK1αhemichain（ 图1）可见。在我们的研究中，HLA多聚体用于检测的，然而，这可能对某些的TCR，特别是限制性TCR HLA类II可用秒。另一种方法是检测T细胞的功能反应。 Hemichain转导的T细胞能够与感兴趣的抗原脉冲的APC刺激。车辆脉冲的APC和未转导的T细胞可以被用作对照。反应性T细胞可通过的表面活化标记如CD107a，CD154，或CD137上调来检测。
最后，为了验证克隆的反链做实际上识别目的抗原时与中心hemichain配对是重要的。这是特别重要的，当中心hemichain是TCRβ和反向链是TCRα，因为等位基因排斥对TCRα基因是漏水，据估计该外设αβT细胞的显著一部分表达一个以上的TCRα链28。反应可以用多聚体染色或测量与装甲运兵车呈现同源抗原刺激后功能反应得到证实。
一limitati这种技术的是，并非每一个TCR将组成一个中心hemichain，因为这两个TCRα和TCRβ贡献同等抗原识别在某些情况下3。因此，这样的非中心hemichains转导外周T细胞可能不会产生从头抗原特异性的TCR。
尽管如此，这种方法代表经常规方法克隆的TCR，其中两个TCRα和TCRβ基因必须被克隆并正确配对必须确保29,30的概念的进步。在我们的技术中，hemichains之间配对已经不再是一个主要关注的问题，并且只有TCR链的需要被克隆，鉴于其他固定之一。除了HLA I类或CD1d分子-限制性TCR，所描述的方法也可以应用到对TCR基因治疗的HLA II类限制性TCR的分离。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
