Summary
Wir beschreiben hier ein neues Verfahren antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCRs) durch Paarung der TCR & agr; oder TCR & bgr; TCR eines bestehenden, besitzen die Antigen-Spezifität von Interesse, mit komplementären hemichain der peripheren T-Zell-Rezeptor-Repertoire zu erzeugen. Die de novo erzeugt TZR behalten Antigen-Spezifität mit Affinität zu variieren.
Abstract
T-Zell-Rezeptoren (TCR) verwendet klinisch die Spezifität von T-Zellen zu lenken Tumoren als eine viel versprechende Modalität der Immuntherapie zu zielen. Daher ist die Klonierung TCRs spezifisch für verschiedene Tumor-assoziierte Antigene war das Ziel vieler Studien. eine wirksame T-Zell-Antwort hervorzurufen, muss das TCR das Zielantigen mit optimaler Affinität erkennen. Es wurde jedoch Klonierung solche TCRs eine Herausforderung und viele verfügbare TCRs besitzen suboptimalen Affinität für das zugehöriges Antigen. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zum Klonieren von de novo hoher Affinität antigen-spezifischen TCRs vorhandene TCRs durch hemichain centricity ausnutzt. Es ist bekannt, dass für einige TCRs jedes TCR & agr; oder TCR & bgr; hemichain nicht in gleicher Weise für die Antigenerkennung beitragen, und die dominante hemichain als zentrische hemichain bezeichnet. Wir haben, dass von der ursprünglichen Gegenkette unterscheiden durch Paarung der centric hemichain mit Gegen Ketten gezeigt, wir sind in der Lage, das Antigen s zu haltenpecificity, während die Wechselwirkungsstärke für das zugehöriges Antigen zu modulieren. Somit kann das therapeutische Potential einer gegebenen TCR durch Optimierung der Kopplung zwischen den zentrisch und Zähler hemichains verbessert werden.
Introduction
T-Zell-Rezeptoren (TCRs) sind heterodimere adaptive Immunrezeptoren von T-Lymphozyten exprimiert wird, die aus einer TCR & agr; und TCR & bgr; Kette. Sie werden über somatische Umordnung von V (D) J-Gensegmenten erzeugt, die praktisch unbegrenzte Konfigurationen von HLA / Peptid-Komplexe eine sehr vielfältige Repertoires der Lage zu erkennen, erzeugt. Klinisch entwickelt T - Zellen klonotypischen TCRs spezifisch für tumorassoziierte Antigene zu exprimieren zeigten Wirksamkeit bei einer Vielzahl von Krebsarten 1. Allerdings fehlt für das Antigen von Interesse ausreichende Affinität viele TZR für diesen Zweck geklont, die ihre therapeutische Anwendung begrenzen.
Hier beschreiben wir eine Methode, um diese Einschränkung für bestehende TZR zu überwinden, indem Kette Zentriert nutzen. Es wurde berichtet, dass ein TCR hemichain 2 eine dominantere Rolle bei der Erkennung des Zielantigens spielen könnte, hier genannt centricity. Kristallstrukturanalysen haben gezeigt, dass eine zentrierte gezeigthemichain eines TCR könnte für die Mehrheit des Fußabdrucks Konto auf dem MHC / Peptid - Komplex 3,4. Mit diesem Konzept haben wir bereits gezeigt , dass die SIG35α TCR & agr; mit einem vielfältigen Repertoire von TCR & bgr; Ketten paaren und zu pflegen Reaktivität gegen das MART1 27-35 Peptid präsentiert von HLA-A2 5. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem TAK1 TCR erhalten, wobei die zentrische TCR & bgr; hemichain mit verschiedenen TCR & agr; Ketten gekoppelt und gehalten Reaktivität für das WT1 235-243 Peptid durch HLA-A24 präsentiert 6. Sowohl MART1 und WT1 sind tumorassoziierte Antigene. Kettenzentriertheit wurde auch 7 durch Paarung die invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCR & agr; Kette von menschlichem iNKT TZR mit verschiedenen Vβ11 TCR & bgr; Ketten zu studieren Antigenerkennung von CD1d beschränkten invariant natürliche Killerzellen (iNKT) TZR, angewendet.
In allen Fällen konnten wir eine De - novo - Repertoire von TZR durch trans zu erzeugenGabe die zentrierte TCR hemichain zu peripheren T-Zellen Blut, wo die eingeführte hemichain mit dem endogenen TCR & agr; oder TCR & bgr; Gegenketten gepaart. Im Wesentlichen dient die zentrische hemichain als Köder, die verwendet werden können, die entsprechenden Gegen Ketten zu identifizieren, die, wenn sie miteinander gepaart TCRs bilden, die die Antigenspezifität von Interesse aufrechtzuerhalten, noch in Affinitäts variiert. Von diesen neuen Repertoires konnten wir klonotypischen TZR mit verbesserter Wechselwirkungsstärke gegen das Zielantigen zu isolieren, im Vergleich zu bereits bestehenden TZR. Deshalb glauben wir, diese Methode wird die Pipeline zu identifizieren optimale TZR für die klinische Anwendung zu beschleunigen.
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Protocol
1. Vorbereiten Retrovirale Encoding TCR Hemichain of Interest Construct
- Linearisieren pMX Vektor, der das Einführen eines TCR-Gens in anschließenden Schritten zu ermöglichen. Digest die Plasmid - DNA mit EcoRI und NotI - Restriktionsenzymen bei 37 ° C für 3 Stunden (Tabelle 1) 8.
- Führen Sie die Elektrophorese der verdauten Plasmid auf 1,2% Agarose-Gel. Excise Bande von etwa 4500 Basenpaaren (bp) und elute in 30 ul sterilem Wasser mit handelsüblichen -Gelextraktions Kits 9.
- Design 5 'und 3' - Primer für die TCR - Gen von Interesse , die auch 15-20 bps überlappende die EcoRI- und NotI - Verdauungsstelle von pMX Vektor codieren bzw. 8.
- Amplify TCR-Gen mit Primern. Durchführung der Elektrophorese des PCR-Produkts und eluieren Bande von etwa 1.000 bps, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
- Klon TCR-Gens in verdauten Vektor durch jedes lineares Fragment mit im Handel erhältlichen Plasmid-KombinationMontage Mastermix Reagenz und für 1 Stunde bei 50ºC inkubiert wurde.
HINWEIS: Siehe Protokoll des Herstellers für relativen Volumina der einzelnen Komponenten. Dieses Montageverfahren wird auf der Technik basieren ursprünglich beschrieben von Gibson et al. 10. - (Optional) Tag TCR - Gens mit der verkürzten Form des menschlichen Nervenwachstumsfaktor - Rezeptor transduzierten Zellen zu markieren (ΔNGFR, Aminosäuren 1-277) 11 getrennt durch Furinspaltungsstelle, Serin-Glycin - Linker und 2A - Sequenzen 12,13. Design-Primer-codierenden Sequenzen, die Fragmentenden überlappen und montieren Plasmid als 1,3-1,5 in Schritten beschrieben.
ANMERKUNG: Diese Sequenzen können 11-13 in Referenzen. - Trans chemisch kompetente E. coli mit montiertem Plasmid folgenden Herstellerprotokoll 14. Seed transformierten Bakterien auf Agar-Platten (20 mg / ml LB-Medium (LB), 15 mg / ml Agar und 1 & mgr; g / ml Ampicillin) und inkubiere bei 37 ° C für 18 Stunden. Kultur ein einzelnes Bakterium Kolonie in 50 ml LB-Medium (20 mg / ml LB und 1 & mgr; g / ml Ampicillin) für 16 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C und 200 Umdrehungen pro min.
- Reinige Plasmide folgende Protokoll des Herstellers im Handel erhältlichen Midiprep Kits. Verdünnte Plasmid-Konzentration von etwa 1 ug / ul.
ANMERKUNG: Das Plasmid Reinigungsprotokoll basiert auf dem alkalischen Extraktionsverfahren 15.
2. Generieren Stabile Verpackungszelllinie
HINWEIS: Sowohl 293GPG und PG13-Zellen anhaften. Kulturzellen in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) supplementiert und 50 ug / ml Gentamicin. Kultur 293GPG Zellen mit 1 & mgr; g / ml Tetracyclin vor der Transfektion. Inkubiere Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 zwischen allen Schritten.
- Transfizieren 293GPG Verpackungszellen 16 kultiviert in T75 - Kolben mit dem hemichain-codierenden Vektor in Schritt 1.9 erhalten, using kommerziell erhältliche Transfektionsreagenz folgende Protokoll des Herstellers 1 7. HINWEIS: transfizieren 293GPG Zellen bei 50-60% Konfluenz.
- Absaugen Medium für 293GPG Zellen und 10 ml frisch nach der Transfektion DMEM Medium 1 Tag hinzu.
- Ernte produziert transient Virus aus transfizierten 293GPG Zellen 2 Tage nach Schritt 2.2 durch Kulturmedium übertragen durch 0,45 um-Filter an die Spritze und Vergehen.
HINWEIS: Virus kann sofort oder für eine spätere Verwendung bei -80 ° C gelagert werden. - Kultur 1 x 10 5 PG13 - Zellen in T25 - Kolben. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Nach einem Tag absaugen Kulturmedium und 1,5 ml von 293GPG abgeleitetes Virus aus Schritt 2.3 und 1,5 ml DMEM-Medium, zusammen mit 8 ug / ml Polybren.
- Ändern Sie das Medium wie in Schritt 2.4 einmal pro Tag beschrieben für 4 Tage, stabile PG13 Verpackungszelllinie Retrovirus kodiert, das TCR hemichain von Interesse zu etablieren.
- Absaugen Medium und ersetzenmit frischem DMEM-Medium für PG13-Zelllinien 24 Stunden nach der letzten Infektion für die weitere Kultur.
HINWEIS: Einfrieren oder Subkultur Zellen, indem sie mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung gelöst wird. - Zu Virus von transduzierten PG13 Zelllinien, Kultur 2 x 10 6 Zellen in T75 - Kolben mit 10 ml DMEM - Medium und des Ernte Virus produzieren , wie in Schritt 2.3 beschrieben 3 Tage nach dem Aussäen der Zellen.
HINWEIS: Virus ist am besten sofort verwendet, kann aber für bis zu zwei Monate bei -80 ° C gelagert werden.
3. Aktivierung und Transduktion von humanen T-Zellen
HINWEIS: Menschliche Proben werden in Übereinstimmung mit den institutionellen Ethikkommission genehmigten Protokollen erhalten und verwendet. Kultur primären humanen Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% Humanserum anstelle von FCS und 50 ug / ml Gentamicin. Inkubiere Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 zwischen allen Schritten.
- Isolieren menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) durch DichtegradientenzentrifugationGradiententrennung 18 nach Herstellerprotokoll.
- Aktivieren T-Zellen-Proliferation, die für retrovirale Infektion zu induzieren. Kultur 2 x 10 7 frischen oder aufgetauten PBMCs pro Well in 6-Well - Platte, in 5 ml RPMI - Medium mit 100 IU / ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (rhIL-2) und 50 ng / ml Anti-CD3 monoklonaler Antikörper (Klon OKT3).
- Drei Tage nach der Stimulation, sammeln T-Zellen durch Pipettieren und Zentrifuge bei 350 × g für 4 min. Überstand verwerfen und 0,5-1 x 10 6 T - Zellen pro Well in 24-Well - Platte resuspendiert Samen in 1 ml PG13 Virus von Schritt 2.7, und 1 ml RPMI - Medium , supplementiert mit 200 IU / ml rhIL-2. Zentrifugenplatte bei 1.000 xg und 32 ° C für 1 Stunde.
- Nach 24 Stunden sammeln T-Zellen durch Pipettieren und Zentrifuge bei 350 × g für 4 min. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 1 ml PG13 Virus von Schritt 2.7, und 1 ml RPMI-Medium, supplementiert mit 200 IU / ml rhIL-2. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 6 InfectIonen.
HINWEIS: Die Anzahl der Infektionen sollte von Verpackungszelllinie produziert je nach Titer des Virus optimiert werden. Falls erforderlich, durch Hindurch T-Zellen 20-30% der Zellen pro Tag zu entfernen Wucherung zu verhindern. - 24 Stunden nach der letzten Infektion, sammeln T-Zellen durch Pipettieren und Zentrifuge bei 350 × g für 4 min. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in RPMI-Medium mit 100 IU / ml rhIL-2 für eine weitere Kultur.
- 2-3 Tage nach dem Schritt 3.5, stain T-Zellen mit HLA-Multimer bei 4 ° C für 30 min, dann anti-human CD3 und Co-Rezeptor-monoklonalen Antikörpern (mAbs) bei 4 ° C für 15 min. Analysieren mittels Durchflusszytometrie. Verwenden irrelevant Multimer und / oder nicht - transduzierten Zellen als negative Kontrollen (Abbildung 1 - 3) 19.
- Wenn die eingeführte centric hemichain eine TCR & agr; Kette ist, V & beta; Nutzung der De - novo - Multimer - positiven Zellen analysieren im Handel erhältlichen V & beta;-spezifischer Antikörper - Panel mittels Durchflusszytometrie 20 verwendet wird .
4. Klonierung De Novo TCR Counter-hemichains
- Sortieren Sie die De - novo - Multimer positiven Population in Schritt 3.6 durch strömungsgestützte Zellsortierung.
- Isolieren von RNA aus sortierten T - Zellen unter Verwendung der Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform - Extraktionsverfahren 21,2 2.
HINWEIS: Die RNA kann bei -80 ° C gelagert werden, sollte aber cDNA verwendet werden, so schnell wie möglich zu erzeugen. - Synthetisieren cDNA - Bibliothek aus RNA extrahiert unter Verwendung von im Handel erhältlichen reversen Transkriptase-PCR - Kits folgenden Protokoll des Herstellers 23,24.
- TCR & bgr; Gegenketten Wenn das Klonen, Design V & beta; Gen und TCR & bgr; konstante Region spezifische Primer, wie 3.7 bestimmt in Schritt, und klonen voller Länge TCR & bgr; Gene als 1,3-1,9 in Schritten beschrieben. Siehe Schritt 4.5, wenn Gegenkette TCR & agr;, sonst weiterhin 5,1 Schritt.
- Im Handel erhältliche V & alpha;-spezifische Antikörper begrenzt sind, so Verwendung V & alpha; Gen kann nichtwerden durch Durchflusszytometrie bestimmt. Clone TCR & agr; Gegenketten über 5'-schnelle Amplifikation von cDNA - Enden (RACE) 25, unter Verwendung von im Handel erhältlichen 5 'RACE - Kits 6.
- Synthesize 5'-RACE-kompatibel cDNA aus RNA in Schritt extrahiert 4.2 Protokoll des folgenden Herstellers.
- Führen 1. Runde PCR , wie in Tabelle 2 beschrieben.
- Durchführung der Elektrophorese des PCR-Produkts und eluieren Bande von etwa 1.100 bps, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
- Führen 2. PCR - Runde , wie in Tabelle 3 beschrieben, unter Verwendung von 1. Runde PCR - Produkt als Vorlage.
HINWEIS: Die Primersequenzen unter Tabelle 3 gezeigt für die Klonierung in EcoRI und NotI verdaut wurden entworfen pMX Vektor. - Durchführung der Elektrophorese des PCR-Produkts und eluieren Bande von etwa 1.000 bps, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
- Clone TCR & agr; Gene in EcoRI und NotI verdaut pMX Vektor und purify Plasmiden wie in den Schritten 1,5-1,9 beschrieben.
5. Reconstituting Novel Antigen-spezifische TCR-Klone
HINWEIS: Culture Jurkat-Zellen 76 und nachfolgende Zelllinien in RPMI-Medium, ergänzt mit 10% FCS und 50 ug / ml Gentamicin. Inkubiere Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 zwischen allen Schritten.
- Transduzieren Jurkat 76 Zellen 26 (oder gleichwertig TCR - / - menschliche Linie T - Zellen) mit centric TCR hemichain 293GPG Virus in Schritt 2.3 hergestellt werden. 76 Jurkat, seed 5 x 10 4 Zellen pro Well in 24-Well - Platte mit 1 ml Virus und 1 ml RPMI Medium. Zentrifugenplatte bei 1.000 xg und 32 ° C für 1 Stunde.
- 24 Stunden nach der Infektion, sammeln hemichain transduzierten Jurkat-76-Zellen durch Pipettieren und Zentrifuge bei 350 × g für 4 min. Überstand verwerfen und resuspendieren in frischem RPMI-Medium für die weitere Kultur.
- Reinige transduzierten Zellen, wenn die hemichain molekular ist 2-3 Tage nach dem Schritt 5.2 durch Fleck markierting mit Fluorophor anti-NGFR mAb , gefolgt von Flow-unterstützte oder Magnet unterstützt Zellsortierung (optional) 27 konjugiert.
- 293GPG Virus kodiert, eine TCR-Zähler-Kette aus den Schritten geklont 4.4 oder 4.5 folgende Schritte 2.1 bis 2.3, produzieren.
- Um voll und ganz den TCR Rekonstitution transduzieren stabil T-Zell-Linie, die die zentrierte TCR hemichain in Schritten erzeugt exprimierenden 5,1-5,3 unter Verwendung von Virus aus Schritt 5.4. Führen Transduktion als 5.1-5.2 in Schritten beschrieben.
- Reinige CD3 + Transfektanten unter Verwendung von Anti-CD3 Magnet-gestützte Zellsortierung Protokoll folgenden Hersteller, 2-3 Tage nach dem Schritt 5.5 27.
- Um Antigenspezifität zu validieren, die Transfektanten Fleck klonotypischen TZR, bestehend aus der zentrierten TCR hemichain gepaart mit verschiedenen Gegen Ketten exprimieren, mit anti-CD3 und / oder Co-Rezeptor-mAb und HLA-Multimer, 3-5 Tage nach der CD3 Reinigung. Analysieren Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 4 - 5) 19.
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Representative Results
Ohne vorherige Kenntnis davon hemichain ist Kette zentrierten sollte die TCR & agr; und TCR & bgr; Kette getrennt kloniert und auf peripheren Blut - T - Zellen transduziert werden, die im Fall von HLA-A24 / WT1 reaktiven TAK1 TCR (Bild 1) durchgeführt wurde. Transduktion von TAK1β ergab eine deutlich höhere Frequenz von Antigen-spezifischen T-Zellen. Im Gegensatz dazu , Transduktion eines nicht-zentrierten hemichain würde de novo Multimer positiven T - Zellen nicht nachgeben, wie mit TAK1α Kette gesehen (Abbildung 1). Während der Analyse Tor auf NGFR + Zellen , wenn die TCR - Gen wurde markiert spezifisch transduzierten Zellen analysiert (Abbildung 1 - 2). Auf der anderen Seite kann die einzelne centric hemichain transduziert werden , wenn sie die SIG35α dominant zu sein , ist beispielsweise bekannt und unveränderlich Vα24 TCR & agr; Ketten (Abbildung 2 und 3). T-Zellen spezifisch für das jeweilige cognaß in der Frequenz erhöht Antigen auf Transduktion eines centric TCR & agr; hemichain. (Abbildung 2 - 3). Zusammen zeigen diese Daten , dass die Einführung einer zentrischen TCR & agr; oder TCR & bgr; hemichain auf peripheren Blut - T - Zellen können de novo TCRs mit dem Antigen-Spezifität von Interesse erzeugen.
Antigen-spezifische Population kann durch strömungs unterstützt Zelle sortiert werden Sortieren und TCR hemichains können geklont werden, wie im Protokoll beschrieben 4. klonotypischen TCR Gegen Ketten können einzeln auf einer Linie T-Zellen stabil die centric hemichain exprimieren wiederhergestellt werden. Jurkat 76 Transfektanten, mit dem Ausdruck neu einzigartige TCRs von TAK1β oder SIG35α centric hemichain transduzierten T - Zellen geklont, besaß Avidität für das jeweilige zugehöriges Antigen variiert, wie durch HLA bestimmt / Peptid - Multimer 5,6 Färbung. Insbesondere konnten wir de novo TCR & agr; Gegenketten t isolierenhat , wenn es mit TAK1β gepaart wurden entweder mit niedriger oder hoher Intensität durch das WT1 - Antigen - Komplexes als der elterliche TAK1αβ Paarung (Abbildung 4) gefärbt. In ähnlicher Weise gepaart SIG35α mit einzigartigen Gegenketten erkannt HLA-A2 / MART1 mit moderater bis hoher Avidität (Abbildung 5). SIG35α geklont wurde unabhängig von einem TCRαβ Heterodimer 5, also eine elterliche Paarung für diese hemichain war zum Vergleich nicht verfügbar. Wichtig ist, zeigen diese Daten, dass es möglich ist, durch Paarung der zentrischen hemichain mit verschiedenen Gegenketten, die Affinität für das Zielantigen zu modulieren.
Abb . 1: TAK1β als Beispiel für HLA-restringierten TCR & bgr; zentrierte hemichain TCR & agr; oder TCR & bgr; hemichains des HLA-A24 / WT1 reaktiven TAK1 TCR wurde mit abgestumpften nerve growth factor rece getaggtptor (ΔNGFR) und einzeln transduziert peripheren Blut-T-Zellen. Transfektanten wurden mit PC5-konjugierten anti-CD8 (133x verdünnt) und FITC-konjugierten anti-NGFR (20x verdünnt) monoklonale Antikörper (mAbs) gefärbt, und die angegebenen HLA-A24-Multimer (5 ug / ml), nach zweimal antigenspezifischen Stimulation. Insgesamt 6 Spendern wurden getestet. Alle Daten wurden gated auf NGFR + Zellen. Abbildung Wieder gedruckt mit Genehmigung aus Lit. 6. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2: SIG35α als Beispiel für HLA-restringierten TCR & agr; zentrierte hemichain SIG35α TCR & agr; Kette mit ΔNGFR getaggt oder der Tag allein wurde an peripheren Blut - T - Zellen transduziert. Transfektanten wurden mit PC5-co gefärbtnjugated anti-CD8 (133x verdünnt) und FITC-konjugierten anti-NGFR (20x verdünnt) mAbs und angegebenen HLA-A2-Multimer (8 & mgr; g / ml). Insgesamt 4 Spender wurden getestet. Alle Daten wurden gated auf NGFR + Zellen. Abbildung Wieder gedruckt mit Genehmigung aus Lit. 5 (Urheberrecht 2015. Die American Association of Immunologen, Inc.). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 3: Invariant natürliche Killer T (iNKT) Zellrezeptor Vα24 (Vα24i) als Beispiel für CD1d-restringierten TCR & agr; zentrierte hemichain Vα24i TCR & agr; -Kette zu peripheren Blut - T - Zellen transduziert. Transfektanten wurden mit FITC-konjugiertem anti-CD3 (20x verdünnt) und mAb angegeben CD1d Multimer (5 ug / ml) gefärbt. Entladene CD1d molen mit wurden aus HEK293-Zellen und Gegenwart endogener unbekannten Selbst Lipide produziert. iNKT TCR wird durch die Anerkennung von CD1d präsentiert α-GalCer oder dessen Analogon PBS-57 definiert. Insgesamt 4 Spender wurden getestet. Abbildung Wieder gedruckt mit Genehmigung aus Lit. 7. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative TCR & agr; Gegenketten aus TAK1β geklont transduzierten T - Zellen TCR & agr; Klone T262, A262, A186, A133 und T4 wurden aus HLA-A24 / WT1 geklont Multimer positive TAK1β transduziert peripheren T - Zellen und einzeln rekonstituiert auf Jurkat 76 Zellen. CD8, zusammen mit der TAK1β Kette exprimieren. Transfektanten wurden mit PC5-konjugierten anti-CD8-mAb (133x verdünnt) und zeigte HLA-A24 gefärbtMultimer (5 & mgr; g / ml). Die Daten sind repräsentativ zwei unabhängige Experimente. Fehlerbalken zeigen Bereich. Abbildung Wieder gedruckt mit Genehmigung aus Lit. 6. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative TCR & bgr; Gegen Ketten aus SIG35α geklont transduzierten T - Zellen TCR & bgr; Klone 413, 523, 788, 1086, 794, und 830 von HLA-A2 / MART1 geklont wurden Multimer positive SIG35α transduzierten peripheren T - Zellen und individuell Rekonstitution auf Jurkat. 76 Zellen, CD8, zusammen mit der SIG35α Kette exprimieren. DMF5 war ein zuvor geklont hohe TCR Affinität zu erkennen HLA-A2 / MART1. Transfektanten wurden mit PC5-konjugierten anti-CD8 mAb (133x verdünnt) und zeigte HLA-A2-Multimer (2 & mgr; g / m gefärbtenl). Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Fehlerbalken zeigen Bereich. Abbildung Wieder gedruckt mit Genehmigung aus Lit. 5 (Urheberrecht 2015. Die American Association of Immunologen, Inc.). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1:.. Einrichtung für pMX Vektor Verdauung Reagenzien und entsprechenden Volumina dargestellt Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 2: Setup für 1. Runde 5 'RACE PCR. Reagenzien und entsprechenden Volumina, PCR - Einstellungen und Primersequenz gezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 3: Setup für 2. Runde 5 'RACE PCR - Reagenzien und entsprechenden Volumina, PCR - Einstellungen und Primersequenzen gezeigt.. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
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Discussion
Die erste Voraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens ist das Erreichen ausreichender Transduktionseffizienz von primären T-Zellen mit dem hemichain von Interesse. Nach unserer Erfahrung ist die Kombination der Verwendung von PG13 als Verpackungszelllinie und pMX als retroviraler Vektor Ergebnisse in stabile und effiziente Expression des eingeführten Gens in humanen primären T-Zellen. PG13 Verpackungszellen können Einzelzelle für hochtitrige Verpackungszellen auszuwählen geklont sein Transduktionseffizienz zu verbessern. Darüber hinaus ist die Proliferation von T-Zellen auch für hohe Transduktionseffizienz von Retrovirus erforderlich. In dem beschriebenen Protokoll Stimulierung mit löslichem anti-CD3 mAb OKT3, zusammen mit einer hohen Konzentration von rhIL-2, stellt die erforderlichen Aktivierungssignale Zellteilung zu induzieren. Monozyten sind für die stimulierende Kapazität von löslichen OKT3 erforderlich, wahrscheinlich mit Fc-Rezeptoren durch Bindung. Daher Masse PBMC und nicht T-Zellen gereinigt, wird für diesen speziellen Stimulationsprotokoll erforderlich. TZellen sollten kultiviert werden in RPMI mit menschlichem Serum für optimale Versuchsergebnisse ergänzt. Alle anderen hier beschriebenen Zellen können in Gegenwart von fötalem Kälberserum kultiviert werden.
Zweitens de novo erzeugten antigenspezifischen TCRs exprimierenden Zellen muß detektierbar sein. Für bestimmte TCR hemichains wie TAK1β, de novo TCR - exprimierenden Zellen sind nur nachweisbar nach der Stimulation mit Antigen-gepulsten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs). Wenn somit antigenspezifische TCRs nicht unmittelbar nach der Transduktion von zentrischen hemichain erkannt werden, könnten sie nach der Expansion durch APCs nachweisbar sein. Man beachte , dass die Transduktion eines nicht-zentrierte hemichain würde nicht nachgeben de novo antigen-spezifischen T - Zellen selbst nach antigenspezifischen Erweiterung mit APCs, mit dem TAK1α hemichain (Abbildung 1) ersichtlich. In unseren Studien HLA Multimeren zur Detektion verwendet werden, jedoch könnte dies nicht für einige TCRs, insbesondere HLA-Klasse II beschränkte TCR erhältlichs. Eine Alternative wäre, T-Zell-funktionellen Antworten zu erfassen. Hemichain transduzierten T-Zellen mit APCs mit dem Antigen von Interesse gepulst stimuliert werden. Fahrzeug-gepulste APCs und nicht transduzierten T-Zellen können als Kontrollen verwendet werden. Reagieren T-Zellen kann durch Hochregulierung der Oberflächenaktivierungsmarker wie CD107a, CD154, CD137 oder detektiert werden.
Schließlich ist es wichtig zu überprüfen, dass die geklonten Gegenketten in der Tat das Antigen von Interesse erkennen, wenn sie mit dem zentrierten hemichain gepaart. Dies ist besonders wichtig , wenn die zentrische hemichain TCR & bgr; und Gegenketten sind TCR & agr;, da allelische Exklusion für TCR & agr; Gene leaky ist , und es wird geschätzt , dass ein erheblicher Teil der peripheren αβ T - Zellen exprimieren mehrere TCR & agr; Kette 28. Reaktivität mit Multimer Färbung oder Mess funktionelle Antwort nach Stimulation mit APCs bestätigt werden, um das zugehöriges Antigen zu präsentieren.
Ein limitatida bei dieser Technik ist , dass nicht jeder TCR eine zentrische hemichain komponieren, die beide TCR & agr; und TCR & bgr; 3 vergleichsweise beitragen Erkennungs in einigen Fällen auf Antigen. Daher ist bei solchen nicht-zentrierten hemichains transduzierten peripheren T - Zellen können nicht de novo Antigen-spezifischen TZR ergeben.
Dennoch stellt diese Methode einen konzeptionellen Fortschritt auf dem herkömmlichen Ansatz zu klonen TZR, wo beide TCR & agr; und TCR & bgr; Gene geklont werden müssen und die korrekte Paarung 29,30 gewährleistet sein muss. In unserer Technik, Paarung zwischen hemichains ist nicht mehr ein Hauptanliegen und nur eine der TCR-Ketten benötigt geklont gegeben werden, dass der andere fest ist. Zusätzlich zu HLA-Klasse I oder CD1d-restricted TCRs, kann das beschriebene Verfahren auch für die Isolierung von HLA-Klasse-II-restringierte TCRs für TCR Gentherapie angewendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
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