Summary
Hierin beschrijven we een nieuwe methode om antigeenspecifieke T-celreceptoren (TCR's) door het koppelen van de TCRα of TcR van een bestaande TCR, bezit de antigeen-specificiteit van interesse, met aanvullende hemichain van de perifere T-cel receptor repertoire genereren. De novo geproduceerde TCRs behouden antigeen-specificiteit met verschillende affiniteit.
Abstract
T-celreceptoren (TCR's) worden klinisch gebruikt om de specificiteit van T-cellen direct naar tumoren te richten als een veelbelovende modaliteit van immunotherapie. Daarom heeft TCRs klonen specifiek voor verschillende tumor-geassocieerde antigenen het doel van vele studies. Een effectieve T-cel op te wekken, moet de TCR het doelantigeen optimale affiniteit herkennen. Echter, klonen dergelijke TCRs uitdaging en vele beschikbare TCRs geweest bezitten suboptimaal affiniteit voor de verwante antigeen. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het kloneren van de novo hoge affiniteit antigeenspecifieke TCRs Bestaande TCRs door gebruik hemichain centricity. Het is bekend dat sommige TCRs, elk TCRα of TcR hemichain niet gelijk bijdragen aan antigeen herkenning, en de dominante hemichain wordt aangeduid als centraal hemichain. We hebben aangetoond dat door het koppelen van de centrische hemichain met tegenstroom ketens verschillen van de oorspronkelijke contra-keten, kunnen wij het antigeen en handhavenpecificity, terwijl de interactie moduleren kracht voor de verwant antigeen. Aldus kan het therapeutisch potentieel van een bepaalde TCR worden verbeterd door het optimaliseren van de koppeling tussen de centrische en tegen hemichains.
Introduction
T-celreceptoren (TCR's) zijn heterodimere adaptieve immuun receptoren door T-lymfocyten tot expressie gebracht, bestaande uit een TCRα en TcR keten. Ze optreden via somatische herschikking van V (D) J-gensegmenten, die een zeer divers repertoire kan herkennen vrijwel onbegrensde configuratie van HLA / peptide-complexen produceert. Klinisch T cellen ontworpen om clonotypic TCRs die specifiek zijn voor met tumor geassocieerde antigenen tot expressie aangetoond werkzaamheid bij verschillende kankers 1. Veel TCRs gekloneerd hiertoe onvoldoende affiniteit voor het antigeen van belang, waardoor hun therapeutische toepassing te beperken.
We beschrijven een werkwijze om deze beperking te overwinnen bestaande TCRs door gebruik keten centricity. Vermeld is dat een TCR hemichain een dominante rol in herkenning van het doelantigeen 2 kan spelen, hier genoemd centraal stellen. Crystal structurele analyses blijkt dat een centraalhemichain van een TCR kan verantwoordelijk voor het merendeel van de voetafdruk op het MHC / peptidecomplex 3,4. Dit begrip te gebruiken, hebben we eerder aangetoond dat het SIG35α TCRα kan koppelen met een divers repertoire van TcR ketens en onderhouden reactiviteit tegen MART1 27-35 peptide gepresenteerd door HLA-A2 5. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met de TCR TAK1, waarbij de centrische TcR hemichain gekoppeld aan allerlei TCRα ketens en onderhouden reactiviteit voor WT1 235-243 peptide gepresenteerd door HLA-A24 6. Zowel MART1 en WT1 zijn tumor-geassocieerde antigenen. Chain-centricity werd ook toegepast op antigeen erkenning van CD1d-beperkte invariante natural killer (iNKT) TCR's te bestuderen, door het koppelen van de invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα keten van humaan iNKT TCR's met verschillende Vβ11 TcR ketens 7.
In alle gevallen konden we een de novo repertoire van TCRs genereren van transducing de centric TCR hemichain perifere bloed T-cellen, waarbij het ingebrachte hemichain gepaard met de endogene TCRα of TcR contra-ketens. In wezen centric hemichain dient als lokaas die kan worden gebruikt om de juiste contra-ketens, die bij elkaar gekoppelde vormen TCRs die de antigeenspecificiteit van belang, maar variërend in affiniteit te identificeren. Van deze nieuwe repertoires, waren we in staat om clonotypic TCR's te isoleren met een verbeterde interactie sterkte tegen het doelantigeen in vergelijking met reeds bestaande TCR's. Daarom geloven wij deze methode zal de pijpleiding identificeren optimale TCR's voor klinische toepassing te versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding Retrovirale Construct Encoding TCR Hemichain Interessante
- Lineariseren PMX vector de insertie van een TCR gen in opeenvolgende stappen laten. Digest het plasmide DNA met EcoRI en NotI restrictie-enzymen bij 37 ° C gedurende 3 uur (Tabel 1) 8.
- Het uitvoeren van elektroforese van de verteerde plasmide op 1,2% agarosegel. Accijnzen band van ongeveer 4500 basenparen (bps) en elueren in 30 ul steriel water met behulp van commercieel verkrijgbare gel extractie kits 9.
- Ontwerp 5 'en 3' primers voor de TCR gen van interesse dat ook 15-20 bp overlappen de EcoRI en Notl digestie plaats van PMX vector, respectievelijk 8 coderen.
- TCR gen amplificeren met primers. Voer elektroforese van het PCR-product en elueer band van ongeveer 1000 bp, zoals beschreven in stap 1.2.
- Kloon TCR gen in gedigereerde vector combineert elke lineaire fragment met in de handel verkrijgbare plasmidesamenstel hoofdmengsel reagens en incuberen bij 50 ° C gedurende 1 uur.
OPMERKING: Raadpleeg het protocol van de fabrikant voor de relatieve hoeveelheden van elke component. Deze montagemethode is gebaseerd op de techniek die oorspronkelijk is beschreven door Gibson et al. 10. - (Optioneel) Tag TCR gen markeren getransduceerde cellen met de afgeknotte vorm van humane zenuwgroeifactor receptor (ΔNGFR, aminozuren 1-277) 11 gescheiden door furine splitsingsplaats, serine-glycine-linker en 2A sequenties 12,13. Ontwerp primers coderende sequenties overlappen het fragment eindigt en assembleren plasmide zoals beschreven in de stappen 1,3-1,5.
LET OP: Deze sequenties kunnen worden gevonden in de referenties 11-13. - Transformeer chemisch competente E. coli met geassembleerde plasmide na 14 protocol van de fabrikant. Zaad getransformeerde bacteriën op agarplaten (20 mg / ml lysogenie bouillon (LB), 15 mg / ml agar en 1 ug / ml ampicilline) en incubeer bij 37 ° C gedurende 18 uur. Cultuur één bacterie kolonie in 50 ml LB medium (20 mg / ml LB en 1 ug / ml ampicilline) gedurende 16 uur in een schudincubator bij 37 ° C en 200 toeren per minuut.
- Zuiver plasmiden behulp van commercieel verkrijgbare kits Midiprep volgende protocol van de fabrikant. Verdun plasmide concentratie van ongeveer 1 ug / ul.
OPMERKING: Het plasmide zuiveringsprotocol gebaseerd op de alkalische extractiewerkwijze 15.
2. Het genereren van stabiele verpakkende cellijn
OPMERKING: Zowel 293GPG en PG13 cellen hechtende. Kweekcellen in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 50 ug / ml gentamicine. Cultuur 293GPG cellen met 1 ug / ml tetracycline voor transfectie. Incubeer cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 tussen alle stappen.
- Transfecteren 293GPG inpakcellen 16 gekweekt in T75 fles met de hemichain-encoding vector verkregen in stap 1.9, using handel verkrijgbare transfectiereagens volgende protocol van de fabrikant 1 7. OPMERKING: Transfecteren 293GPG cellen bij 50-60% confluentie.
- Zuig medium voor 293GPG cellen en voeg 10 ml vers DMEM medium 1 dag na transfectie.
- Harvest transient geproduceerde virus uit getransfecteerde 293GPG cellen 2 dagen na stap 2.2 door de overdracht van kweekmedium spuit en door 0,45 pm filter.
OPMERKING: Virus kan onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. - Cultuur 1 x 10 5 cellen in PG13 T25 fles. Aantal cellen met een hemocytometer. Na een dag, aspireren kweekmedium en voeg 1,5 ml 293GPG afgeleide virus van stap 2,3 en 1,5 ml DMEM medium met 8 ug / ml polybreen.
- Verander het medium zoals beschreven in stap 2,4 keer per dag gedurende 4 dagen, PG13 stabiele verpakkingscellijn produceert retrovirus dat codeert voor de TCR hemichain plaats vast.
- Zuig medium en vervangmet verse DMEM medium voor PG13 cellijnen 24 uur na de laatste infectie voor verdere cultuur.
LET OP: Freeze of subcultuur cellen door het losmaken met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing. - Virus van PG13 getransduceerde cellijnen, cultuur 2 x 10 6 cellen in T75 kolf met 10 ml DMEM medium en oogsten virus produceren zoals beschreven in stap 2.3 drie dagen na het zaaien van de cellen.
OPMERKING: Virus best onmiddellijk gebruikt, maar tot twee maanden kunnen worden bewaard bij -80 ° C.
3. Activering en transductie van menselijke T-cellen
LET OP: De menselijke monsters worden verkregen en gebruikt in overeenstemming met de institutionele ethische commissie goedgekeurd protocollen. Kweken primaire humane cellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium aangevuld met 10% humaan serum in plaats van FCS en 50 ug / ml gentamicine. Incubeer cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 tussen alle stappen.
- Isoleer humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) van dichtheidgradiëntscheiding volgende protocol van de fabrikant 18.
- Activeren van T-cellen om proliferatie vereist voor retrovirale infectie veroorzaken. Cultuur 2 x 10 7 verse of ontdooide PBMC per putje in 6-well plaat, in 5 ml RPMI-medium met 100 IU / ml recombinant humaan interleukine-2 (rhIL-2) en 50 ng / ml anti-CD3 monoklonaal antilichaam (kloon OKT3).
- Drie dagen na stimulering, laat T-cellen door pipetteren en centrifugeer bij 350 xg gedurende 4 min. Verwijder het supernatant en zaden 0,5-1 x 10 6 T cellen per putje in 24-putjes plaat gehersuspendeerd in 1 ml PG13 virus van stap 2,7, en 1 ml RPMI medium aangevuld met 200 IU / ml rhIL-2. Centrifugeer plaat bij 1000 x g en 32 ° C gedurende 1 uur.
- Na 24 uur, laat T-cellen door pipetteren en centrifugeer bij 350 xg gedurende 4 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml PG13 virus van stap 2,7, en 1 ml RPMI medium aangevuld met 200 IU / ml rhIL-2. Herhaal deze procedure voor een totaal van 6 infectionen.
Opmerking: aantal infecties worden geoptimaliseerd afhankelijk titer van virus door verpakkingscellijn. Eventueel passage T-cellen door het verwijderen van 20-30% van de cellen elke dag om overgroei te voorkomen. - 24 uur na de laatste besmetting, laat T-cellen door pipetteren en centrifugeer bij 350 xg gedurende 4 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in RPMI-medium met 100 IU / ml rhIL-2 voor verdere kweek.
- 2-3 dagen na stap 3,5, vlek T-cellen met HLA multimeer bij 4 ° C gedurende 30 min, vervolgens anti-humaan CD3 en co-receptor monoklonale antilichamen (mAbs) bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Analyseren door flowcytometrie. Gebruik irrelevant multimeer en / of niet getransduceerde cellen als negatieve controle (Figuur 1-3) 19.
- Als de ingevoerde centric hemichain een TCRα keten analyseren Vp gebruik van de novo multimeer positieve cellen met behulp van commercieel verkrijgbaar Vp-antilichaam panel door 20 flowcytometrie.
4. Klonering De Novo TCR Counter-hemichains
- Sorteer de novo multimeer positieve populatie in stap 3.6 door-stroming bijgestaan celsortering.
- Isoleren van RNA gesorteerd T cellen met behulp van de zure guanidinium thiocyanaat-fenol- chloroform extractie methode 21,2 2.
OPMERKING: RNA kan worden opgeslagen bij -80 ° C, maar moeten worden gebruikt om cDNA te genereren zo spoedig mogelijk. - Synthetiseren cDNA-bibliotheek van RNA geëxtraheerd met behulp van commercieel beschikbare reverse transcriptase-PCR kit volgens het protocol van de fabrikant 23,24.
- Als het klonen TcR contra-ketens, ontwerpen Vp-gen en TcR constante gebied van specifieke primers, zoals bepaald in stap 3.7, en kloon full-length TcR genen als in stappen 1,3-1,9 beschreven. Zie stap 4.5 als contra-keten is TCRα, anders verder met stap 5.1.
- Commercieel verkrijgbare Va-specifieke antilichamen worden beperkt, waardoor Va gengebruik kan nietbepaald door flow cytometrie. Clone TCRα contra-ketens via 5'-snelle amplificatie van cDNA-uiteinden (RACE) 25, met behulp van in de handel verkrijgbare 5 'RACE kits 6.
- Synthetiseren 5 'RACE compatibel cDNA uit RNA geëxtraheerd in stap 4.2 volgende protocol van de fabrikant.
- Voer 1 st door PCR zoals beschreven in tabel 2.
- Voer elektroforese van het PCR-product en elueer band van ongeveer 1100 bp, zoals beschreven in stap 1.2.
- Voer 2 nd door PCR zoals beschreven in Tabel 3, middels 1 st round PCR-product als matrijs.
LET OP: Primer sequenties weergegeven in tabel 3 zijn ontworpen voor het kloneren in EcoRI en Notl geknipt PMX vector. - Voer elektroforese van het PCR-product en elueer band van ongeveer 1000 bp, zoals beschreven in stap 1.2.
- Clone TCRα genen in EcoRI en Notl geknipt PMX vector en Purify plasmiden zoals beschreven in de stappen 1,5-1,9.
5. reconstitueren Novel Antigeen-specifieke TCR Clones
OPMERKING: Culture Jurkat cellen 76 en volgende cellijnen in RPMI medium aangevuld met 10% FCS en 50 ug / ml gentamicine. Incubeer cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 tussen alle stappen.
- Transduceren Jurkat 76 cellen 26 (of gelijkwaardig TCR - / - menselijke T-cellijn) met centrische TCR hemichain behulp 293GPG virus geproduceerd in stap 2.3. Voor Jurkat 76, zaad 5 x 10 4 cellen per putje in 24-well plaat met 1 ml virus en 1 ml RPMI medium. Centrifugeer plaat bij 1000 x g en 32 ° C gedurende 1 uur.
- 24 uur na infectie, verzamelen hemichain getransduceerde Jurkat-cellen 76 door pipetteren en centrifugeer bij 350 xg gedurende 4 min. Gooi supernatant en resuspendeer in verse RPMI medium voor verdere cultuur.
- Zuiver getransduceerde cellen als de hemichain is moleculair gelabeld 2-3 dagen na stap 5.2, door vleking met fluorofoor geconjugeerd anti-NGFR mAb gevolgd door-stroming bijgestaan of magnetische-geassisteerde celsortering (optioneel) 27.
- De volgende stappen 2,1-2,3, produceren 293GPG virus dat codeert voor een TCR contra-keten gekloond uit stappen 4.4 of 4.5.
- Om volledig te reconstrueren de TCR, transduceren T-cellijn stabiel tot expressie de centric TCR hemichain gegenereerd in de stappen 5,1-5,3 met behulp van virus uit stap 5.4. Voer transductie zoals beschreven in de stappen 5,1-5,2.
- Zuiver CD3 + transfectanten middels anti-CD3 magnetische ondersteunde celsortering volgende protocol van de fabrikant, 2-3 dagen na stap 27 5,5.
- Om antigeenspecificiteit valideren vlekken de transfectanten expressie clonotypic TCRs bestaande uit centric TCR hemichain gekoppeld aan verschillende contra-ketens met anti-CD3 en / of co-receptor mAb en HLA multimeer 3-5 dagen na CD3 zuivering. Analyseer cellen door flowcytometrie (Figuur 4-5) 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zonder voorkennis waarvan hemichain is keten-centric, de TCRα en TcR keten afzonderlijk worden gekloneerd en getransduceerd perifere bloed T-cellen, die werd uitgevoerd bij HLA-A24 / WT1 reactieve TAK1 TCR (figuur 1). Transductie van TAK1β leverde een aanzienlijk hogere frequentie van antigenspecifieke T-cellen. Omgekeerd transductie van een non-centric hemichain niet op de novo multimeer positieve T-cellen, zoals gezien met TAK1α keten (figuur 1). Tijdens analyse poort aan NGFR + cellen als de TCR gen hebben om specifiek wat getransduceerde cellen (Figuur 1-2). Aan de andere kant kan de interne centric hemichain worden getransduceerd als bekend dominant te zijn, bijvoorbeeld de SIG35α en invariante Vα24 TCRα ketens (figuur 2 en 3). T-cellen specifiek voor het respectievelijke Cognaten antigen verhoogde frequentie op transductie van een centric TCRα hemichain. (Figuur 2-3). Tezamen tonen deze gegevens aan dat de invoering van een centraal TCRα of TcR hemichain perifere bloed T-cellen kunnen de novo TCRs met het antigeen-specificiteit plaats genereren.
Antigeen-specifieke populatie kan worden gesorteerd door flow geassisteerde celsortering en TCR hemichains kan worden gekloneerd zoals beschreven in de sectie protocol 4. Clonotypic TCR contra-ketens kunnen afzonderlijk worden gereconstitueerd op een T-cellijn stabiel tot expressie het centraal hemichain. Jurkat 76 transfectanten, expressie onlangs gekloneerd unieke TCRs van TAK1β of SIG35α centrische hemichain getransduceerde T-cellen bezaten variërende aviditeit voor de respectievelijke verwant antigeen, zoals bepaald met HLA / peptide multimeer kleuring 5,6. In het bijzonder, waren we in staat om te isoleren de novo TCRα contra-chains tpet wanneer gecombineerd met TAK1β werden gekleurd met hetzij lagere of hogere intensiteit van het WT1 antigeencomplex dan de parentale TAK1αβ koppeling (figuur 4). Ook SIG35α gecombineerd met unieke contra-ketens herkend HLA-A2 / MART1 met matige tot hoge aviditeit (Figuur 5). SIG35α werd gekloond, onafhankelijk van een TCRαβ heterodimeer 5, dus een ouderlijke koppeling voor deze hemichain was niet beschikbaar voor vergelijking. Belangrijk is dat deze gegevens blijkt dat het mogelijk is om de affiniteit voor het doelantigeen moduleren door het koppelen van het centraal hemichain met verschillende contra-ketens.
Figuur 1:. TAK1β als voorbeeld van HLA-beperkte TcR centric hemichain TCRα of TcR hemichains van de HLA-A24 / WT1 reactieve TAK1 TCR werd gelabeld met afgeknotte zenuwgroeifactor receptor (ΔNGFR), en individueel getransduceerde perifere bloed T-cellen. Transfectanten werden gekleurd met PC5-geconjugeerd anti-CD8 (133x verdund) en FITC-geconjugeerd anti-NGFR (20x verdund) monoklonale antilichamen (mAbs), en gaf aan HLA-A24 multimeer (5 ug / ml), na tweemaal antigeenspecifieke stimulatie. Totaal 6 donoren werden getest. Alle gegevens werden gated op NGFR + cellen. Figuur opnieuw afgedrukt met toestemming van referentie-6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. SIG35α als voorbeeld van HLA-beperkte TCRα centric hemichain SIG35α TCRα keten hebben met ΔNGFR of het label alleen, werd getransduceerd perifere bloed T-cellen. Transfectanten werden gekleurd met PC5-conjugated anti-CD8 (133x verdund) en FITC-geconjugeerd anti-NGFR (20x verdund) mAb en aangegeven HLA-A2 multimeer (8 ug / ml). Totaal 4 donoren werden getest. Alle gegevens werden gated op NGFR + cellen. Figuur opnieuw afgedrukt met toestemming van referentie 5 (Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Invariant natural killer T (iNKT) celreceptor Vα24 (Vα24i) als een voorbeeld van CD1d beperkte TCRα centric hemichain Vα24i TCRα keten werd getransduceerd naar perifere bloed T-cellen. Transfectanten werden gekleurd met FITC-geconjugeerd anti-CD3 (20x verdund) mAb en CD1d aangegeven multimeer (5 ug / ml). Gelost CD1d molecules werden geproduceerd uit HEK293 cellen en aanwezig endogene onbekende zelf-lipiden. iNKT TCR wordt bepaald door erkenning van CD1d presenteren α-GalCer of zijn analoog PBS-57. Totaal 4 donoren werden getest. Figuur opnieuw afgedrukt met toestemming van referentie-7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vertegenwoordiger TCRα contra-ketens gekloond uit TAK1β getransduceerde T-cellen TCRα klonen T262, A262, A186, A133, en T4 werden gekloond uit HLA-A24 / WT1 multimeer positieve TAK1β getransduceerde perifere T-cellen, en individueel opgeloste op Jurkat 76 cellen. CD8 tot expressie brengen, samen met de TAK1β keten. Transfectanten werden gekleurd met PC5-geconjugeerd anti-CD8 mAb (133x verwaterd) en gaf aan HLA-A24multimeer (5 ug / ml). Gegevens representatief twee onafhankelijke experimenten. Fout balken geven bereik. Figuur opnieuw afgedrukt met toestemming van referentie-6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve TcR contra-ketens gekloond uit SIG35α getransduceerde T-cellen TcR klonen 413, 523, 788, 1086, 794, en 830 werden uit HLA-A2 / MART1 gekloonde multimeer positieve SIG35α getransduceerde perifere T-cellen, en individueel opgeloste op Jurkat. 76 cellen die CD8, samen met de SIG35α keten. DMF5 was een eerder gekloonde hoge affiniteit TCR herkennen van HLA-A2 / MART1. Transfectanten werden gekleurd met PC5-geconjugeerd anti-CD8 mAb (133x verwaterd) en gaf aan HLA-A2 multimeer (2 ug / ml). Gegevens zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. Fout balken geven bereik. Figuur opnieuw afgedrukt met toestemming van referentie 5 (Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1:.. Setup voor PMX vector spijsvertering reagentia en de respectieve volumes worden getoond Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Tabel 2: Setup voor 1 st round 5 'RACE PCR. Reagentia en de respectieve volumes, PCR-instellingen en primersequentie worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Tabel 3: Setup voor 2 e toer 5 'RACE PCR-reagentia en de respectieve volumes, PCR-instellingen en primer sequenties worden getoond.. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerste vereiste voor succesvolle toepassing van deze werkwijze is het bereiken van voldoende transductie efficiëntie van de primaire T-cellen met de hemichain plaats. In onze ervaring, de combinatie van het gebruik van PG13 als verpakkingscellijn en retrovirale vector pmx als resultaten in een stabiele en efficiënte expressie van het geïntroduceerde gen in primaire T-cellen. PG13 packaging cellen kunnen eencellige gekloond om te selecteren op hoge titer inpakcellen transductie efficiëntie verbeteren. Bovendien is de proliferatie van T-cellen ook vereist voor hoge transductie-efficiëntie met retrovirus. In de beschreven protocol stimulatie met oplosbaar anti-CD3 mAb OKT3, samen met een hoge concentratie van rhIL-2, de nodige activatiesignalen celdeling te induceren. Monocyten zijn vereist voor het stimulerende vermogen van oplosbaar OKT3, waarschijnlijk door binding aan Fc-receptoren. Daarom bulk PBMC en niet gezuiverde T-cellen, is nodig voor deze stimuleringsprotocol. Tcellen moeten worden gekweekt in RPMI gesupplementeerd met humaan serum optimale experimentele resultaten. Alle andere hierin beschreven cellen gekweekt in aanwezigheid van foetaal kalfsserum zijn.
Ten tweede moet de novo gegenereerde antigeenspecifieke TCRs expressie brengende cellen detecteerbaar. Voor bepaalde TCR hemichains zoals TAK1β, de novo TCR tot expressie brengende cellen zijn alleen gedetecteerd na stimulatie met antigeen-gepulste antigen-presenterende cellen (APCs). Dus als antigeenspecifieke TCRs niet onmiddellijk na transductie van centric hemichain gedetecteerd Ze konden detecteerbaar na expansie door APCs zijn. Merk op dat transductie van een niet-centrische hemichain niet de novo antigenspecifieke T-cellen te leveren, zelfs na antigeenspecifieke expansie met APCs, zoals gezien met de TAK1α hemichain (figuur 1). In onze studies, worden HLA multimeren gebruikt voor de detectie, echter dit misschien niet beschikbaar zijn voor sommige TCR, met name HLA klasse II beperkt TCRs. Een alternatief zou zijn om T-cel functionele responsen te detecteren. Hemichain getransduceerde T-cellen kan worden gestimuleerd met APCs gepulst met het antigeen van belang. Voertuig gepulseerde APC's en T niet getransduceerde cellen kunnen worden gebruikt als controles. Reageren T-cellen kan worden gedetecteerd door opregulatie van oppervlakteactivering merkers zoals CD107a, CD154 of CD137.
Ten slotte is het belangrijk om te bevestigen dat de gekloonde contra-ketens hebben in feite herkennen het antigeen van belang wanneer deze is gekoppeld met de centric hemichain. Dit is vooral belangrijk wanneer de centrische hemichain is TcR en contra-ketens TCRα, aangezien allelische uitsluiting TCRα genen lekt en er wordt geschat dat een aanzienlijk deel van perifere T-cellen tot expressie αβ meerdere TCRα keten 28. Reactiviteit kan worden bevestigd met multimeer kleuring of het meten van de functionele respons na stimulatie met APC's presenteren van de verwante antigeen.
Eén limitatieen van deze techniek is dat niet iedere TCR een centraal hemichain samenstellen, aangezien zowel TCRα en TcR dragen vergelijkbaar erkenning antigeen in sommige gevallen 3. Daarom perifere T-cellen getransduceerd met dergelijke niet-centric hemichains mag niet de novo antigeenspecifieke TCRs verkregen.
Toch is deze werkwijze is een conceptuele verbetering van de conventionele benadering kloneren TCRs, waarbij zowel TCRα en TcR genen worden gekloneerd en correcte koppeling worden gewaarborgd 29,30. In onze techniek paring tussen hemichains niet langer een hoofdzorg en slechts één van de TCR-ketens moet worden gekloneerd, aangezien de andere vast is. Naast HLA klasse I-beperkte CD1d TCRs, kan de beschreven werkwijze ook worden toegepast op de isolatie van HLA klasse II-beperkte TCRs voor TCR gentherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
