यहाँ हम तनाव के तहत पृथक क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन आयात अध्ययन करने के लिए एक नई विधि का वर्णन है। विधि तेजी से और सीधा है, और क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात के लिए अलग तनाव की स्थिति का परिणाम है, और इसी नियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
क्लोरोप्लास्ट पौधों में कई महत्वपूर्ण भूमिका है, जो न केवल प्रकाश संश्लेषण, लेकिन कई अन्य चयापचय और संकेत कार्यों में शामिल हैं के साथ अंगों कर रहे हैं। इसके अलावा, इस तरह के क्लोरोप्लास्ट लवणता और आसमाटिक तनाव के रूप में विभिन्न अजैविक दबावों, संयंत्र प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक क्लोरोप्लास्ट ~ 3000 विभिन्न प्रोटीन, जिनमें से कुछ अपने स्वयं के जीनोम से इनकोड किया गया है अप करने के लिए हो सकता है। हालांकि, क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन का बहुमत नाभिक में इनकोड किया गया है और cytosol में संश्लेषित, और इन प्रोटीनों क्लोरोप्लास्ट लिफाफा झिल्ली पर translocons के माध्यम से क्लोरोप्लास्ट में आयात करने की जरूरत है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात सक्रिय रूप से तनाव द्वारा विनियमित किया जा सकता है। biochemically तनाव की स्थिति के तहत प्रोटीन आयात के इस तरह के नियमन की जांच करने के लिए, हम विधि यहाँ एक त्वरित और सरल प्रक्रिया है कि आसानी से किसी भी प्रयोगशाला में प्राप्त किया जा सकता है के रूप में वर्णित विकसित की है। इस विधि में, पौधों सामान्य conditio के तहत बड़े हो रहे हैंएनएस और फिर तरल संस्कृति में तनाव की स्थिति से अवगत कराया। संयंत्र सामग्री एकत्र किया जाता है, और क्लोरोप्लास्ट तो homogenization द्वारा जारी किया जाता है। कच्चे तेल की homogenate घनत्व ढाल centrifugation द्वारा अलग किया जाता है, बरकरार क्लोरोप्लास्ट के अलगाव को सक्षम। Chloroplast उपज गिनती द्वारा मूल्यांकन किया है, और क्लोरोप्लास्ट intactness एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच की है। प्रोटीन आयात assays के लिए, शुद्ध क्लोरोप्लास्ट विट्रो अनुवाद अग्रदूत प्रोटीन में 35 एस radiolabeled के साथ incubated रहे हैं, और समय पाठ्यक्रम प्रयोगों तनाव की स्थिति के तहत जीनोटाइप के बीच आयात दरों की तुलना सक्षम करने के लिए आयोजित की जाती हैं। हम इस पद्धति जो बताते हैं कि एक नियामक उत्परिवर्ती प्रोटीन से आयात की दर क्लोरोप्लास्ट में विशेष रूप से आसमाटिक तनाव की स्थिति के तहत बदल दिया है का उपयोग कर उत्पन्न डेटा प्रस्तुत करते हैं।
क्लोरोप्लास्ट अत्यधिक प्रचुर मात्रा में अंगों कि पौधों की हरी ऊतकों में मौजूद हैं। वे प्रकाश संश्लेषण में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका है, एक प्रक्रिया प्रकाश ऊर्जा का उपयोग करता है कि चीनी के लिए कार्बन डाइऑक्साइड बदलने और इस प्रकार पृथ्वी पर 1 लगभग सभी के जीवन का समर्थन करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। इसके अलावा, क्लोरोप्लास्ट (और संबंधित अंगों प्लास्टिडों बुलाया के व्यापक परिवार) पौधों में कई अन्य महत्वपूर्ण भूमिकाओं, अमीनो एसिड, लिपिड, पिगमेंट के biosynthesis, और जैसे गुरुत्वाकर्षण और रोगज़नक़ चुनौती के रूप में पर्यावरण के संकेतों के संवेदन सहित खेलते हैं। प्रकाश संश्लेषण, जो कुछ निश्चित परिस्थितियों में उपयोगी भूमिका है द्वारा उत्पादों के रूप में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पन्न करता है, लेकिन अगर overproduced हानिकारक या भी घातक प्रभाव हो सकता है। आरओएस के overproduction विशेष रूप से पर्यावरण पर प्रतिकूल परिस्थितियों से पदोन्नत किया है, और इस तरह क्लोरोप्लास्ट बारीकी से इस तरह लवणता और आसमाटिक तनाव 2 के रूप में अजैविक दबावों, के लिए प्रतिक्रियाओं से जुड़ी हैं।
चौधरीloroplasts एक जटिल संरचना है। प्रत्येक क्लोरोप्लास्ट बाहरी और भीतरी झिल्ली के होते हैं जो एक डबल झिल्ली बाहरी परत लिफाफा कहा जाता है, से घिरा हुआ है। आंतरिक रूप से, वहाँ एक और झिल्ली प्रणाली thylakoids, जहां प्रकाश संश्लेषण के प्रकाश प्रतिक्रियाओं जगह ले कहा जाता है। दोनों के बीच झिल्ली सिस्टम एक जलीय डिब्बे कॉल स्ट्रोमा, जो कार्बन निर्धारण में शामिल किया जाता है। एक क्लोरोप्लास्ट अप ~ 3,000 से अलग प्रोटीन शामिल कर सकते हैं, और इन प्रोटीनों के विशाल बहुमत के अग्रदूत के रूप में cytosol में संश्लेषित कर रहे हैं और लिफाफा झिल्ली 1 में समर्पित प्रोटीन translocons के माध्यम से organelle में आयात करने की जरूरत है। दिलचस्प है, हाल ही में काम संकेत दिया है कि क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात सक्रिय रूप से नियंत्रित किया जाता है, और इसलिए क्लोरोप्लास्ट proteome पर नियंत्रण का एक महत्वपूर्ण स्तर लागू करने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, यह 2015 में सूचना मिली थी कि प्रोटीन आयात वीं की बहुतायत के प्रत्यक्ष विनियमन के माध्यम से अजैव तनाव का जवाब कर सकते हैंक्लोरोप्लास्ट (टीओसी) यूबीक्यूटिन-एंटीबॉडी प्रणाली 3 से की बाहरी झिल्ली लिफाफे पर ई translocon।
शुद्ध क्लोरोप्लास्ट का प्रयोग और इन विट्रो संश्लेषित अग्रदूत प्रोटीन में, प्रोटीन आयात विट्रो 4,5 में पुनर्गठन किया जा सकता है। इस प्रकार, इन विट्रो तरीकों अलग उत्परिवर्ती पौधों 6, जो प्रोटीन आयात मशीनरी के ख्यात घटकों के विश्लेषण के लिए और तंत्र प्रोटीन आयात और उसके विनियमन अंतर्निहित खोज के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण से किया गया है में आयात की दर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, क्लोरोप्लास्ट आगे विभाजन या प्रोटीज पाचन, इन विट्रो आयात के बाद, जो उप organellar स्थानीयकरण और क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन 7.8 के टोपोलॉजी पर अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं के साथ कार्रवाई की जा सकती है।
तनाव से प्रोटीन आयात का विनियमन का अध्ययन करने के लिए, हम अपनी दिनचर्या क्लोरोप्लास्ट अलगाव विधि को संशोधित किया है के रूप में हम वर्णन करेंगेयहाँ। महत्वपूर्ण बात है, क्लोरोप्लास्ट पौधों है कि 8 दिनों के लिए मानक Murashige और Skoog (एमएस) मध्यम अगर पर हो गई थी और फिर तरल एमएस माध्यम तनाव के साथ पूरक में स्थानांतरित कर, एक अपेक्षाकृत कम, नियंत्रित तनाव उपचार उपलब्ध कराने से अलग थे। उपज और इस तरह के तनाव का इलाज पौधों से अलग क्लोरोप्लास्ट की योग्यता विट्रो प्रोटीन आयात परख 3 में नीचे की ओर के साथ संगत कर रहे हैं। क्लोरोप्लास्ट अलगाव प्रोटोकॉल के अलावा, हम इन विट्रो प्रोटीन आयात, जो मजबूत साबित हो गया है और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है 3,9-12 के लिए हमारी दिनचर्या तरीका मौजूद है।
हमने हाल ही में पता चला है कि क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात सक्रिय रूप से तनाव है, जो क्लोरोप्लास्ट समारोह और संयंत्र अस्तित्व 3 के लिए महत्वपूर्ण है के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। कि अध्ययन में, इस तरह के नियमन पर नजर रखने के लिए, हम क्रम में तनाव की स्थिति के तहत बड़े पौधों के आयात क्षमता के आकलन के सक्षम करने के लिए हमारे क्लोरोप्लास्ट अलगाव और इन विट्रो आयात परख प्रक्रियाओं में संशोधित किया। परिणाम क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात नियमन में SP1 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत दिया।
परंपरागत इन विट्रो आयात assays मानक एमएस अगर मध्यम 6,17,18 पर बड़े पौधों का उपयोग करें। SP1 उत्परिवर्ती यहाँ वर्णित के मामले में, इस तरह के पारंपरिक assays के गुम्मट से 3 में प्रोटीन आयात रिश्तेदार कोई मतभेद का खुलासा नहीं किया। हालांकि, प्रोटीन आयात को विनियमित करने में SP1 की भूमिका स्पष्ट रूप से पता चला जब प्रोटीन आयात तनाव की स्थिति के तरीकों के साथ साथ वर्णित (चित्रा 1) का उपयोग कर के तहत मूल्यांकन किया जाता है। जबकि यह मीटरप्र सीधे नहीं है (जैसा कि तरीकों में क्रमश: तरल संस्कृति में और अगर मध्यम पर बड़े पौधों को रोजगार) पारंपरिक assays से प्राप्त उन लोगों के साथ तनाव की स्थिति परख से आयात डेटा की तुलना करने के लिए संभव हो सकता है, तनाव और गैर तनाव की स्थिति के बीच तुलना संभव है कि प्रदान की जाती हैं पौधों सब एक ही तरल संस्कृति के माध्यम में बड़े हो रहे हैं, के साथ या तनाव के बिना।
अगर मध्यम पर तनाव के उपचार के साथ तुलना में, तरल संस्कृति में इन विट्रो आयात assays के लिए आवश्यक पौधों की बड़ी संख्या के इलाज के लिए और अधिक सुविधाजनक है। इसके अलावा, यह सभी पौधों को तनाव है, जो अल्पकालिक तनाव उपचार के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है की वर्दी आवेदन की सुविधा। यहाँ प्रस्तुत विधि mannitol उपचार का उपयोग कर आसमाटिक तनाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है, लेकिन आसानी से अन्य तनाव की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, अल्पकालिक नमक तनाव और oxidative तनाव है, जिसके लिए इसी तनाव ख सकता है के लिएई इसी तरह तरल एमएस माध्यम के माध्यम से आवेदन किया। तनाव के अन्य प्रकारों के लिए, हम सुझाव है कि तनाव की डिग्री पहला अनुकूलित है; पीढ़ी गंभीर उपचार उपज और / या अलग-थलग अंगों के आयात क्षमता पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है।
प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम है जो एक के रूप में नीचे विस्तृत, विशेष ध्यान देना चाहिए रहे हैं।
(- 0.9%, w / वी 0.6) निर्माता के आधार पर एमएस माध्यम के लिए इष्टतम अगर एकाग्रता अलग कर सकते हैं। इस प्रकार, यह अनुभव से प्रयोगों के शुरू होने से पहले अगर एकाग्रता का अनुकूलन करने की सिफारिश की है। मध्यम बहुत नरम है कि यह कटाई कदम (कदम 1.9) पर ऊतक से चिपक नहीं होना चाहिए, न तो यह इतना कठिन है कि यह संयंत्र जड़ विकास को रोकता होना चाहिए। सुक्रोज एकाग्रता भी इस्तेमाल पौधों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। जब विशेष रूप से बीमार म्यूटेंट के साथ काम कर रहे हैं, एमएस मध्यम 2 के साथ पूरक – 3% (w / v) सुक्रोज पौधों बेहतर विकसित करने के लिए मदद मिल सकती है। जब एप्लिकेशनतनाव उपचार झूठ बोल रही है, यह तरल माध्यम (जैसे,> 14 दिन पुरानी है) करने के लिए बहुत पुराने पौधों के हस्तांतरण के लिए अच्छा नहीं है। इसका कारण यह है पुराने पौधों की जड़ों को और अधिक विकसित और अधिक आसानी से transferral के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं।
गेहूं के बीज के आधार पर उन लोगों के, और खरगोश reticulocyte उन पर आधारित: / प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली के संबंध में, वहाँ 2 प्रमुख प्रणालियों रहे हैं। ये किट ऐसे linearized plasmids, unlinearized plasmids, या पीसीआर उत्पादों के रूप में विभिन्न टेम्पलेट्स, उपयोग कर सकते हैं। किट भी T3, T7, और SP6 प्रमोटरों के लिए विशिष्ट हैं। ध्यान दें कि किट हम यहाँ की सिफारिश पीसीआर उत्पादों और T7 प्रमोटर के साथ उपयोग के लिए ही उपयुक्त है। हालांकि, अज्ञात कारणों के लिए, कुछ radiolabeled इस प्रणाली के साथ बनाया preproteins कुशलता से आयात परख में काम नहीं कर सकता; ऐसे मामलों में, एक एक गेहूं के बीज निकालने प्रणाली या एक reticulocyte lysate प्रणाली प्लाज्मिड टेम्पलेट्स के लिए बने कोशिश कर विचार कर सकते हैं। एक भी प्रतिलेखन / अनुवाद पुन के परिणाम में सुधार कर सकते हैंनिर्माता की पुस्तिका के अनुसार प्रतिक्रिया की स्थिति को संशोधित करके कार्रवाई की।
(या विकास कक्ष के प्रकाश चक्र में प्रारंभिक) के क्रम में प्रकाश संश्लेषण के कारण क्लोरोप्लास्ट, जो बरकरार अंगों के अलगाव बाधा कर सकते हैं अंदर स्टार्च के संचय से बचने के लिए यह सुबह में क्लोरोप्लास्ट अलगाव शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है। क्लोरोप्लास्ट अलगाव की प्रक्रिया के किसी भी अनावश्यक देरी के बिना जल्दी से किया जा सकता है, और अलग क्लोरोप्लास्ट हमेशा ठंडा रखा जाना चाहिए। इस अवलोकन कि क्लोरोप्लास्ट पृथक धीरे-धीरे उनकी व्यवहार्यता, जो अच्छी बात नहीं है खो देंगे खिलाफ कम करने के लिए है। नव thawed सीआईबी या एचएमएस बफर का उपयोग करते हैं, तो उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से बफर मिश्रण करने के लिए एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित हो। संयंत्र सामग्री के homogenization के लिए इष्टतम स्थितियों अनुभव से स्थापित किया गया है, और यदि एक अलग ऊतक homogenizer प्रयोग किया जाता है भिन्न हो सकते हैं।
विभिन्न संयंत्र जीनोटाइप simila होते हैंआर क्लोरोफिल के स्तर, क्लोरोफिल की मात्रा का ठहराव आयात assays आयोजित करने से पहले नमूनों को सामान्य करने के लिए एक वैकल्पिक मार्ग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। क्लोरोफिल spectrophotometrically 80% में पृथक क्लोरोप्लास्ट का एक नमूना की निकासी के बाद निर्धारित किया जा सकता है (वी / वी) जलीय एसीटोन 19,20। हालांकि, अगर पौधों का आयात दर अलग क्लोरोफिल सामग्री दिखा (जैसे, chlorotic phenotypes के साथ म्यूटेंट) की तुलना में जा रहे हैं, आयात assays में क्लोरोप्लास्ट नमूनों को सामान्य करने की गिनती क्लोरोप्लास्ट नंबर का उपयोग करें। यह अच्छी तरह से कदम 3.11 में क्लोरोप्लास्ट resuspend करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अपर्याप्त मेजबान क्लोरोप्लास्ट है, जो यह मुश्किल संख्या सही गिनती करने के लिए कर देगा का समुच्चय छोड़ दें और इस प्रकार आयात प्रतिक्रियाओं में सही लोडिंग में बाधा होगी सकता है। गंभीर एकत्रीकरण माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है (जैसे, समुच्चय के साथ> 10 क्लोरोप्लास्ट एक साथ शामिल), aggregat जब तक बर्फ पर क्लोरोप्लास्ट नमूना मिलाते जारीतों हटा रहे हैं। यह बफर की एक छोटी मात्रा में क्लोरोप्लास्ट resuspend करने के लिए आसान है।
यह जानते हैं कि प्रोटीन आयात प्रतिक्रियाओं (धारा 5) अपने रेडियोधर्मी स्वभाव की वजह से उचित सावधानियों के साथ आयोजित किया जाना चाहिए होना जरूरी है। आवश्यक सावधानियों में शामिल हैं:, डिस्पोजेबल दस्ताने, प्रयोगशाला कपड़े और सुरक्षा चश्मा पहने नजर रखे हुए है और काम की सतह और उपकरण decontaminating, और एक अनुमोदित अपशिष्ट कंटेनर में सभी रेडियोधर्मी कचरे के निपटान। यह भी ध्यान है कि सही आसमाटिक दबाव आयात प्रतिक्रियाओं के दौरान क्लोरोप्लास्ट की intactness को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है में रखने के लिए, और इस मुख्यतः एचएमएस बफर द्वारा बनाए रखा है। क्योंकि 10x एचएमएस चिपचिपा है, यह पहली बार आरटी को गरम किया जाना चाहिए, और फिर अच्छी तरह से मिला, और एक कट विंदुक टिप का उपयोग सटीक संस्करणों की माप सुनिश्चित करने के लिए आवेदन किया। आयात प्रतिक्रिया में, ठंड methionine असंबंधित chloropl में मुक्त radiolabeled methionine के समावेश को बाधित करने के लिए जोड़ा जाता हैऊष्मायन चरण के दौरान organellar अनुवाद के माध्यम से एएसटी प्रोटीन, जबकि बीएसए proteases लिए एक सब्सट्रेट के रूप में अभिनय से प्रोटियोलिसिस कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद से पी.जे. के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (बीबीएसआरसी, रेफरी अनुदान बी बी / K018442 / 1।)।
Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
phytoagar | Melford | P1003 | |
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
filter paper | Fisher | FB59023 | |
Percoll | Fisher | 10607095 | |
ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
MgATP | Sigma | A9187 | |
methionine | Sigma | M6039 | |
bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
SDS | Fisher | S/5200/53 | |
Tris Base | Melford | B2005 | |
dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |