Här beskriver vi en ny metod för att studera protein import till isolerade kloroplaster under stress. Metoden är snabb och enkel, och kan användas för att studera konsekvenserna av olika stressförhållanden för kloroplast protein import, och motsvarande regleringsmekanismer.
Kloroplaster är organeller med många viktiga roller i växter, som omfattar inte bara fotosyntes men många andra metabola och signalfunktioner. Vidare kloroplaster är kritiska för växt svar på olika abiotisk stress, såsom salthalt och osmotiska påkänningar. En kloroplast kan innehålla upp till ca 3000 olika proteiner, varav vissa kodas av sin egen arvsmassa. Dock är majoriteten av kloroplast proteiner kodas i kärnan och syntetiseras i cytosolen, och dessa proteiner måste importeras till kloroplasten genom translocons på kloroplasten kuvert membran. Nyligen genomförda studier har visat att kloroplast proteinimport kan aktivt regleras av stress. För att biokemiskt undersöka en sådan reglering av protein import under stressförhållanden, utvecklade vi den metod som beskrivs här som en snabb och enkel procedur som lätt kan uppnås i alla laboratorier. I denna metod är växter som odlas under normala conditions och sedan utsätts för stress villkor i flytande kultur. Växtmaterial uppsamlas, och kloroplaster frigörs sedan genom homogenisering. Den råa homogenatet separeras genom densitetsgradientcentrifugering, vilket möjliggör isolering av intakta kloroplaster. Kloroplast avkastning bedöms genom att räkna, och kloroplast intactness kontrolleras under ett mikroskop. För proteinimportanalyser, är renade kloroplaster inkuberas med 35 S radiomärkt i prekursor vitro översatt proteiner, och tidsförlopp experiment genomförs för att möjliggöra jämförelser av importhastigheter mellan genotyper under stressförhållanden. Vi presenterar data som genereras med denna metod som visar att graden av protein import till kloroplaster från en reglerande mutant specifikt ändras enligt osmotiska stressförhållanden.
Kloroplaster är mycket rikligt organ som finns i de gröna vävnader av växter. De är kända för sin avgörande roll i fotosyntesen, en process som använder ljusenergi för att omvandla koldioxid till socker och därigenom stödja nästan allt liv på jorden 1. Dessutom kloroplaster (och bredare familj av relaterade organ kallas plastider) spela många andra viktiga roller i växter, inklusive biosyntesen av aminosyror, lipider, pigment, och avkänning av signaler från omgivningen, såsom gravitation och patogen utmaning. Fotosyntes genererar reaktiva syreradikaler (ROS) som biprodukter, vilka under vissa omständigheter har användbara roller, men om överproduceras kan orsaka skadliga eller till och med dödliga effekter. Överproduktion av ROS är särskilt främjas av ogynnsamma miljöförhållanden, och därmed kloroplaster är nära knutna till svar på abiotisk stress, såsom salthalt och osmotiska påkänningar 2.
Chloroplasts har en komplex struktur. Varje kloroplast är omgivet av ett dubbelmembran yttre skikt kallas kuvertet, som består av yttre och inre membran. Internt finns det en annan membransystem kallas tylakoider, där ljusreaktioner i fotosyntesen sker. Mellan de två membransystem finns det en vattenhaltig kammare samtal stroman, som är involverat i kol fixering. En kloroplast kan innehålla upp till ~ 3000 olika proteiner, och de allra flesta av dessa proteiner syntetiseras i cytosolen i prekursorform och måste importeras till organell genom särskilda protein translocons i kuvertet membranen 1. Intressant nog har senaste arbete indikerat att kloroplast protein import aktivt regleras, och så kan utöva en betydande grad av kontroll över kloroplasten proteom. Till exempel, rapporterades det i 2015 att protein import kan svara på abiotisk stress genom direkt reglering av överflödet av the translocon vid den yttre membranhöljet av kloroplaster (TOC) vid ubiquitin-proteasom-systemet 3.
Med hjälp av renade kloroplaster och prekursor vitro syntetiserade proteiner, kan protein import beredas in vitro 4,5. Således kan in vitro-metoder kan användas för att bedöma andelen import i olika muterade växter 6, vilket har varit ett kritiskt förhållningssätt för analys av förmodade komponenter av proteinet import maskiner och för att upptäcka mekanismerna bakom protein import och dess reglering. Dessutom kan kloroplaster behandlas med ytterligare fraktionering eller proteas matsmältningen, efter in vitro import, vilket kan underlätta studier av sub-organeller lokalisering och topologi av kloroplast proteiner 7,8.
För att studera regleringen av protein import av stress, har vi ändrat vår rutin kloroplast isoleringsmetod som vi kommer att beskrivahär. Viktigt var kloroplaster isolerade från växter som hade odlats på standard Murashige och Skoog (MS) agarmedium under 8 dagar och sedan överförts i flytande MS-medium kompletterat med stress, vilket ger en relativt kort, kontrollerad stress behandling. Utbytet och kompetens kloroplaster isolerade från dessa stressbehandlade plantor är kompatibla med den nedströms in vitro protein import analys 3. Förutom kloroplasten isolering protokoll presenterar vi vår rutinmetod för in vitro-protein import, som har visat sig vara robust och används ofta 3,9-12.
Vi visade nyligen att kloroplast protein import kan aktivt regleras av stress, vilket är avgörande för kloroplast funktion och växt överlevnad tre. I denna studie, att övervaka en sådan reglering, ändrade vi vår kloroplast isolering och import analys vitro förfaranden för att möjliggöra en bedömning av importkapacitet av växter som odlas under stressförhållanden. Resultaten visade en viktig roll för SP1 i kloroplast protein import förordningen.
Konventionella in vitro import analyser använda växter som odlas på standard MS agarmedium 6,17,18. I fallet med sp1 mutanten som beskrivs här, hade sådana konventionella analyser inte avslöja några skillnader i protein import i förhållande till WT 3. Dock är betydelsen av SP1 i regleringen protein import klart avslöjas när protein import bedöms under stressförhållanden med användning av de metoder som beskrivs häri (Figur 1). Även om det justay inte vara möjligt att direkt jämföra importera data från stressförhållanden analysen med de som erhållits från konventionella analyser (såsom de metoder utnyttjar växter som odlas i flytande kultur och på agarmedium, respektive), jämförelser mellan stress och icke-stressförhållanden är möjliga under förutsättning att växterna alla odlas i samma flytande odlingsmedium, med eller utan stressfaktorer.
Jämfört med stress behandling på agarmedium, är vätskekultur mer bekvämt för behandling av det stora antalet växter som behövs för in vitro import analyser. Dessutom underlättar det en enhetlig tillämpning av stress till alla växter, vilket är särskilt viktigt för kortfristiga spännings behandlingar. Den metod som presenteras här har tillämpats för att studera den osmotiska stressen med hjälp av mannitol behandling, men skulle lätt kunna anpassas till ett brett spektrum av andra stressfaktorer, t ex kortsiktiga salt stress och oxidativ stress, för vilken motsvarande stress kunde be tillämpas på samma sätt via flytande MS-medium. För andra typer av påfrestningar, föreslår vi graden av stress först optimeras; alltför svåra behandlingar kan ha negativa effekter på avkastning och / eller import kompetens isolerade organeller.
Det finns flera viktiga steg i protokollet som man bör ägna särskild uppmärksamhet, som beskrivs nedan.
Den optimala agarkoncentration för MS-medium kan skilja (0,6-0,9%, vikt / volym) beroende på tillverkare. Således, är det rekommenderat att empiriskt optimera agarkoncentration innan du börjar experiment. Mediet bör inte vara så mjuk att den håller sig till vävnaden vid skörd steg (steg 1,9), inte heller ska det vara så svårt att det hämmar växten rotutveckling. Sackaroskoncentrationen kan också justeras i enlighet med de växter som används. När man arbetar med speciellt sjuka mutanter, MS-medium kompletterat med 2-3% (vikt / volym) sackaros kan hjälpa växterna att växa bättre. när appenliggande spännings behandlingar, är det inte bra att överföra mycket gamla växter för att det flytande mediet (t ex,> 14 dagar gammal). Detta beror på att de mer utvecklade rötter äldre anläggningar är lättare skadad under överföring.
När det gäller transkriptionen / translationssystemet, det finns 2 stora system: de som är baserade på vetegroddar, och de som är baserade på kaninretikulocyt. Dessa kit kan använda olika mallar, såsom arise plasmider, unlinearized plasmider eller PCR-produkter. Kit är också specifika för T3, T7 och SP6 initiativtagare. Observera att satsen vi rekommenderar här är endast avsedd för användning tillsammans med PCR-produkter och T7-promotorn. Men av okänd anledning, en del radiomärkta preproteins gjorda med detta system kan inte fungera effektivt i import analys; i sådana fall kan man överväga att prova en vetegroddsextrakt system eller ett retikulocytlysat-system avsett för plasmid mallar. Man kan också förbättra resultatet av transkription / translation reverkan genom modifiering av reaktionsbetingelserna enligt tillverkarens instruktionsbok.
Det är viktigt att börja kloroplast isolering tidigt på morgonen (eller tidigt på ljuscykel av odlingskammaren) för att undvika ansamling av stärkelse inne i kloroplasterna till följd av fotosyntesen, som kan hindra isolering av intakta organeller. Kloroplasten isoleringsförfarandet måste göras snabbt utan onödiga förseningar, och isolerade kloroplasterna måste alltid förvaras kallt. Detta är att mildra effekterna av observationen att isolerade kloroplaster kommer gradvis att förlora sin livskraft, vilket inte är bra. Om du använder nyligen tinade CIB eller HMS buffert, vara noga med att blanda bufferten väl före användning för att erhålla en homogen lösning. De optimala betingelserna för homogenisering av växtmaterial har fastställts empiriskt, och kan variera om en annan vävnadshomogenisator användes.
Om de olika växt genotyper innehåller Similar klorofyllnivåer, kan klorofyll kvantifiering användas som ett alternativt sätt att normalisera proverna innan de utför import analyser. Klorofyll kan bestämmas spektrofotometriskt efter extraktion av ett prov av de isolerade kloroplaster i 80% (vol / vol) vattenlösning av aceton 19,20. Men om import andelen växter som visar olika klorofyllinnehåll (t.ex. mutanter med chlorotic fenotyper) skall jämföras, använd kloroplast antal räknar att normalisera kloroplasten prover i import analyser. Det är särskilt viktigt att resuspendera kloroplaster grundligt i steg 3,11. Otillräcklig resuspension kan lämna aggregat av kloroplaster, som gör det svårt att räkna siffror korrekt och därmed kommer att hindra korrekt belastning i importreaktioner. Om svår aggregering ses under mikroskop (t.ex. aggregat med> 10 kloroplast sammanfogas) fortsätter att skaka kloroplasten provet på is tills aggregates avlägsnas. Det är lättare att resuspendera kloroplaster i en mindre volym av buffert.
Det är viktigt att vara medveten om att proteinimport reaktioner (§ 5) måste utföras med lämpliga försiktighetsåtgärder på grund av deras radioaktiva natur. Nödvändiga försiktighetsåtgärder inkluderar: bär engångshandskar, laboratorie kläder och skyddsglasögon, övervakning och dekontaminering arbetsyta och utrustning, och ta hand om allt radioaktivt avfall i en godkänd avfallsbehållare. Tänk också på att rätt osmotiska trycket är avgörande för att upprätthålla intactness av kloroplaster under import reaktioner, och det är främst upprätthålls av HMS buffert. Eftersom 10x HMS är trögflytande, bör det först värmas upp till RT, och sedan blandas ordentligt, och appliceras med ett snitt pipettspets för att säkerställa mätning av exakta volymer. I import reaktionen kall metionin adderad för att hämma inkorporering av fri radiomärkt metionin till orelaterade chloroplAST proteiner genom organeller översättning under inkubationssteget, medan BSA används för att minimera proteolys genom att fungera som ett substrat för proteaser.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag till PJ från bioteknik och Biological Sciences Research Council (BBSRC, bevilja ref BB / K018442 / 1.).
Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
phytoagar | Melford | P1003 | |
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
filter paper | Fisher | FB59023 | |
Percoll | Fisher | 10607095 | |
ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
MgATP | Sigma | A9187 | |
methionine | Sigma | M6039 | |
bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
SDS | Fisher | S/5200/53 | |
Tris Base | Melford | B2005 | |
dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |