Her beskriver vi en ny metode for å studere protein import til isolerte kloroplaster under stress. Metoden er hurtig og enkel, og kan brukes til å studere konsekvensene av forskjellige stressbetingelser for kloroplast protein innførsel, og de tilsvarende reguleringsmekanismer.
Kloroplaster er organeller med mange viktige roller i planter, som inkluderer ikke bare fotosyntesen, men en rekke andre metabolske og signaleringsfunksjoner. Videre kloroplaster er kritisk for plante responser på ulike abiotiske påkjenninger, så som saltholdighet og osmotiske belastninger. En kloroplast kan inneholde opp til ~ 3000 forskjellige proteiner, hvorav noen er kodet for av sin egen genom. Imidlertid er de fleste av chloroplast proteiner kodet i kjernen og syntetisert i cytosol, og disse proteinene må importeres til kloroplast gjennom translocons på chloroplast konvolutt membraner. Nyere studier har vist at proteinet kloroplast innførsel kan være aktivt regulert av spenning. For å undersøke biokjemisk slik regulering av protein innførsel i henhold til stressbetingelser, har vi utviklet fremgangsmåten beskrevet her som en enkel og rask fremgangsmåte som lett kan oppnås i en hvilken som helst laboratorium. I denne metoden, er plantene dyrkes under normal conditions og deretter utsatt for stressbetingelser i flytende kultur. Plantemateriale samles, og kloroplaster blir så frigjort ved homogenisering. Det urene Homogenatet separeres ved tetthetsgradient sentrifugering, slik at isolering av de intakte kloroplaster. Kloroplast utbytte vurderes av telling, og kloroplast intactness blir kontrollert under et mikroskop. For protein import analysene er renset kloroplaster inkubert med 35 S radiomerket in vitro oversatt forløper proteiner, og tidsforløpet eksperimenter er utført for å muliggjøre sammenligninger av importprisene mellom genotyper under stress forhold. Vi presenterer data generert ved hjelp av denne metoden, som viser at frekvensen av protein import til kloroplaster fra et regulatorisk mutant er spesielt forandret etter osmotiske stress forhold.
Kloroplaster er svært rikelig organeller som finnes i grønne vev av planter. De er kjent for sin kritiske rolle i fotosyntesen, en prosess som bruker lys energi å omdanne karbondioksid til sukker og dermed støtter nesten alt liv på jorden en. I tillegg kloroplaster (og den bredere familie av relaterte organeller som kalles plas) spiller mange andre viktige roller i planter, inkludert biosyntesen av aminosyrer, lipider, pigmenter, og sensing av miljømessige signaler slik som tyngdekraften og patogen utfordring. Fotosyntese genererer reaktive oksygenarter (ROS) som biprodukter, som under visse omstendigheter har nyttige roller, men hvis overprodusert kan forårsake skadelige eller til og med letale effekter. Overproduksjon av ROS er spesielt fremmet av ugunstige miljøforhold, og dermed kloroplaster er nært knyttet til tiltak mot abiotiske påkjenninger, som for eksempel saltholdighet og osmotiske påkjenninger 2.
Chloroplasts ha en kompleks struktur. Hver kloroplast er omgitt av en dobbelt membran ytre lag som kalles konvolutten, som består av ytre og indre membraner. Internt er det en annen membransystem kalt thylakoids, der lyset reaksjoner av fotosyntesen foregår. Mellom de to membransystemer er det et vandig rom anrop stroma, som er involvert i karbon fiksering. En kloroplast kan inneholde opp til ~ 3000 ulike proteiner, og de aller fleste av disse proteinene er syntetisert i cytosol i forløperen form og må importeres til organeller gjennom dedikerte protein translocons i konvolutten membraner 1. Interessant nok har senere arbeid indikerte at kloroplast protein innførsel blir aktivt regulert, og det er i stand til å utøve en viktig grad av kontroll over kloroplasten proteome. For eksempel ble det rapportert i 2015 at protein import kan svare på abiotiske stress gjennom direkte regulering av overflod av the translocon på den ytre konvolutt membran av kloroplastene (TOC) av ubiquitin-proteasome system 3.
Ved hjelp av renset kloroplaster og in vitro syntetisert forløper proteiner, kan protein import rekonstitueres in vitro 4,5. Dermed kan in vitro metoder brukes til å vurdere satsene for import i ulike muterte planter 6, som har vært en kritisk tilnærming for analyse av antatte komponenter av protein import maskiner og for å oppdage de mekanismene bak protein import og regulering. Videre kan kloroplaster bli behandlet med ytterligere fraksjonering eller protease fordøyelsen, etter in vitro import, som kan legge til rette for studier på sub-organellar lokalisering og topologi av chloroplast proteiner 7,8.
For å studere regulering av protein import av stress, har vi endret vår rutine kloroplast isolasjonsmetoden som vi vil beskriveher. Viktigere, kloroplaster ble isolert fra planter som var blitt dyrket på standard Murashige og Skoog (MS) agar medium i 8 dager og deretter overført til flytende MS-medium supplert med stressfaktor, noe som gir en forholdsvis kort, kontrollert spenning behandling. Utbyttet og kompetanse i kloroplaster isolert fra slike stress behandlet planter er kompatible med nedstrøms in vitro protein import analysen tre. I tillegg til kloroplasten isolasjonsprotokoll, gjennomgår vi rutinemetode for in vitro protein import, noe som har vist seg å være robust, og er mye brukt 3,9-12.
Vi har nylig viste at kloroplast protein import kan være aktivt regulert av stress, noe som er avgjørende for kloroplast funksjon og plante overlevelse tre. I den studien, for å overvåke en slik regulering, endret vi vår kloroplast isolasjon og in vitro import analyseprosedyrer for å muliggjøre vurdering av importkapasiteten av planter dyrket under stress forhold. Resultatene indikerte en viktig rolle for SP1 i kloroplast protein import regulering.
Konvensjonelle in vitro import analyser bruke planter dyrket på standard MS agar medium 6,17,18. I tilfellet med den SP1 mutant som er beskrevet her, har slike konvensjonelle analyser avslørte ingen forskjeller i protein innførsel i forhold til WT 3. Imidlertid er rollen til SP1 i å regulere protein import klart frem når protein import vurderes under stress forhold ved hjelp av metodene beskrevet her (figur 1). Mens det may ikke være mulig å direkte sammenligne importere data fra den spenningsforholdene analysen med de som oppnås fra konvensjonelle analyser (som metodene anvender planter dyrket i flytende kultur og på agar medium, henholdsvis), sammenligninger mellom stress og ikke-spenningstilstander er mulige forutsatt at plantene er alle dyrket i det samme flytende kulturmedium, med eller uten stressfaktorer.
Sammenlignet med stress-behandling på agar medium, i flytende kultur mer praktisk for behandling av et stort antall planter som trengs for in vitro import analyser. Videre er det letter ensartet anvendelse av stressor til alle planter, noe som er spesielt viktig for kortsiktige stressbehandlinger. Metoden som presenteres her er blitt anvendt for å studere den osmotisk stress ved hjelp av mannitol behandling, men kan lett tilpasses et bredt spekter av andre påkjenninger; for eksempel, kortsiktige salt stress og oksidativt stress, for hvilke de tilsvarende stressfaktorer kunne be tilsvar søkt via flytende MS medium. For andre typer påkjenninger, foreslår vi graden av stress er første optimalisert; altfor alvorlige behandlinger kan ha negative effekter på utbytte og / eller import kompetanse av de isolerte organeller.
Det er flere viktige skritt i protokollen til som man bør være spesielt oppmerksom, som beskrevet nedenfor.
Den optimale agar konsentrasjonen for MS-mediet kan variere (0,6 til 0,9%, vekt / volum), avhengig av produsenten. Dermed er det anbefalt å empirisk optimalisere agar konsentrasjon før du begynner eksperimenter. Mediet bør ikke være så myk at den fester seg til vevet ved høstingssteget (trinn 1.9), heller ikke bør det være så hardt at det hemmer plante rotutvikling. Sukrosekonsentrasjonen kan også justeres i henhold til de plantene som brukes. Når det arbeides med meget syke mutanter, MS-medium supplert med 2 – 3% (vekt / volum) sukrose kan bidra til plantene å vokse bedre. når appliggende spennings behandlinger, er det ikke godt å overføre meget gamle planter til det flytende medium (for eksempel> 14 dager gammel). Dette er fordi de mer utviklede røtter eldre anlegg er lettere skadet under overføring.
Med hensyn til transkripsjons / translasjonssystem, er det 2 store systemer: de som er basert på hvetespirer, og de som er basert på kanin retikulocytt. Disse pakkene kan bruke forskjellige maler, for eksempel linearisert plasmider, unlinearized plasmider eller PCR-produkter. Pakkene er også spesifikk for T3, T7 og SP6 arrangører. Legg merke til at settet vi anbefale her er bare egnet for bruk med PCR-produkter og T7-promoter. Men av ukjente grunner, noen radiomerkede preproteiner gjort med dette systemet kan ikke fungere effektivt i import analysen; I slike tilfeller kan man vurdere å prøve en hvetekim ekstrakt system eller et retikulocyttlysat system ment for plasmidtemplater. Man kan også forbedre resultat av transkripsjon / translasjon rehandling ved å endre reaksjonsbetingelsene i henhold til produsentens håndbok.
Det er viktig å starte kloroplast isolasjon tidlig på morgenen (eller tidlig i lys syklus av vekstkammeret), for å unngå opphopning av stivelse inne kloroplastene på grunn av fotosyntesen, som kan hindre isolering av intakte organeller. Kloroplast isoleringsprosedyren må gjøres raskt uten unødvendige forsinkelser, og de isolerte kloroplaster må alltid holdes kaldt. Dette er for å redusere mot den observasjon at isolerte kloroplastene vil gradvis miste sin levedyktighet, som ikke er bra. Hvis du bruker nylig tint CIB eller HMS buffer, sørg for å blande buffer godt før bruk for å oppnå en homogen løsning. De optimale betingelser for homogenisering av plantemateriale er etablert empirisk, og kan variere hvis en annen vevshomogenisator anvendes.
Hvis de forskjellige plante genotyper inneholde Similär klorofyllnivåer, kan klorofyll kvantifisering brukes som en alternativ måte for å normalisere prøvene før gjennomføringen av import analyser. Klorofyll kan bestemmes spektrofotometrisk etter ekstraksjon av en prøve av de isolerte kloroplastene i 80% (v / v) vandig aceton 19,20. Men hvis importprisene på planter som viser ulike klorofyllinnhold (f.eks mutanter med anemiske fenotyper) skal sammenlignes, bruke kloroplast nummer telle til normal kloroplast prøver i import analyser. Det er spesielt viktig å resuspendere kloroplaster grundig i trinn 3.11. Utilstrekkelig resuspensjon kan forlate aggregater av kloroplaster, som vil gjøre det vanskelig å telle tall nøyaktig og dermed vil hindre riktig lasting i import reaksjoner. Hvis alvorlig aggregering er sett under mikroskop (f.eks aggregater med> 10 kloroplast sammenføyd), fortsette å riste kloroplast prøven på is inntil aggregates fjernes. Det er lettere å resuspendere kloroplaster i et mindre volum av buffer.
Det er viktig å være klar over at protein import reaksjoner (§ 5) skal utføres med nødvendige forholdsregler på grunn av deres radioaktive natur. Nødvendige forholdsregler inkluderer: iført engangshansker, laboratorieklær og vernebriller, overvåking og dekontaminering arbeidsflaten og utstyr, og avhending av alt radioaktivt avfall i en godkjent avfallsbeholder. Også huske på at riktig osmotisk trykk er avgjørende for å opprettholde intactness av kloroplaster under import reaksjoner, og dette er hovedsakelig vedlikeholdes av HMS buffer. Fordi 10x HMS er tyktflytende, bør den først varmes opp til romtemperatur, og deretter grundig blandet, og påføres med et kutt pipette for å sikre måling av nøyaktige volumer. I import reaksjon blir kaldt metionin tilsettes for å hindre innblanding av gratis radiomerket metionin i urelaterte chloroplAST-proteiner gjennom organellar oversettelse under inkuberingstrinnet, mens BSA blir brukt for å minimalisere proteolyse ved å virke som et substrat for proteaser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend til PJ fra Bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC; gi dommeren BB / K018442 / 1.).
Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
phytoagar | Melford | P1003 | |
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
filter paper | Fisher | FB59023 | |
Percoll | Fisher | 10607095 | |
ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
MgATP | Sigma | A9187 | |
methionine | Sigma | M6039 | |
bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
SDS | Fisher | S/5200/53 | |
Tris Base | Melford | B2005 | |
dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |