Summary
Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour étudier l'importation de protéines dans les chloroplastes isolés sous contrainte. La méthode est simple et rapide, et peut être appliqué pour étudier les conséquences des différentes conditions de stress pour les protéines de chloroplaste importation, et les mécanismes de régulation correspondants.
Abstract
Les chloroplastes sont des organites avec de nombreux rôles essentiels dans les plantes, qui comprennent non seulement la photosynthèse, mais de nombreuses autres fonctions métaboliques et de signalisation. En outre, les chloroplastes sont critiques pour les réponses des plantes à divers stress abiotiques, tels que la salinité et les contraintes osmotiques. Un chloroplaste peut contenir jusqu'à environ 3000 protéines différentes, dont certaines sont codées par son propre génome. Cependant, la majorité des protéines de chloroplaste sont codées dans le noyau et synthétisée dans le cytosol, et ces protéines doivent être importées dans le chloroplaste par translocons au niveau des membranes d'enveloppe de chloroplaste. Des études récentes ont montré que l'importation de protéines de chloroplaste peut être régulée activement par le stress. Pour étudier biochimiquement une telle réglementation de l'importation de protéines dans des conditions de stress, nous avons développé la méthode décrite ici comme une procédure simple et rapide qui peut facilement être réalisé dans tout laboratoire. Dans ce procédé, des plantes sont cultivées en condition normalens et ensuite exposés à des conditions de stress dans une culture liquide. Le matériel végétal est recueilli, et les chloroplastes sont ensuite libéré par homogénéisation. L'homogénat brut est séparé par centrifugation à gradient de densité, ce qui permet l'isolement des chloroplastes intacts. rendement chloroplaste est évaluée par comptage et intégrité chloroplaste est vérifiée sous un microscope. Pour les essais d'importation de protéines, les chloroplastes purifiés sont incubés avec 35 S radiomarqué dans les protéines précurseurs traduites in vitro, et des expériences de temps cours sont menées afin de permettre les comparaisons des taux d'importation entre les génotypes dans des conditions de stress. Nous présentons des données générées en utilisant cette méthode, qui montrent que le taux de l'importation de protéines dans les chloroplastes d'un mutant réglementaire est spécifiquement modifié dans des conditions de stress osmotique.
Introduction
Les chloroplastes sont des organites très abondantes qui existent dans les tissus verts de plantes. Ils sont bien connus pour leur rôle essentiel dans la photosynthèse, un processus qui utilise l' énergie lumineuse pour convertir le dioxyde de carbone en sucre et donc soutenir presque toute la vie sur terre 1. En outre, des chloroplastes (et la famille plus large des organites appelés liés plastides) jouent d'autres rôles essentiels dans les plantes, y compris la biosynthèse des acides aminés, des lipides, des pigments et de la détection des signaux environnementaux tels que la gravité et le défi de l'agent pathogène. Photosynthèse génère des espèces réactives de l'oxygène (ROS) comme sous-produits, qui, dans certaines circonstances ont des rôles utiles, mais si surproduit peut entraîner des effets néfastes, voire mortelles. La surproduction de ROS est particulièrement favorisée par des conditions environnementales défavorables, et donc chloroplastes sont étroitement liées aux réponses aux stress abiotiques, tels que la salinité et le stress osmotique 2.
Chloroplasts ont une structure complexe. Chaque chloroplaste est entourée d'une couche externe à double membrane appelée l'enveloppe, qui se compose de membranes externes et internes. En interne, il y a un autre système de membrane appelée les thylakoïdes, où les réactions légères de la photosynthèse ont lieu. Entre les deux systèmes de membranes il y a un appel compartiment aqueux du stroma, qui est impliqué dans la fixation du carbone. Un chloroplaste peut contenir jusqu'à ~ 3000 protéines différentes, et la grande majorité de ces protéines sont synthétisées dans le cytosol sous forme de précurseur et doivent être importés dans l'organite par translocons protéiques dédiés dans les membranes de l' enveloppe 1. Fait intéressant, des travaux récents ont montré que la protéine de chloroplaste importation est réglementée activement, et est donc en mesure d'exercer un important niveau de contrôle sur le protéome chloroplaste. Par exemple, il a été signalé en 2015 que l'importation de protéines peut répondre au stress abiotique par la réglementation directe de l'abondance des ee translocation à la membrane des chloroplastes enveloppe extérieure (TOC) par le système ubiquitine-protéasome 3.
Purifiés en utilisant des chloroplastes et des protéines précurseurs synthétisés in vitro, l' importation de protéines peut être reconstitué in vitro 4,5. Ainsi, les méthodes in vitro peuvent être utilisés pour évaluer les taux d'importation dans les différentes plantes mutantes 6, qui a été une approche critique pour l'analyse des composants putatifs de la machine à l'importation de protéines et pour découvrir les mécanismes sous - jacents l' importation de protéines et de sa réglementation. En outre, des chloroplastes peuvent être traitées avec un fractionnement supplémentaire ou digestion par protease, après l' importation in vitro, ce qui peut faciliter les études sur la localisation sub-organites et la topologie des protéines de chloroplaste 7,8.
Pour étudier la régulation de l'importation de protéines par le stress, nous avons modifié notre méthode d'isolement de chloroplaste de routine que nous allons décrireici. Surtout, les chloroplastes ont été isolés à partir de plantes qui ont été cultivées sur un milieu de Murashige standard et Skoog (MS) gélosé pendant 8 jours puis transférés dans un milieu MS liquide supplémenté avec facteur de stress, fournissant un temps relativement court, le traitement du stress contrôlé. Le rendement et la capacité de chloroplastes isolés à partir de ces plantes au stress traitées sont compatibles avec l'aval dans l' importation de protéines in vitro dosage 3. En plus du protocole d'isolement chloroplaste, nous présentons notre méthode de routine pour in vitro l' importation de protéines, qui a prouvé être robuste et est largement utilisé 3,9-12.
Protocol
1. Croissance des plantes d'Arabidopsis et le traitement du stress
- Préparer 1 litre de milieu de Murashige et Skoog (MS) en y ajoutant 4,3 g de sel MS baso mélange, 10 g de saccharose, 0,5 g de 2- (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) à l'eau déminéralisée jusqu'à 1 litre et ajuster le pH à 5,7 avec de l'hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter 6 g de phytoagar et autoclave pendant 20 min à 120 ° C.
- Avant solidification, verser le milieu dans des plaques rondes de Pétri (diamètre 9 cm, hauteur 1,5 cm, avec 20-25 moyen par plaque MS mL). Laisser les plaques sécher pendant environ 1 h dans une hotte à flux laminaire avant de fermer les paupières.
- Placer les graines d' Arabidopsis thaliana dans un tube à essai 1,5 ml de stérilisation de la surface par addition de 1 ml de 70% (v / v) d' éthanol contenant 0,02% (v / v) de Triton X-100 et en agitant de façon continue pendant 5-10 min. Pour chaque génotype / état, préparer 10 boîtes de Petri transportant chacun environ 100 - 150 Plants.
- Attendez environ 10 s jusqu'à ce que les graines se déposent aufond du tube, puis jeter le surnageant par pipetage. Ajouter 1 ml d'éthanol 100%, et agiter à nouveau le tube pendant 10 min.
- Préparer la hotte à flux laminaire, tandis que les graines sont stérilisant. Prenez un morceau de papier filtre par échantillon, le plier en deux pour faciliter le semis, et le tremper dans 100% d'éthanol dans la hotte. Attendez jusqu'à ce qu'il sèche complètement. A noter que 100% de l'éthanol est utilisé comme une évaporation plus rapide que 70% d'éthanol.
- Transférer les graines sur le papier filtre par pipetage en utilisant un 1 mL pointe de pipette coupé ~ 5 mm de la belle fin. Laissez-les sécher, ce qui devrait prendre environ 10 - 15 min.
- Semez ~ 100 - 150 graines stérilisées uniformément sur chaque plaque MS milieu Petri, et sceller chaque plaque avec du ruban adhésif chirurgical.
- Stocker les plaques à l'envers à 4 ° C pendant 2 - 4 d à encourager et à synchroniser la germination. Old semences peuvent avoir besoin de rester plus longtemps (jusqu'à une semaine) à 4 ° C.
- Transférer les plaques dans une chambre de culture de tissus végétaux et de les laisser à l'envers vers le haut.Cultiver les plantes pour 8 d dans un cycle long jour (16 h 100 pmol · m - 2 · s - 1 lumière, 8 h d' obscurité) à 20 ° C.
- Pour le traitement du stress, lorsque les plantes sont 8 d vieux, dans la hotte à flux, les transférer à partir du milieu d' agar, en les grattant doucement à la main avec des gants d'éthanol-stérilisée, dans un flacon stérile de milieu MS liquide contenant le stresseur (par exemple , 200 mM de mannitol). Évitez de transporter sur un milieu d'agar. Couvrir la bouche du ballon avec du papier stérilisée et permettent aux plantes de croître dans les mêmes conditions que dans l'étape 1.8 pour un montant supplémentaire de 2 d sur un agitateur orbital avec agitation douce (~ 100 rpm).
2. Faire une protéine Precursor par In Vitro Transcription / Traduction
Note: Ce protocole suppose l'utilisation d'Arabidopsis photosystème I sous-unité précurseur D (pPsaD) comme modèle / préprotéine, mais la méthode est compatible avec les autres.
NOTE: Toutes ces étapes utilisent des techniques moléculaires standards de clonage.
Attention: Porter des gants, des vêtements de laboratoire et de verre de sécuritéSES lors de la manipulation des matières radioactives. Surveiller et décontaminer la surface de travail et de l'équipement. Éliminer tous les déchets radioactifs dans un conteneur à déchets approuvé.
3. Isolation chloroplaste
- Préparer les solutions mères suivantes:
- Préparer l'isolement chloroplaste tampon (CIB, 2x): sorbitol 0,6 M, chlorure de magnésium 10 mM(MgCl 2), mM d' éthylène 10 glycol tétraacétique (EGTA), l' acide éthylènediaminetétraacétique 10 mM (EDTA), du bicarbonate de sodium 20 mM (NaHCO 3), 40 mM d' acide 4- (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) ; ajuster le pH à 8,0 avec du KOH. Préparer 2 L de 2x CIB, faire aliquotes et les conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme, ou à 4 ° C pour le stockage à court terme. Pour 1x CIB, diluer le 2x CIB 1: 1 avec de l'eau distillée; ceci peut être préparée fraîchement le jour de l'expérience d'isolement chloroplaste.
- Préparer HEPES MgSO4 tampon Sorbitol (HMS, 1x): HEPES 50 mM, 3 mM de sulfate de magnésium (MgSO4), 0,3 M de sorbitol; ajuster le pH à 8,0 avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH). Préparer 400 ml de tampon, faire aliquotes et les conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme, ou à 4 ° C pour le stockage à court terme.
- Effectuer toutes les procédures suivantes dans la chambre froide ou sur la glace. Prérefroidissement toutes les solutions, appareils, équipements et rotors avant starting.
- Préparer un gradient continu de densité par mélange de 13 ml de Percoll, 13 ml de tampon 2x BFI, et 5 mg de glutathion dans un tube de 50 ml de centrifugation et en centrifugeant le mélange à 43000 g pendant 30 min (desserrage du frein) à 4 ° C. Après centrifugation, gérer le tube avec précaution afin d'éviter de perturber le gradient et le garder sur la glace pour une utilisation ultérieure.
- Transfert 100 ml de 1x CIB par génotype / condition à un bécher de 1 L.
- Retirez les semis du milieu liquide en les inclinant dans une passoire, et de les transférer dans un autre bêcher contenant CIB; puis, rincer le tissu avec la CIB pour éliminer tout milieu liquide résiduel avant de le remplacer avec 100 ml de CIB frais.
- Pour l'homogénéisation, utiliser un total de 100 ml de 1x CIB par échantillon en cinq manches consécutives d'homogénéisation, chaque tour en utilisant 20 ml de CIB fraîche tenue dans un bécher de 50 ml.
- Pour le premier tour de l'homogénéisation, transférer le tissu végétal dans le bécher de 50 mL à la main, ce qui permet latampon de maintien précédente pour drainer à travers vos doigts. Essayez d'utiliser la plupart des tissus dans le premier tour, mais assurez-vous qu'il est immergé avec un tampon; si cela est possible, d'introduire le tissu utilisé restant au second tour.
- Placer la sonde du dispositif d'homogénéisation de tissu dans le tissu et homogénéiser à l'aide de deux impulsions de 1 - 2 s chacune. Filtrez l'homogénat à travers deux couches de tissu de filtration dans un ml tube de 250 centrifugeuse par compression douce. Conserver le filtrat, et transférer le tissu vers le bécher de 50 mL.
- Placez une seconde 20 ml CIB aliquote dans le bécher de 50 mL, en ajoutant tout tissu restant non utilisé dans le premier tour de l'homogénéisation, et répéter l'homogénéisation et de filtration étapes. Ainsi, répéter les étapes 3.5 et 3.6 jusqu'à ce que la totalité des 100 ml de CIB a été utilisé ( par exemple, 5 des parties aliquotes de 20 ml) et on combine les filtrats résultants.
- Centrifugeuse le broyât groupé à 1000 × g pendant 5 min (frein) à 4 ° C, et jeterle surnageant immédiatement après l'achèvement de la centrifugation, en prenant soin de ne pas perturber le culot. Reprendre le culot dans le surnageant résiduel laissé dans le tube en agitant doucement le tube sur la glace. Ne pas remettre en suspension vigoureusement par pipetage ou tourbillonnement.
- transférer le broyat doucement sur la partie supérieure du gradient de densité continue préformés, à l'aide d'une pipette Pasteur pour l'appliquer par l'intermédiaire de la paroi du tube de réception. Éviter de perturber le gradient. Centrifugeuse dans un rotor oscillant seau à 7800 × g pendant 10 min (frein off) à 4 ° C.
REMARQUE: Deux bandes vertes peuvent être vus dans le gradient après centrifugation: la bande inférieure contient chloroplastes intacts, et la bande supérieure contient des chloroplastes cassés. - Jeter la bande supérieure par pipetage, puis transférer la bande inférieure avec une pipette Pasteur dans un ml nouveau tube de 50 centrifugeuse, en conservant un volume de jusqu'à 8 mL par gradient.
- Ajouter ~ 25 ml de 1x HMS tampon dans le tube et inverser le tube deux fois to laver le Percoll des chloroplastes. Placer le tube à nouveau dans le rotor oscillant seau et centrifuger à 1000 g pendant 5 min (frein) à 4 ° C.
- Verser le surnageant et remettre en suspension soigneusement le culot de chloroplaste dans les HMS résiduels laissés dans le tube en agitant doucement le tube sur la glace. Ajouter un supplément de 100 - 300 pi de HMS si nécessaire (en fonction de la taille de la pastille et le comptage à la section 4), mais essayez de ne pas diluer l'échantillon trop.
- Gardez les chloroplastes sur la glace. Chaque fois avant que les chloroplastes sont utilisés pour des applications en aval, agiter le tube pour les remettre en suspension. Utilisez toujours une pointe de pipette de coupe (avec un pore élargie) pour transférer les chloroplastes.
4. Analyse du rendement et de chloroplastes Intégrité
- Ajouter 5 pi de chloroplastes isolés à 495 pi de tampon de 1x HMS dans un tube de 1,5 ml, puis mélanger doucement en inversant le tube pour obtenir une dilution de 1: 100.
- PlaÇe un couvercle en verre sur le dessus de la chambre de comptage de l'hémocytomètre. Lentement pipette ~ 40 - 60 ul de la suspension de chloroplastes diluée dans l'intervalle entre le verre de protection et la chambre de comptage. En utilisant un microscope à contraste de phase avec un objectif 10X ou 20X, chloroplastes intacts regardent rond et lumineux et sont entourés d'un halo de lumière.
REMARQUE: Sous le microscope, il y a une zone de 1 mm 2 de comptage avec 25 grands carrés, contenant chacun 16 petits carrés dans le centre de la chambre de comptage. - Comptez le nombre de chloroplastes dans 10 grandes places. Le nombre de chloroplastes par grande place devrait être en moyenne entre 10 et 30. Si trop peu ou trop de chloroplastes sont présents, régler le facteur de dilution (étape 4.1 ci-dessus) en conséquence, et répéter la procédure.
- Calculer le nombre de chloroplastes par mL (concentration) comme suit: n (le nombre moyen de chloroplastes par grand carré calculé à l'étape 4.3) × 25 (nombre total de grands carrés) X 100 (facteur de dilution) x 10 4 (facteur d' échelle pour exprimer les données par 1 ml, le volume au- dessus des 25 carrés est de 0,1 mm 3).
- Calculer le rendement réel de chloroplastes en multipliant la concentration en fonction du volume de la suspension obtenue à l'étape chloroplaste 3,12. Normalement, plus de 50 × 10 6 chloroplastes peuvent être obtenus.
5. chloroplaste Protein Importation
- Préparer les solutions mères suivantes:
- Préparer 10x tampon HMS: HEPES 500, 30 mM MgSO 4, et 3,0 M de sorbitol; ajuster le pH à 8,0 avec NaOH. Préparer 50 ml de ce tampon, aliquote et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme et à 4 ° C pour le stockage à court terme.
- Préparer l'importation tampon d'arrêt: EDTA 50 mM dissous dans du tampon 1x HMS. Préparer 50 ml de ce tampon, aliquote et conserver à -20 ° C.
- Préparer la protéine 2x tampon de chargement: 60 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) de glycerol, 2% (en poids/ V) de SDS, 0,005% (p / v) de bleu de bromophénol. Faire 50 ml, et conserver à 4 ° C. Juste avant l'utilisation, ajouter 100 pl de 1 M de 1,4-dithiothréitol (DTT) à 900 ul de tampon.
- Pour exécuter un temps bien sûr, avec 3 points de temps, préparer 3 tubes contenant chacun une aliquote de 130 pi de tampon d'arrêt d'importation, et de les laisser sur la glace. Préparer une réaction à l'importation de 450 ul dans un tube 2 ml (par génotype / état). Décongeler tous les ingrédients juste avant l'utilisation.
- Pour une réaction d'importation, utilisez généralement 10 × 10 6 chloroplastes dans un volume pi; Par exemple, si la concentration du chloroplaste est de 2,5 x 10 8 / ml, utiliser 40 pl de suspension de chloroplastes. Trois points de temps devront 3 × A pi (ie, 120 ul dans notre exemple).
- Mélanger les composants des réactions sur la glace dans l'ordre suivant: l' eau distillée (pour rendre le volume total de 600 pi), le tampon B ul 10x HMS (où B = [600-3 × A] / 10, à savoir, 48 dans notre exemple), 12 pi1 M d' acide gluconique (sel de potassium), 6 ul 1 M NaHCO3, 6 ul de 20% (p / v) de BSA, 30 ul de 100 mM d' adénosine 5'-triphosphate sel de magnésium (MgATP), 24 ul de 250 mM de methionine (non radiomarqué ), et 30 ul protéine précurseur. Immédiatement avant de commencer la réaction d'importation, ajouter 3 × A pi de chloroplastes et mélanger en tapotant doucement le tube.
- Incuber le tube de réaction à 25 ° C dans un bain d'eau de moins de 100 pmol · m - 2 de · - 1 lumière. flick De temps en temps les tubes pour resuspendre chloroplastes.
- Pour procéder à un temps bien sûr, retirer 130 aliquotes ul de la réaction au moment où les points requis dans la gamme linéaire de l'importation, qui pour pPsaD est jusqu'à ~ 12 min (4, 8 et 12 min points de temps sont adaptés dans ce cas). La période de plage linéaire peut varier pour différentes protéines 14. Ainsi, il est suggéré de tester chaque préprotéine individuel avant d'optimiser til points de temps.
- Immédiatement après le retrait, transférer chaque aliquote de 130 pi à un tube de tampon d'arrêt importation glacée, mélanger en tapotant doucement le tube, et de conserver tous les tubes sur la glace jusqu'à ce que le temps bien sûr a été achevée.
- Centrifugeuse tous les échantillons pour 30 s à 12.000 x g dans une microcentrifugeuse, jeter les surnageants par pipetage, et des pastilles de remettre en suspension dans 15 pi de tampon 2x Protein de chargement par tourbillonnement.
- Analyser tous les échantillons ainsi que le contrôle d'entrée pPsaD (contenant pPsaD équivalent à 10% de la quantité ajoutée à chaque réaction à l'importation, à l' étape 2.7) par SDS-PAGE standard et autoradiographie, fluorographie ou imagerie de phosphore 15. Utilisez un logiciel d'analyse d'images pour quantifier et analyser les résultats. Pour donner une indication de l'efficacité de l'importation, la quantité de protéines importées dans différents génotypes / conditions peut être évaluée en mesurant la radioactivité associée à chaque bande mature.
Representative Results
Une expérience à l'importation de protéines de chloroplaste exemple avec 3 points de temps est représenté sur la figure 1. PsaD est une composante ~ 18 kD de photosystème I exposé au stroma, avec une forme précurseur de ~ 23 kD 16. PsaD a été choisi ici pour le test d'importation in vitro de protéines , car ses niveaux l' état d' équilibre sont élevés dans le mutant sp1, par rapport à WT, dans des conditions de stress, ce qui suggère un changement de son efficacité à l'importation dans le mutant 3. Le mutant sp1 comporte un défaut dans un régulateur important de la machinerie d'importation de protéines de chloroplaste - la protéine SP1 3. Pour les chloroplastes isolés à partir de plantes cultivées dans des conditions normales, il n'y avait pas de différence évidente dans l' importation de PsaD entre sp1 et WT (données non présentées) 3. Cependant, en utilisant les méthodes décrites ici pour évaluer PsaD l'importation dans les chloroplastes isolés de osmotiqueles plantes stressées, une nette différence a été détectée. Alors que nous avons observé l'accumulation de la forme de protéine mature d'une manière dépendante du temps avec les deux génotypes, le taux d'importation était significativement plus faible pour les chloroplastes WT que pour chloroplastes sp1 (figure 1), ce qui est cohérent avec nos résultats précédents 3, et révèle un rôle important pour la protéine SP1 dans la régulation de l'importation de chloroplaste de PsaD dans des conditions de stress.
Figure 1. Une protéine d' importation Assay réalisée à l' aide chloroplastes isolés à partir de plantes cultivées sous osmotiques conditions de stress. Les chloroplastes ont été isolées à partir d' un WT 10-day-old (Col-0) et un sp1 mutantes plantes Arabidopsis cultivées dans des conditions de stress (mM mannitol 200) pendant 2 j. (A) Protein importation a été effectuée à l' aide [35 S] -methionine marqué pPsaD et on a laissé se dérouler pendant 4, 8 et 12 minutes avant l'analyse par SDS-PAGE et l'imagerie au phosphore. Protéines En parallèle, le contrôle d'entrée de 10% pPsaD comprenant in vitro traduit (IVT) a été analysé. Le précurseur (pré) et mature (mat) formes de pPsaD sont indiqués, alors que dans l'intervalle, il y a deux groupes qui correspondent probablement à des produits de traduction tronquées ou proteolyses parce que leur intensité n'a pas changé au cours du temps (*). (B) Pour comparer les taux d'importation dans les chloroplastes de plantes WT et sp1 cultivées dans des conditions de stress, l'intensité de chaque bande correspondant à protéine mature importée dans A a été quantifiée. Toutes les données sont exprimées en pourcentage de la quantité de protéines importées dans les chloroplastes de plantes WT après 12 min. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Nous avons récemment montré que chloroplaste l' importation de protéines peut être régulée activement par le stress, ce qui est essentiel pour la fonction de chloroplaste et survie de la plante 3. Dans cette étude, de suivre une telle réglementation, nous avons modifié notre isolement chloroplaste et dans les procédures d'essai d'importation in vitro afin de permettre l' évaluation de la capacité d'importation de plantes cultivées dans des conditions de stress. Les résultats indiquent un rôle important dans la régulation SP1 chloroplaste protéines d'importation.
Tests in vitro d'importation classiques utilisent des plantes cultivées sur MS norme milieu de gélose 6,17,18. Dans le cas du mutant sp1 décrit ici, de tels dosages conventionnels n'a pas révélé de différences dans l' importation de protéines par rapport au WT 3. Cependant, le rôle du SP1 dans la régulation de l' importation de protéines est clairement révélée lorsque l' importation de protéines est évaluée dans des conditions de stress en utilisant les procédés décrits ici (figure 1). Tandis qu'il may pas possible de comparer directement les données d'importation à partir des conditions de stress test avec ceux obtenus à partir de tests classiques (comme les méthodes utilisent les plantes cultivées en culture liquide et sur milieu agar, respectivement), les comparaisons entre le stress et les non-stress conditions sont réalisables à condition que les plantes cultivées sont tous dans le même milieu de culture liquide, avec ou sans facteurs de stress.
En comparaison avec le traitement du stress sur un milieu gélose, la culture liquide est plus commode pour le traitement des grands nombres de plantes nécessaires pour des tests in vitro à l'importation. Par ailleurs, il facilite l'application uniforme du facteur de stress à toutes les plantes, ce qui est particulièrement important pour les traitements de stress à court terme. La méthode présentée ici a été appliqué pour étudier le stress osmotique en utilisant un traitement de mannitol, mais pourrait facilement être adapté à un large éventail d'autres contraintes; par exemple, le stress de sel à court terme et le stress oxydatif, pour lesquels les facteurs de stress correspondants pourraient be appliquée de façon similaire par l'intermédiaire de milieu MS liquide. Pour les autres types de contraintes, nous suggérons le degré de stress est d'abord optimisé; trop sévères traitements peuvent avoir des effets néfastes sur le rendement et / ou de la compétence d'importation des organites isolés.
Il y a plusieurs étapes importantes dans le protocole auquel il faut accorder une attention particulière, comme détaillé ci-dessous.
La concentration optimale pour l'agar-agar du milieu MS peut varier (,6 à 0,9% en poids / volume) selon le fabricant. Par conséquent, il est recommandé d'optimiser empiriquement la concentration de la gélose avant de commencer les expériences. Le milieu ne doit pas être si doux qu'il colle au tissu à l'étape de récolte (étape 1.9), il ne devrait pas être si difficile qu'il inhibe le développement des racines des plantes. La concentration en saccharose peut également être ajustée en fonction des plantes utilisées. Lorsque l'on travaille avec des mutants particulièrement malades, milieu MS additionné de 2 - 3% (p / v) de saccharose peut aider les plantes à croître mieux. Lorsque l'applicationcouché traitements de stress, il est bon de transférer très vieilles plantes au milieu liquide (par exemple,> de 14 jours). Ceci est parce que les racines les plus développées de plantes plus âgées sont plus facilement endommagés pendant le transbordement.
En ce qui concerne le système de transcription / traduction, il existe 2 systèmes majeurs: ceux qui sont basés sur le germe de blé, et celles à base de reticulocytes de lapin. Ces kits peuvent utiliser différents modèles, tels que les plasmides linéarisés, plasmides unlinearized, ou des produits de PCR. Les kits sont également spécifiques pour les promoteurs T3, T7 et SP6. A noter que le kit il est recommandé ici ne peut être utilisé avec des produits de PCR et le promoteur T7. Cependant, pour des raisons inconnues, certains préprotéines radiomarqués faites avec ce système pourrait ne pas fonctionner efficacement dans le dosage d'importation; Dans de tels cas, on peut envisager d'essayer un système d'extrait de germe de blé ou d'un système de lysat de reticulocytes destiné à des modèles de plasmides. On peut aussi améliorer le résultat de la transcription / traduction reune action en modifiant les conditions de réaction selon le manuel du fabricant.
Il est important de commencer l'isolement chloroplaste tôt le matin (ou au début du cycle de lumière de la chambre de croissance) afin d'éviter l'accumulation d'amidon dans les chloroplastes en raison de la photosynthèse, ce qui peut nuire à l'isolement des organites intacts. La procédure d'isolement de chloroplaste doit être fait rapidement et sans retards inutiles, et les chloroplastes isolés doit toujours être conservé au froid. Ceci est d'atténuer l'observation qui a isolé les chloroplastes va progressivement perdre leur viabilité, ce qui est pas bon. Si vous utilisez CIB nouvellement décongelés ou tampon HMS, assurez-vous de mélanger le tampon avant utilisation pour obtenir une solution homogène. Les conditions optimales pour l'homogénéisation du matériel végétal ont été établies de manière empirique et peuvent varier en cas d'un homogénéiseur tissulaire différent est utilisé.
Si les différents génotypes végétaux contiennent similales niveaux de chlorophylle r, la chlorophylle quantification peuvent être utilisés comme une alternative pour normaliser les échantillons avant d'effectuer les essais d'importation. Chlorophyllienne peut être déterminée par spectrophotométrie après extraction d'un échantillon des chloroplastes isolés dans 80% (v / v) d' acétone aqueuse à 19,20. Cependant, si les taux de plantes d'importation montrent des teneurs en chlorophylle (par exemple, des mutants avec des phénotypes chlorotiques) sont à comparer, utiliser le numéro chloroplaste comptant pour normaliser les échantillons de chloroplastes dans les essais d'importation. Il est particulièrement important pour remettre en suspension les chloroplastes soigneusement à l'étape 3.11. resuspension insuffisante peut laisser des agrégats de chloroplastes, ce qui rendra difficile de compter le nombre avec précision et donc va entraver le chargement correct dans les réactions d'importation. Si l' agrégation sévère est vu sous le microscope (par exemple, des agrégats avec> 10 chloroplaste réunis), continuer en secouant l'échantillon de chloroplaste sur la glace jusqu'à ce que le aggregates sont supprimés. Il est plus facile à remettre en suspension les chloroplastes dans un plus petit volume de tampon.
Il est important de savoir que les réactions des protéines d'importation (section 5) doivent être menées avec les précautions appropriées en raison de leur nature radioactive. Les précautions nécessaires comprennent: le port de gants jetables, des vêtements de laboratoire et des lunettes de sécurité, la surveillance et la décontamination de la surface de travail et de l'équipement, et l'élimination de tous les déchets radioactifs dans un conteneur à déchets approuvé. Aussi garder à l'esprit que la pression osmotique correcte est essentielle pour le maintien de l'intégrité des chloroplastes lors des réactions d'importation, ce qui est principalement maintenu par le tampon HMS. Parce que 10x HMS est visqueux, il doit d'abord être réchauffé à la température ambiante, puis soigneusement mélangé et appliqué à l'aide d'une pipette de coupe pour assurer la mesure des volumes précis. Dans la réaction d'importation, la methionine froide est ajoutée pour inhiber l'incorporation de methionine radiomarquée libre dans aucun rapport chloroplast protéines par translation organites au cours de l'étape d'incubation, tandis que la BSA est utilisé pour minimiser la protéolyse, en agissant comme un substrat pour les protéases.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention à PJ de la biotechnologie et biologique Sciences Research Council (BBSRC; accorder ref BB / K018442 / 1.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
| phytoagar | Melford | P1003 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
| triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
| surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
| filter paper | Fisher | FB59023 | |
| Percoll | Fisher | 10607095 | |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
| filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
| 250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
| Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
| Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
| centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
| fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
| fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
| swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
| radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
| rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
| phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
| haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
| cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
| microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
| Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
| gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| methionine | Sigma | M6039 | |
| bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
| glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
| SDS | Fisher | S/5200/53 | |
| Tris Base | Melford | B2005 | |
| dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
| image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |
References
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