Summary
Hier beschrijven we een nieuwe methode om eiwit import te bestuderen in geïsoleerde chloroplasten onder stress. De werkwijze is eenvoudig en snel, en kan worden toegepast op de gevolgen van verschillende stress voor chloroplast eiwitimport en de overeenkomstige regulerende mechanismen te bestuderen.
Abstract
Chloroplasten zijn organellen met vele vitale functies in planten, die niet alleen de fotosynthese, maar talrijke andere metabole en signaleringsfuncties omvatten. Verder chloroplasten zijn van cruciaal belang voor de plantaardige reacties op verschillende abiotische stress, zoals zoutgehalte en osmotische stress. Een chloroplast kan tot ~ 3000 verschillende eiwitten, waarvan sommige worden gecodeerd door de eigen genoom. De meerderheid van chloroplast-eiwitten worden gecodeerd in de kern en gesynthetiseerd in het cytosol en deze eiwitten moeten in de chloroplast door middel translocons de chloroplast envelop membranen worden ingevoerd. Recente studies hebben aangetoond dat de chloroplast eiwitimport actief kan worden geregeld door stress. Om biochemisch onderzoek dergelijke regulering op eiwitimport onder stressomstandigheden, ontwikkelden we de methode beschreven als een snelle en eenvoudige procedure die gemakkelijk in een laboratorium kunnen worden bereikt. In deze methode worden planten gekweekt onder normale conditions en vervolgens blootgesteld aan omstandigheden in vloeibare cultuur te benadrukken. Plantaardige materiaal wordt verzameld en chloroplasten worden vervolgens vrijgegeven door homogenisatie. Het ruwe homogenaat wordt gescheiden door dichtheidsgradiënt centrifugatie, waardoor isolatie van de intacte chloroplasten. Chloroplast opbrengst wordt bepaald door het tellen en chloroplast intactheid wordt gecontroleerd onder een microscoop. Voor het eiwit import assays, worden gezuiverd chloroplasten geïncubeerd met 35S radioactief gemerkt in vitro vertaald voorloper eiwitten en tijdsverloop experimenten worden uitgevoerd om een vergelijking van de tarieven import tussen genotypen in staat onder stress omstandigheden. We presenteren gegevens die met deze methode waaruit blijkt dat het aantal eiwitimport in chloroplasten van een regulerende mutant specifiek onder osmotische stressomstandigheden veranderd.
Introduction
Chloroplasten veel voorkomt organellen die bestaan in de groene weefsels van planten. Ze zijn bekend om hun cruciale rol in de fotosynthese, een proces dat licht energie gebruikt om kooldioxide om te zetten in suiker en dus ondersteunen vrijwel alle leven op aarde 1. Bovendien, chloroplasten (en de bredere familie van gerelateerde organellen genoemd plastiden) spelen vele cruciale rollen in planten, zoals de biosynthese van aminozuren, lipiden, pigmenten, en de detectie van signalen uit de omgeving zoals de zwaartekracht en pathogeen uitdaging. Fotosynthese genereert reactieve zuurstofsoorten (ROS) als bijproducten, die onder bepaalde omstandigheden nuttig rollen, maar als overproductie kan beschadigen of zelfs dodelijke effecten veroorzaken. De overproductie van ROS wordt vooral gepromoot door ongunstige omstandigheden, en dus chloroplasten zijn nauw verbonden met de reacties op abiotische stress, zoals zoutgehalte en osmotische stress 2.
chloroplasts een complexe structuur. Elk chloroplast is omgeven door een dubbele membraan buitenlaag genoemd de omhulling, bestaande uit buitenste en binnenste membranen. Intern is er nog een membraan systeem genaamd de thylakoiden, waar het licht van de fotosynthese plaatsvinden. Tussen de twee membraan systemen is er een waterig compartiment oproep van de stroma, dat betrokken is bij carbon fixatie. Een chloroplast kan tot ~ 3000 verschillende eiwitten, en de meeste van deze eiwitten worden gesynthetiseerd in de cytosol precursor vorm en moeten via speciale eiwitten translocons in de omhulling membranen 1 in het organel te voeren. Interessant is recent werk aangegeven dat chloroplast eiwitimport actief wordt gereguleerd, en is dus in staat om een belangrijke niveau van controle over de chloroplast proteoom uit te oefenen. Zo werd gemeld in 2015 dat eiwit import kunnen reageren op abiotische stress door de directe regulering van de overvloed van the translocatie bij de buitenomhulling membraan van chloroplasten (TOC) van het ubiquitine-proteasoom-systeem 3.
Met behulp van gezuiverde chloroplasten en in vitro gesynthetiseerde voorloper eiwitten, kan eiwitimport worden opgelost in vitro 4,5. Zo kan in vitro methoden worden toegepast om de tarieven van de import in verschillende mutant planten 6, dat een kritische benadering voor de analyse van mogelijke onderdelen van het eiwit import machines en voor het ontdekken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan eiwit import en de regelgeving is te beoordelen. Bovendien kunnen chloroplasten worden verwerkt met verdere fractionering of protease de vertering, na in vitro import, die studies over de sub-organellen lokalisatie en topologie van chloroplast proteïnen 7,8 kan faciliteren.
Om de regulering van eiwit import door stress te bestuderen, hebben we onze routine chloroplast isolatie methode aangepast zoals we zullen beschrijvenhier. Belangrijk, werden chloroplasten geïsoleerd uit planten die op standaard Murashige en Skoog (MS) agarmedium gekweekt waren voor 8 dagen en vervolgens overgebracht naar vloeibaar MS-medium aangevuld met stressor, voor een relatief korte, gecontroleerde stressbehandeling. De opbrengst en de competentie van de chloroplasten geïsoleerd uit dergelijke stress behandelde planten zijn compatibel met de downstream in vitro eiwit import assay 3. Naast de chloroplast isolatieprotocol presenteren we onze routine werkwijze voor in vitro eiwitimport, die voldoende stevig is en wordt veel gebruikt 3,9-12.
Protocol
1. Groei van Arabidopsis planten en de stressbehandeling
- Bereid 1 l Murashige en Skoog (MS) medium door toevoeging van 4,3 g MS basaal zoutmengsel, 10 g sucrose, 0,5 g 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) met gedeïoniseerd water tot 1 l, en pas de pH op 5,7 met kaliumhydroxide (KOH). Voeg 6 g phytoagar en autoclaaf gedurende 20 minuten bij 120 ° C.
- Voordat stollen, giet het medium in round Petri platen (diameter 9 cm, hoogte 1,5 cm, met 20 - 25 ml MS-medium per plaat). Laat de platen voor ~ 1 uur in een laminaire stroming kap drogen voordat het sluiten van de deksels.
- Plaats Arabidopsis thaliana zaden in een 1,5 mL reageerbuis oppervlaktesterilisatie door toevoeging van 1 ml 70% (v / v) ethanol dat 0,02% (v / v) Triton X-100 en voortdurend schudden gedurende 5-10 min. Voor elk genotype / conditie, bereiden 10 Petri platen die elk ~ 100-150 zaailingen.
- Wacht ongeveer 10 seconden totdat de zaden af te wikkelen naar debodem van de buis, en dan gooi het supernatant door pipetteren. Voeg 1 ml 100% ethanol, en schud de buis opnieuw voor 10 min.
- Bereid de laminaire stroming kap, terwijl de zaden zijn steriliseren. Neem een stuk filterpapier per monster, vouw het in de helft van de inzaai te vergemakkelijken, en laat deze in 100% ethanol in de kap. Wacht tot het droogt volledig uit. Merk op dat 100% ethanol wordt gebruikt als het sneller dan 70% ethanol verdampt.
- Breng de zaden op het filterpapier door pipetteren met een 1 ml pipet tip cut ~ 5 mm van het fijne einde. Laat ze drogen, die ongeveer 10 moet nemen - 15 min.
- Zaai ~ 100-150 gesteriliseerde zaden gelijkmatig op elke MS-medium Petri plaat, en sluit elke plaat met chirurgische tape.
- Bewaar de platen ondersteboven op 4 ° C gedurende 2 - 4 d aan te moedigen en te synchroniseren kieming. Oude zaden kan nodig zijn om langer bij 4 ° C blijven (tot een week).
- Breng de platen om een plant weefselkweek kamer en laat ze op zijn kop op.Groeien de planten gedurende 8 d onder een lange-daagse cyclus (16 h 100 umol m · - · 2 s - 1 licht, 8 uur donker) bij 20 ° C.
- Tegen stress behandeling, wanneer de planten zijn 8 d oud, in de stroom kap, breng ze uit het agar medium, door ze voorzichtig af te schrapen met de hand dragen-ethanol gesteriliseerde handschoenen, in een gesteriliseerde fles van vloeibaar MS medium dat de stressor (bv , 200 mM mannitol). Vermijd overdracht agar medium. Bedek de kolf mond gesteriliseerde folie en laat de planten groeien onder dezelfde omstandigheden als in stap 1,8 gedurende nog 2 d op een orbitale schudder onder zacht schudden (-100 rpm).
2. Het maken van een Precursor eiwit door in vitro transcriptie / translatie
Opmerking: Dit protocol veronderstelt het gebruik van Arabidopsis fotosysteem I subeenheid D precursor (pPsaD) als de matrijs / preproteïne, maar de methode is geschikt voor anderen.
LET OP: Al deze stappen maken gebruik van standaard moleculaire kloontechnieken.
Let op: Draag handschoenen, laboratorium kleding en veiligheid glasses bij de omgang met radioactief materiaal. Bewaken en te ontsmetten het werkoppervlak en de uitrusting. Gooi alle radioactief afval in een erkende afvalcontainer.
3. Chloroplast Isolation
- Bereid de volgende voorraad oplossingen:
- Bereid Chloroplast Isolation Buffer (CIB, 2x): 0,6 M sorbitol, 10 mM magnesiumchloride(MgCl2), 10 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), 10 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 20 mM natriumbicarbonaat (NaHCO3), 40 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) ; op pH 8,0 met KOH. Bereid 2 L van 2x CIB, maken aliquots en bewaar ze bij -20 ° C voor langdurige opslag, of bij 4 ° C voor de korte termijn opslag. Om 1x CIB te maken, verdunnen de 2x CIB 1: 1 met gedestilleerd water; Dit kan vers worden bereid op de dag van chloroplast isolatie experiment.
- Bereid HEPES-MgSO4 -sorbitol buffer (HMS, 1x): 50 mm HEPES, 3 mM magnesiumsulfaat (MgSO4), 0,3 M sorbitol; op pH 8,0 met natriumhydroxide (NaOH). Bereid 400 ml buffer, maken aliquots en bewaar ze bij -20 ° C voor langdurige opslag, of bij 4 ° C voor de korte termijn opslag.
- Voeren alle van de volgende procedures in de koude kamer of op ijs. Te koelen alle oplossingen, inrichtingen, uitrusting, en rotors voor de starting.
- Bereid een continue dichtheidsgradiënt door het mengen van 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB buffer en 5 mg glutathion in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeren van het mengsel bij 43.000 xg gedurende 30 min (rem uit) bij 4 ° C. Na centrifugeren, omgaan met de buis met zorg om te voorkomen dat het verstoren van de gradiënt en houd het op het ijs voor later gebruik.
- Breng 100 ml 1x CIB per genotype / voorwaarde om een 1 liter beker.
- Verwijder de zaailingen van het vloeibare medium door het kantelen van ze in een zeef en zet ze in een ander-CIB met beker; Vervolgens, spoel het weefsel met CIB om het resterende vloeibaar medium alvorens te vervangen door 100 ml vers CIB verwijderen.
- Voor homogenisatie gebruikt in totaal 100 ml 1x CIB per monster in vijf achtereenvolgende ronden van homogenisering, elke ronde gebruik 20 ml vers CIB gehouden in een 50 ml bekerglas.
- Voor de eerste ronde van homogenisatie Breng het plantenweefsel in de 50 ml beker met de hand, waardoor devorige Holding buffer om uit te lekken door je vingers. Probeer om het grootste deel van het weefsel te gebruiken in de eerste ronde, maar zorg ervoor dat het wordt ondergedompeld met buffer; Als dit niet mogelijk is, dient de onbeschreven weefsel bij de tweede ronde.
- Plaats probe van het weefsel in het weefsel homogenisator gehomogeniseerd en met twee pulsen van 1-2 s elk. Filter de homogenaat door middel van twee lagen van filtratie doek in een 250 ml centrifugebuis door zachte knijpen. Bewaar het filtraat, en het weefsel transfer terug naar de 50 ml beker.
- Plaats een tweede 20 mL aliquot CIB in de 50 ml beker, toevoeging restmateriaal niet in de eerste ronde van homogenisatie en herhaal de homogenisering en filtratiestappen. Aldus Herhaal stap 3,5 en 3,6 totdat alle 100 ml CIB is uitgeput (dat wil zeggen 5 aliquots van 20 ml) en voeg de resulterende filtraten.
- Centrifugeer de samengevoegde homogenaat bij 1000 x g gedurende 5 min (rem) bij 4 ° C en gietde supernatant onmiddellijk na voltooiing van het centrifugeren, verzorgen de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in de resterende supernatant links in de buis door zachtjes schudden van de buis op ijs. Niet krachtig mengen door pipetteren of vortexen.
- Zacht overdracht het homogenaat op de bovenkant van de premade continue dichtheidsgradiënt, met behulp van een Pasteur pipet toe te passen via de wand van het ontvangende buis. Vermijd verstoren het verloop. Centrifugeer in een swinging-bucket rotor bij 7800 xg gedurende 10 min (rem uit) bij 4 ° C.
OPMERKING: Twee groene banden kan worden gezien in het verloop na het centrifugeren: de onderste band bevat intact chloroplasten, en de bovenste band bevat gebroken chloroplasten. - Gooi de bovenste band door pipetteren en breng de onderste band met een Pasteur pipet in een verse 50 ml centrifugebuis, behouden een inhoud tot 8 ml per gradiënt.
- Voeg ~ 25 ml 1x HMS buffer in de buis en draai de buis tweemaal to Was de Percoll van de chloroplasten. Plaats de buis opnieuw in de swinging-bucket rotor en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten (rem) bij 4 ° C.
- Giet het supernatant voorzichtig resuspendeer de pellet in de chloroplast residuele HMS links in de buis door zachtjes schudden van de buis op ijs. Voeg een extra 100-300 pl HMS eventueel (gebaseerd op de grootte van de pellet en de telling in hoofdstuk 4), maar niet proberen het monster te veel verdund.
- Houd de chloroplasten op het ijs. Elke keer voordat de chloroplasten worden gebruikt voor downstream-toepassingen, schud de buis om ze te mengen. Gebruik altijd een cut pipet tip (met een vergrote poriën) aan de chloroplasten te dragen.
4. Analyse van de opbrengst en op beschadigingen van chloroplasten
- Voeg 5 ul van geïsoleerde chloroplasten tot 495 ul van 1x HMS buffer in een 1,5 ml buis, en dan meng voorzichtig door het omkeren van de buis om een 1 te verkrijgen: 100 verdunning.
- Place een cover glas op de top van de telkamer van de hemocytometer. Langzaam pipet ~ 40 - 60 pi van de verdunde suspensie chloroplast in de spleet tussen het dekglaasje en telkamer. Met behulp van een fase-contrast microscoop met een 10X of 20X objectief, intacte chloroplasten kijk rond en helder en worden omgeven door een aureool van licht.
OPMERKING: Onder de microscoop is een 1 mm 2 tellen met 25 grote vierkanten, elk met 16 kleine vierkantjes in het midden van de telkamer. - Tel het aantal chloroplasten in 10 grote pleinen. Het aantal chloroplasten per vierkante moet gemiddeld tussen de 10 en 30. Als er te weinig of te veel chloroplasten aanwezig zijn, stel de verdunningsfactor (stap 4.1 hierboven) dienovereenkomstig, en herhaal de procedure.
- Bereken het aantal chloroplasten per ml (concentratie) als volgt: n (het gemiddelde aantal chloroplasten per grote vierkante berekend in stap 4.3) × 25 (totaal aantal grote pleinen) X 100 (de verdunningsfactor) × 10 4 (schaalfactor gegevens per 1 ml tot expressie, aangezien het volume boven de 25 vierkanten is 0,1 mm 3).
- Berekent de werkelijke opbrengst van chloroplasten door de concentratie te vermenigvuldigen met het volume van chloroplast suspensie verkregen in stap 3.12. Gewoonlijk kan meer dan 50 x 10 6 chloroplasten worden verkregen.
5. Chloroplast Protein Import
- Bereid de volgende voorraad oplossingen:
- Bereid 10x HMS buffer: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO4, en 3,0 M sorbitol; op pH 8,0 met NaOH. Bereid 50 ml van deze buffer, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag en bij 4 ° C voor korte-termijn opslag.
- Bereid Import stop buffer: 50 mM EDTA opgelost in 1x HMS buffer. Bereid 50 ml van deze buffer, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid 2x eiwit laadbuffer: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) glycerol, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) broomfenolblauw. Maak 50 ml, en bewaar bij 4 ° C. Net voor gebruik, voeg 100 ul van 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) tot 900 ul van buffer.
- Om een tijdsverloop uitgevoerd met 3 tijdstippen, voor te bereiden 3 tubes met elk een 130 ul monster van import stop buffer, en laat ze op ijs. Bereid een 450 ul import reactie in een 2 ml buis (per genotype / conditie). Ontdooien alle ingrediënten vlak voor gebruik.
- Voor een import reactie gebruiken meestal 10 × 10 6 chloroplasten in A pi volume; bijvoorbeeld als de chloroplast concentratie 2,5 x 10 8 / ml, 40 ul gebruikt chloroplast suspensie. Drie tijdstippen zal 3 × A pi nodig (dat wil zeggen, 120 pl in ons voorbeeld).
- Meng de reacties componenten op het ijs in de volgende volgorde: gedestilleerd water (om het totale volume 600 pi te maken), B ul 10x HMS buffer (waarbij B = [600-3 × A] / 10, dwz 48 in ons voorbeeld), 12 pi1 M gluconzuur (kaliumzout), 6 pl 1 M NaHCO3, 6 pl 20% (w / v) BSA, 30 pl 100 mM adenosine 5'-trifosfaat magnesiumzout (MgATP), 24 ul 250 mM methionine (niet radioactief gelabeld ) en 30 pi voorlopereiwit. Onmiddellijk vóór het begin van de import reactie, voeg 3 × A pi van chloroplasten en meng door voorzichtig de buis te tikken.
- Incubeer de reactiebuis bij 25 ° C in een waterbad onder 100 umol m · - · 2 s - 1 licht. Af en toe flick de buizen chloroplasten mengen.
- Om een tijdsverloop te voeren, in te trekken 130 pi monsters uit de reactie op de vereiste tijdstippen binnen het lineaire gebied van import, die voor pPsaD is tot ~ 12 min (4, 8 en 12-min tijdstippen zijn geschikt in dit geval). Het lineaire bereik termijn kan variëren voor verschillende eiwitten 14. Derhalve wordt voorgesteld om voor elk individueel preproteïne testen t optimaliserenHij tijdstippen.
- Onmiddellijk na de intrekking, overdragen elk 130 pi hoeveelheid om een buis van ijskoude import stop buffer, meng door voorzichtig de buis te tikken, en behouden alle buizen op ijs tot het tijdsverloop is afgerond.
- Centrifugeer alle monsters gedurende 30 seconden bij 12.000 x g in een microfuge, gooi de supernatanten door pipetteren en resuspendeer pellets in 15 ul 2x eiwit laadbuffer door vortexen.
- Analyseer de monsters plus de pPsaD invoerbesturingselement (met pPsaD gelijk aan 10% van de toegevoegde elke invoer reactie bedrag uit stap 2,7) door middel van standaard SDS-PAGE en autoradiografie, fluorografie of fosfor beeldvorming 15. Gebruik beeldanalyse software te kwantificeren en analyseren van de resultaten. Om een indicatie van de import efficiëntie, de hoeveelheid geïmporteerde eiwit in verschillende genotypen / voorwaarden kan worden beoordeeld door het meten van de radioactiviteit in verband met elke volwassen band.
Representative Results
Een voorbeeld chloroplast eiwitimport experiment 3 tijdstippen wordt weergegeven in figuur 1. PSAD een ~ 18 kD component van fotosysteem I blootgesteld aan de stroma, een voorloper vorm van 23 kD ~ 16. PSAD werd hier voor de in vitro assay eiwitimport gekozen omdat de steady-state niveaus worden verhoogd in de sp1 mutant ten opzichte van WT onder stressomstandigheden, wat wijst op een verandering van de invoer efficiëntie in de mutant 3. De sp1 mutant draagt een defect in een belangrijke regulator van de chloroplast eiwit import van machines - de SP1-proteïne 3. Voor chloroplasten geïsoleerd uit planten gekweekt onder normale omstandigheden is er geen duidelijke verschil tussen PSAD import sp1 en WT (gegevens niet getoond) 3. Bij gebruikmaking van de hier beschreven werkwijzen voor PSAD invoer beoordelen chloroplasten geïsoleerd uit osmotischgestresste planten, werd een duidelijk verschil waargenomen. Terwijl we de accumulatie van het rijpe eiwit vorm op een tijdsafhankelijke wijze met beide genotypen waargenomen, de snelheid van invoer was significant lager voor WT chloroplasten dan sp1 chloroplasten (figuur 1), hetgeen consistent is met onze eerdere resultaten 3 en onthult een belangrijke rol voor de SP1-eiwit in de chloroplast reguleren invoer van pSAD onder stressomstandigheden.
Figuur 1. Een eiwitimport Assay uitgevoerd met chloroplasten geïsoleerd uit planten gekweekt onder osmotische stressomstandigheden. Chloroplasten werden geïsoleerd uit een 10 dagen oude WT (Col-0) en een sp1 mutante Arabidopsis-planten gekweekt onder stresscondities (200 mM mannitol) voor 2 d. (A) eiwitimport werd uitgevoerd met [35S] -Met-Hionine gemerkte pPsaD en men gedurende 4, 8 en 12 minuten vóór de analyse met SDS-PAGE en fosfor beeldvorming. Parallel, de pPsaD 10% input control omvat in vitro vertaald eiwit (IVT) werd geanalyseerd. De voorloper (pre) en volwassen (mat) vormen van pPsaD zijn aangegeven, terwijl in tussen zijn er twee bands die waarschijnlijk overeenkomen met afgeknotte of geproteolyseerd translatieproducten omdat hun intensiteit niet veranderen tijdens het tijdsverloop (*). (B) om de tarieven van invoer te vergelijken in de chloroplasten van WT en sp1 planten onder stress omstandigheden, de intensiteit van elke band die overeenkomt met geïmporteerde rijp eiwit in A werd gekwantificeerd. Alle gegevens worden uitgedrukt als percentage van het bedrag van de ingevoerde eiwit in chloroplasten van WT planten na 12 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
We hebben onlangs aangetoond dat chloroplast eiwitimport actief kan worden geregeld door stress, wat essentieel is voor chloroplast functie en overleving van planten 3. In deze studie, om een dergelijke verordening te controleren, aangepast we onze chloroplast isolatie en in vitro import assay procedures met het oog op de beoordeling van de importcapaciteit van planten onder stress omstandigheden mogelijk te maken. De resultaten gaven een belangrijke rol voor SP1 in chloroplast eiwitimport regelgeving.
Conventionele in vitro import assays gebruiken planten gekweekt op standaard MS agarmedium 6,17,18. Bij de sp1 mutant hier beschreven, heeft deze bekende bepalingen geen verschil in eiwitimport opzichte van de WT 3 onthullen. Echter, de rol van SP1 in het reguleren eiwitimport duidelijk onthuld wanneer eiwitimport onder stressomstandigheden toepassing van de hierin beschreven werkwijzen (figuur 1) wordt beoordeeld. Hoewel het may niet mogelijk om rechtstreeks importeren vergelijken van stresscondities assay met die verkregen uit conventionele testen (zoals de werkwijzen maken gebruik planten gekweekt in vloeibare kweek en op agar medium, respectievelijk), vergelijkingen tussen stress en niet- stresscondities haalbaar mits de planten zijn allemaal gekweekt in hetzelfde kweekmedium vloeistof, met of zonder stressoren.
Vergeleken met de stressbehandeling op agar medium, vloeibare kweek is meer geschikt voor de behandeling van grote aantallen van planten vereist voor in vitro assays invoer. Bovendien vergemakkelijkt de uniforme toepassing van de stressor alle planten, wat vooral belangrijk is voor kortstondige stress behandelingen. De hier gepresenteerde methode werd toegepast op de osmotische stress bestuderen vanuit mannitol behandeling, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van andere belastingen; bijvoorbeeld kortdurende zoutstress en oxidatieve stress, waarvoor de overeenkomstige stressoren kan be op dezelfde manier toegepast via vloeibaar MS-medium. Voor andere vormen van stress, raden we de mate van stress wordt eerst geoptimaliseerd; overdreven ernstige behandelingen kunnen nadelige effecten op de opbrengst en / of bekwaamheid invoer van de geïsoleerde organellen hebben.
Er zijn een aantal belangrijke stappen in het protocol waaraan men moet speciale aandacht besteden, zoals hieronder beschreven.
De optimale concentratie van de agar medium MS kunnen verschillen (0,6-0,9% w / v) afhankelijk van de fabrikant. Zo is het raadzaam om de agar concentratie empirisch te optimaliseren voordat u begint met experimenten. Het medium moet niet zo zacht dat het vasthoudt aan het weefsel op het oogsten (stap 1.9) te zijn, noch moet het zo hard dat het remt plantenwortel ontwikkeling. De sucrose concentratie kan worden aangepast aan de gebruikte planten. Bij het werken met name zieke mutanten, MS-medium aangevuld met 2 - 3% (w / v) sucrose kan helpen planten groeien beter. wanneer appliegen stress-behandelingen, is het niet goed tot zeer oude planten over te dragen aan het vloeibare medium (bijvoorbeeld> 14 dagen oud). Dit komt omdat de meer ontwikkelde wortels oudere planten gemakkelijker tijdens overdracht beschadigd zijn.
Wat de transcriptie / translatiesysteem, zijn er 2 belangrijke systemen: op basis van tarwekiemen, en op basis van konijnen reticulocyten. Deze kits kunnen verschillende sjablonen, zoals gelineariseerde plasmiden, unlinearized plasmiden of PCR producten. De kits zijn ook specifiek voor de T3, T7 en SP6 promoters. Merk op dat de kit raden hier alleen geschikt voor PCR-producten en de T7 promoter. Echter, om onbekende redenen, sommige radioactief gemerkt preproteins gemaakt met dit systeem misschien niet efficiënt in de import assay werken; in dergelijke gevallen kan men overwegen om een tarwekiem extract systeem of een reticulocyten lysaat systeem bedoeld voor plasmide templates. Men kan ook de resultaten van de transcriptie / translatie reoptreden door wijziging van de reactiecondities volgens de handleiding van de fabrikant.
Het is belangrijk om chloroplast isolatie beginnen vroeg in de ochtend (of vroeg in de lichtcyclus van de groeikamer) om accumulatie van zetmeel voorkomen in de chloroplasten door fotosynthese, die de isolatie van intacte organellen kan belemmeren. De chloroplast isolatie procedure moet snel worden gedaan zonder onnodige vertraging, en de geïsoleerde chloroplasten moet altijd koud worden gehouden. Dit om beperken van de waarneming dat geïsoleerde chloroplasten geleidelijk hun levensvatbaarheid, wat niet goed verliezen. Bij gebruik van nieuw ontdooide CIB of HMS buffer, moet u de buffer te mengen voor gebruik goed om een homogene oplossing te verkrijgen. De optimale omstandigheden voor het homogeniseren van plantenmateriaal zijn empirisch vastgesteld, en kan variëren als een ander weefsel homogenisator gebruikt.
Als de andere plant genotypen bevatten similar chlorofyl niveaus, kan chlorofyl kwantificering worden gebruikt als een alternatieve manier om de monsters te normaliseren voor het uitvoeren van de invoer assays. (Vol / vol) Chlorofyl kan spectrofotometrisch worden bepaald na extractie van een monster van de geïsoleerde chloroplasten in 80% waterig aceton 19,20. Indien de invoer tarieven pootaardappelen met verschillende chlorophylgehalte (bijvoorbeeld mutanten met chloro- fenotypes) zijn te vergelijken, gebruikt chloroplast aantal tellen in de chloroplast monsters normaliseren de import assays. Het is bijzonder belangrijk de chloroplasten grondig mengen in stap 3.11. Onvoldoende resuspensie kunnen aggregaten van chloroplasten, waardoor het moeilijk om cijfers nauwkeurig te tellen reactie en zal dus de juiste lading hinderen import reacties. Als ernstige aggregatie wordt gezien onder de microscoop (bijvoorbeeld aggregaten met> 10 chloroplast samengevoegd), blijven schudden van de chloroplast monster op ijs tot de aggregates verwijderd. Het is gemakkelijker om de chloroplasten resuspenderen in een kleiner volume buffer.
Het is belangrijk om te beseffen dat eiwitimport reacties (hoofdstuk 5) moeten worden uitgevoerd met de juiste voorzorgsmaatregelen vanwege hun radioactieve aard. Noodzakelijke maatregelen houden in: het dragen van wegwerphandschoenen, laboratorium kleding en een veiligheidsbril, monitoring en ontsmetten van het werkoppervlak en apparatuur, en de verwijdering van al het radioactief afval in een erkende afvalcontainer. Ook in gedachten houden dat de juiste osmotische druk is van cruciaal belang voor het behoud van de intactheid van chloroplasten tijdens het importeren reacties, en dit wordt voornamelijk onderhouden door de HMS buffer. Omdat 10x HMS is stroperige, moet eerst worden opgewarmd tot kamertemperatuur, en vervolgens grondig gemengd en aangebracht met een cut pipet tip om het meten van nauwkeurige volumes garanderen. In de import reactie wordt koud methionine toegevoegd aan de opname van vrije radioactief gemerkt methionine remmen in ongerelateerde chloroplast eiwitten door middel vertaling organellen tijdens de incubatiestap, terwijl BSA gebruikt om proteolyse te minimaliseren door als substraat voor proteasen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie aan PJ van de Biologie en Biotechnologie Sciences Research Council (BBSRC; verlenen ref BB / K018442 / 1.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
| phytoagar | Melford | P1003 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
| triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
| surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
| filter paper | Fisher | FB59023 | |
| Percoll | Fisher | 10607095 | |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
| filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
| 250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
| Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
| Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
| centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
| fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
| fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
| swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
| radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
| rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
| phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
| haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
| cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
| microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
| Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
| gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| methionine | Sigma | M6039 | |
| bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
| glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
| SDS | Fisher | S/5200/53 | |
| Tris Base | Melford | B2005 | |
| dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
| image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |
References
- Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).
- Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses. Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).
- Ling, Q., Jarvis, P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).
- Chua, N. H., Schmidt, G. W. In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits. Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).
- Highfield, P. E., Ellis, R. J. Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase. Nature. 271, 420-424 (1978).
- Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).
- Froehlich, J. Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases. Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).
- Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts. Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).
- Kubis, S., et al. The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins. Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).
- Kubis, S., et al. Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors. Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).
- Aronsson, H., et al. Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency. Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).
- Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane. Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Aronsson, H., et al. Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves. Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).
- Aronsson, H., Jarvis, R. P. Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays. Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).
- Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma. J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).
- Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants. Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).
- Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts. Plant Cell. 14, 641-654 (2002).
- Miras, S., et al. Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast. J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).
- Nada, A., Soll, J. Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway. J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).
