Summary
Her beskriver vi en ny metode til at studere protein import til isolerede chloroplaster under stress. Fremgangsmåden er enkel og hurtig, og kan anvendes til at undersøge konsekvenserne af forskellige stressbetingelser for chloroplast-protein import, og de tilsvarende reguleringsmekanismer.
Abstract
Kloroplaster er organeller med mange vitale roller i planter, som omfatter ikke blot fotosyntese men mange andre metaboliske og signalering funktioner. Endvidere kloroplaster er kritiske for vegetabilske reaktioner på forskellige abiotisk stress, såsom saltholdighed og osmotiske stress. Et chloroplast kan indeholde op til ~ 3000 forskellige proteiner, hvoraf nogle er kodet af sit eget genom. størstedelen af chloroplast proteiner er imidlertid indkodet i kernen og syntetiseret i cytosolen, og disse proteiner skal importeres til kloroplast gennem translocons på chloroplast kuvert membraner. Nylige undersøgelser har vist, at chloroplast-protein import aktivt kan reguleres af stress. Til biokemisk undersøge en sådan regulering af protein import under stress betingelser, vi udviklede den her beskrevne fremgangsmåde som en hurtig og enkel procedure, der nemt kan opnås i alle laboratorier. Ved denne fremgangsmåde er planter dyrket under normale conditions og derefter udsættes for stress forholdene i flydende kultur. Plantemateriale opsamles, og chloroplaster frigives derefter ved homogenisering. Det rå homogenat separeres ved densitetsgradientcentrifugering, hvilket muliggør isolering af de intakte chloroplaster. Kloroplast udbytte vurderes ved optælling, og kloroplast intakthed kontrolleres under et mikroskop. For protein import analyser, er oprensede kloroplaster inkuberes med 35 S radioaktivt mærket in vitro oversat precursorproteiner, og gennemføres tid-retters eksperimenter for at gøre det muligt at sammenligne import- satserne mellem genotyper under stress betingelser. Vi præsenterer data genereret ved hjælp af denne metode, som viser, at hastigheden af protein import til kloroplaster fra en regulerende mutant specifikt ændres under osmotiske stress betingelser.
Introduction
Kloroplaster er meget rigelige organeller, der findes i de grønne væv i planter. De er kendt for deres kritiske rolle i fotosyntesen, en proces, der bruger lysenergi til at omdanne kuldioxid til sukker og dermed støtte næsten alt liv på jorden en. Desuden chloroplaster (og den bredere familie af beslægtede organeller kaldet plastider) spiller mange andre vitale roller i planter, herunder biosyntesen af aminosyrer, lipider, pigmenter og føling af miljømæssige signaler, såsom tyngdekraft og patogen udfordring. Fotosyntese genererer reaktive oxygenarter (ROS) som biprodukter, som under visse omstændigheder har nyttige roller, men hvis overproduceres kan forårsage skadelige eller endda dødelige virkninger. Den overproduktion af ROS er især fremmet af ugunstige miljøforhold, og dermed kloroplaster er tæt knyttet til reaktioner på abiotisk stress, såsom saltholdighed og osmotiske stress 2.
Chloroplasts har en kompleks struktur. Hver chloroplast er omgivet af en dobbelt-membran ydre lag kaldet konvolutten, der består af ydre og indre membraner. Internt er der en anden membransystem kaldet thylakoider, hvor lyset reaktioner fotosyntese foregår. Mellem de to membransystemer der er en vandig rum opkald stroma, som er involveret i kulstof fiksering. Et chloroplast kan indeholde op til ~ 3000 forskellige proteiner, og langt de fleste af disse proteiner syntetiseres i cytosolen i forstadieform og skal importeres til organel via dedikerede protein translocons i kuverten membranerne 1. Interessant, har nyere arbejde vist, at chloroplast protein import aktivt er reguleret, og så er i stand til at udøve en betydelig grad af kontrol over kloroplast proteomanalyse. For eksempel blev det rapporteret i 2015 at protein import kan reagere på abiotisk stress gennem direkte regulering af den overflod af the translocon ved den ydre kuvert membran af chloroplaster (TOC) ved ubiquitin-proteasom system 3.
Anvendelse af oprensede chloroplaster og in vitro syntetiseret precursorproteiner kan protein import rekonstitueres in vitro 4,5. Således kan in vitro-metoder anvendes til at vurdere satserne for import i forskellige mutant planter 6, hvilket har været en kritisk tilgang til analyse af formodede komponenter af proteinet import maskiner og for at opdage mekanismerne bag protein import og dens regulering. Desuden kan kloroplaster behandles med yderligere fraktionering eller protease fordøjelse, efter in vitro import, som kan lette undersøgelser af sub-organellar lokalisering og topologi chloroplast proteiner 7,8.
For at undersøge reguleringen af protein import af stress, har vi ændret vores rutine chloroplast isolation metode, som vi vil beskriveher. Vigtigere, blev chloroplaster isoleret fra planter, der var blevet dyrket på standard Murashige og Skoog (MS) agarmedium i 8 dage og derefter overført til flydende MS-medium suppleret med stressor, hvilket giver en forholdsvis kort, kontrolleret stress behandling. Udbyttet og kompetenceudvikling af kloroplaster isoleret fra sådanne stress-behandlede planter er kompatible med nedstrøms in vitro protein import assay 3. Ud over den kloroplast isolation protokol, præsenterer vi vores rutine fremgangsmåde til in vitro protein import, som har vist sig at være robust og er meget udbredt 3,9-12.
Protocol
1. Vækst af Arabidopsis Planter og Stress Behandling
- Forbered 1 L Murashige og Skoog (MS) medium ved tilsætning af 4,3 g MS Basal saltblanding, 10 g saccharose, 0,5 g 2- (N-morpholino) ethansulfonsyre (MES) til deioniseret vand op til 1 L, og justere pH til 5,7 med kaliumhydroxid (KOH). Tilføj 6 g phytoagar og autoklave i 20 minutter ved 120 ° C.
- Før størkning, hæld mediet i runde petriskåle (diameter 9 cm, højde 1,5 cm, med 20 - 25 ml MS-medium per plade). Tillad pladerne tørre i ~ 1 time i en laminar flow hætte før lukning lågene.
- Placer Arabidopsis thaliana frø i et 1,5 ml prøverør for overfladen sterilisering ved tilsætning af 1 ml 70% (v / v) ethanol indeholdende 0,02% (volumen / volumen) Triton X-100 og kontinuerligt omrystning i 5-10 min. For hver genotype / tilstand, fremstilling af 10 petriskåle hver bærer ~ 100 - 150 kimplanter.
- Vent ca. 10 s, indtil frøene sedimentere tilbunden af røret, og derefter kassere supernatanten ved pipettering. Tilsæt 1 ml 100% ethanol, og ryst glasset igen i 10 min.
- Forbered laminar flow hætte, mens frøene sterilisering. Tag et stykke filtrerpapir per prøve, fold det på midten for at lette såning, og lægges i 100% ethanol i hætten. Vent det tørrer helt ud. Bemærk, at 100% ethanol anvendes som det fordamper hurtigere end 70% ethanol.
- Overfør frøene på filtrerpapiret ved pipettering anvendelse af en 1 ml pipettespids cut ~ 5 mm fra den fine ende. Lad dem tørre, som bør tage cirka 10 - 15 min.
- So ~ 100 - 150 steriliserede frø jævnt på hver MS medium Petri plade, og forsegle hver plade med kirurgisk tape.
- pladerne Opbevar på hovedet ved 4 ° C i 2 - 4 d at opmuntre og synkronisere spiring. Gamle frø kan være nødvendigt at blive længere (op til en uge) ved 4 ° C.
- Overfør pladerne til et plantevæv kultur kammer og efterlade dem på hovedet op.Dyrke planter til 8 d under en lang dages cyklus (16 timer 100 pmol · m - 2 · s - 1 let, 8 h mørke) ved 20 ° C.
- Mod stress behandling, når planterne er 8 d gamle, i flow hætte, overføre dem fra agarmediet, ved forsigtigt at skrabe dem af med hånden iført ethanol-steriliserede handsker, i en steriliseret kolbe af flydende MS-medium indeholdende stressor (f.eks , 200 mM mannitol). Undgå at fremførsel agar medium. Dæk kolben munden med steriliseret folie og tillade planterne at vokse under de samme betingelser som i trin 1.8 i yderligere 2 d på en orbitalryster under forsigtig omrystning (~ 100 rpm).
2. Realiseringen af et precursorprotein ved in vitro-transkription / translation
Bemærk: Denne protokol forudsætter brugen af Arabidopsis fotosystem I subunit D precursor (pPsaD) som template / præprotein, men metoden er forenelig med andre.
BEMÆRK: Alle disse trin ansætte standard molekylære kloningsteknikker.
Forsigtig: Bær handsker, laboratorie tøj og sikkerhedsmæssige glasses ved håndtering af radioaktivt materiale. Overvåg og rense arbejdsfladen og udstyr. Bortskaf alt radioaktivt affald i en godkendt affaldsbeholder.
3. Chloroplast Isolation
- Forbered følgende stamopløsninger:
- Forbered Chloroplast Isolation Buffer (CIB, 2x): 0,6 M sorbitol, 10 mM magnesiumchlorid(MgCl2), 10 mM ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA), 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 20 mM natriumhydrogencarbonat (NaHCO3), 40 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre (HEPES) ; justeres til pH 8,0 med KOH. Forbered 2 L af 2x CIB, lave prøver og holde dem ved -20 ° C i langtidsopbevaring, eller ved 4 ° C til kortvarig opbevaring. For at gøre 1x CIB, fortyndes 2x CIB 1: 1 med destilleret vand; dette kan tilberedes frisk på dagen for kloroplast isolation eksperiment.
- Forbered HEPES-MgSO4 Sorbitol puffer (HMS, 1x): 50 mM HEPES, 3 mM magnesiumsulfat (MgSO4), 0,3 M sorbitol; justeres til pH 8,0 med natriumhydroxid (NaOH). Forbered 400 ml buffer, gør portioner og opbevares ved -20 ° C i langtidsopbevaring, eller ved 4 ° C til kortvarig opbevaring.
- Udfør alle de følgende procedurer i det kolde rum eller på is. Forkøling alle de løsninger, enheder, udstyr og rotorer før starting.
- Forbered en kontinuerlig densitetsgradient ved blanding 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB buffer og 5 mg glutathion i et 50 ml centrifugerør, og centrifugering af blandingen ved 43.000 x g i 30 minutter (bremse slået fra) ved 4 ° C. Efter centrifugering, håndtere rør med forsigtighed for at undgå at forstyrre gradienten og holde det på is til senere brug.
- Overfør 100 ml 1x CIB pr genotype / tilstand til en 1 L bægerglas.
- Fjern de planter fra det flydende medium ved at vippe dem i en sigte, og overføre dem til et andet CIB-holdige bægerglas; derefter skylles vævet med CIB at fjerne eventuelle flydende medium, før du udskifter den med 100 ml frisk CIB.
- For homogenisering, anvende i alt 100 ml 1x CIB per prøve i fem på hinanden følgende runder af homogenisering, hver runde ved anvendelse af 20 ml frisk CIB holdt i et 50 ml bægerglas.
- For den første runde af homogenisering, overføre plantevævet i 50 ml-bæger i hånden, hvilket tilladertidligere beholdning buffer at dræne gennem fingrene. Prøv at bruge de fleste af vævet i første runde, men sørg for at det er nedsænket med buffer; hvis dette ikke er muligt, indføre forbliver uudnyttet væv ved den anden runde.
- Placer probe vævshomogenisator i vævet og homogeniseres med to pulser af 1 - 2 s hver. Filtrer homogenatet gennem to lag filtrering klud i en 250 ml centrifugerør ved forsigtig klemning. Filtratet gemmes, og overføre vævet tilbage til 50 ml-bæger.
- Placer en anden 20 ml CIB portion ind i 50 ml bæger, tilføjer resterende væv ikke brugt i den første runde af homogenisering, og gentag homogenisering og filtrering trin. Således gentage trin 3.5 og 3.6 indtil alt 100 ml CIB er opbrugt (dvs. 5 portioner af 20 ml) og kombinere de resulterende filtrater.
- Centrifuger poolede homogenat ved 1.000 x g i 5 min (bremse på) ved 4 ° C, og hældsupernatanten umiddelbart efter afslutningen af centrifugering, pas på ikke at forstyrre bundfaldet. Pellet resuspenderes i den resterende supernatant efterlades i røret ved forsigtig omrøring røret på is. Må ikke resuspender kraftigt ved pipettering eller hvirvelblanding.
- overføre forsigtigt homogenatet på toppen af den færdiglavede kontinuerlig densitetsgradient under anvendelse af en Pasteur-pipette til at anvende den via væggen i det modtagende rør. Undgå at forstyrre forløbet. Centrifuge i en svingende spand rotor ved 7.800 x g i 10 min (bremse slået fra) ved 4 ° C.
BEMÆRK: To grønne bånd kan ses i gradienten efter centrifugering: det nedre bånd indeholder intakte chloroplaster, og det øvre bånd indeholder brudte chloroplaster. - Kassér den øverste bånd ved pipettering, og derefter overføre det nedre bånd med en Pasteur-pipette til en frisk 50 ml centrifugerør, bevarer et volumen på op til 8 ml pr gradient.
- Tilføj ~ 25 ml 1x HMS buffer ind i røret og vend røret to gange to vaske Percoll fra kloroplaster. Glasset anbringes igen i svingende-bucket rotor og centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min (bremse på) ved 4 ° C.
- Hæld supernatanten og forsigtigt resuspender chloroplast pellet i de resterende HMS tilbage i røret ved forsigtig omrøring røret på is. Tilføj yderligere 100 - 300 uL af HMS om nødvendigt (baseret på størrelsen af pillen og optællingen i afsnit 4), men prøv ikke at fortynde prøven for meget.
- Hold kloroplaster på is. Hver gang før kloroplaster anvendes til efterfølgende anvendelser, ryste røret for at resuspendere dem. Brug altid et snit pipettespids (med en forstørret pore) at overføre kloroplaster.
4. Analyse af Udbytte og intakte Chloroplaster
- Tilsæt 5 pi isolerede chloroplaster til 495 pi 1x HMS puffer i en 1,5 ml rør, og derefter blandes forsigtigt ved at vende røret til opnåelse af en 1: 100 fortynding.
- Place et dækglas på toppen af tællekammeret af hæmocytometer. Langsomt pipette ~ 40 - 60 pi af den fortyndede chloroplast suspensionen ind i mellemrummet mellem dækglasset og tællekammer. Ved hjælp af en fase-kontrast mikroskop med en 10X eller 20X objektiv, intakte kloroplaster ser rundt og lyse og er omgivet af en glorie af lys.
BEMÆRK: Under mikroskopet, er der en 1 mm 2 tælling område med 25 store kvadrater, som hver indeholder 16 små firkanter i midten af tællekammer. - Tæl antallet af kloroplaster i 10 store firkanter. Antallet af kloroplaster pr store firkantede bør gennemsnit mellem 10 og 30. Hvis for få eller for mange kloroplaster er til stede, skal du justere fortyndingsfaktoren (trin 4.1) i overensstemmelse hermed, og gentag proceduren.
- Beregne antallet af chloroplaster pr ml (koncentration) som følger: n (det gennemsnitlige antal chloroplaster pr store firkantede beregnet i trin 4.3) × 25 (samlet antal store pladser) × 100 (fortyndingsfaktoren) × 10 4 (skaleringsfaktor til at udtrykke data pr 1 ml, idet volumen over de 25 kvadrater er 0,1 mm 3).
- Beregn den faktiske udbytte af kloroplaster ved at gange koncentrationen af mængden af kloroplast suspension opnået i trin 3.12. Normalt kan der opnås mere end 50 × 10 6 kloroplaster.
5. Chloroplast Protein Import
- Forbered følgende stamopløsninger:
- Forbered 10x HMS buffer: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO4 og 3,0 M sorbitol; justeres til pH 8,0 med NaOH. Forbered 50 ml af denne puffer, alikvot, og opbevares ved -20 ° C til langsigtet opbevaring og ved 4 ° C til kortvarig opbevaring.
- Forbered Import stopbuffer: 50 mM EDTA opløst i 1x HMS puffer. Forbered 50 ml af denne puffer, alikvot, og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered 2x Protein loading buffer: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (vol / vol) glycerol, 2% (vægt/ V) SDS, 0,005% (vægt / volumen) bromphenolblåt. Gør 50 ml, og opbevares ved 4 ° C. Lige før anvendelse, tilsættes 100 pi af 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) til 900 pi puffer.
- For at køre en time-kursus med 3 tidspunkter, forberede 3 rør der hver indeholder en 130 uL alikvot af import-stop buffer, og efterlade dem på is. Forbered en 450 uL import reaktion i en 2 ml rør (per genotype / tilstand). Optø alle ingredienser lige før brug.
- For én import reaktion, typisk bruge 10 × 10 6 grønkorn i A volumen pi; for eksempel, hvis chloroplast koncentrationen er 2,5 x 10 8 / ml, anvendes 40 pi chloroplast suspension. Tre tidspunkter bliver nødt 3 × A uL (dvs. 120 uL i vores eksempel).
- Bland reaktioner komponenter på is i følgende rækkefølge: destilleret vand (for at gøre det samlede volumen 600 uL), B uL 10x HMS buffer (hvor B = [600-3 × A] / 10, dvs 48 i vores eksempel), 12 uL1 M gluconsyre (kaliumsalt), 6 pi 1 M NaHCO3, 6 pi 20% (vægt / volumen) BSA, 30 pi 100 mM adenosin-5'-triphosphat magnesiumsalt (MgATP), 24 pi 250 mM methionin (ikke radioaktivt mærket ), og 30 pi forstadieprotein. Umiddelbart før start import reaktion, tilsættes 3 × En pi kloroplaster og bland ved forsigtigt at banke røret.
- Inkubér reaktionsrøret ved 25 ° C i et vandbad under 100 pmol · m - 2 · s - 1 lys. Indimellem svirp rørene at resuspendere kloroplaster.
- At gennemføre et tidsforløb, trække 130 pi prøver fra reaktionen ved de krævede tidspunkter inden for det lineære område af import, hvilket for pPsaD er op til ~ 12 min (4, 8 og 12-min tidspunkter er egnede i dette tilfælde). Det lineære område periode kan variere for forskellige proteiner 14. Således foreslås det at teste hver enkelt præprotein før at optimere than tidspunkter.
- Straks efter tilbagetrækning, overføre hver 130 uL portion til et rør af iskold import-stop buffer, blandes ved forsigtigt at banke røret, og fastholde alle rør på is indtil tidsforløbet er afsluttet.
- Centrifugeres alle prøver til 30 sekunder ved 12.000 x g i en mikrocentrifuge, kassere supernatanterne ved pipettering, og resuspender pellets i 15 pi 2x Protein lastning buffer ved hvirvelbehandling.
- Analysere alle prøverne plus pPsaD input kontrol (indeholdende pPsaD svarende til 10% af den tilsatte hver indførsel reaktion beløb, fra trin 2.7) ved standard SDS-PAGE og autoradiografi, fluorografi eller fosfor imaging 15. Brug billedanalyse software til at kvantificere og analysere resultaterne. At tilvejebringe en indikation af import effektivitet, mængden af importeret protein i forskellige genotyper / forhold kan vurderes ved at måle radioaktiviteten knyttet til hver modne bånd.
Representative Results
Et eksempel chloroplast protein import eksperiment med 3 tidspunkter er vist i figur 1. PsaD er et ~ 18 kD komponent i fotosystem I udsættes for stroma, med en precursor form for ~ 23 kD 16. PsaD blev valgt her til in vitro protein import assay fordi dens steady state niveauer er forhøjede i sp1 mutant, i forhold til WT, under stress betingelser, hvilket tyder på en ændring i sin import effektivitet i mutant 3. SP1 mutant bærer en defekt i en vigtig regulator af kloroplast protein import maskiner - SP1 protein 3. For kloroplaster isoleret fra planter dyrket under normale forhold, var der ingen tydelig forskel i PsaD import mellem SP1 og WT (data ikke vist) 3. Men ved hjælp af de metoder, der er beskrevet her, for at vurdere PsaD import i chloroplaster isoleret fra osmotiskstressede planter, blev en klar forskel opdaget. Mens vi observeret akkumulering af den modne protein form i en tidsafhængig måde med begge genotyper, satsen for import var signifikant lavere for WT kloroplaster end for SP1 kloroplaster (figur 1), hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere resultater 3, og afslører en vigtig rolle for SP1-proteinet i regulering af chloroplast import af PsaD under stressbetingelser.
Figur 1. Et Protein Import Assay Ledet hjælp Chloroplaster isoleret fra planter dyrket under Osmotiske Stress Betingelser. Chloroplaster blev isoleret fra en 10 dage gammel WT (Col-0) og en sp1 mutant Arabidopsis planter dyrket under stress betingelser (200 mM mannitol) i 2 dage. (A) Protein import blev udført ved hjælp af [35 S] -Methionine-mærket pPsaD og fik lov at forløbe i 4, 8 og 12 min før analyse ved SDS-PAGE og fosfor billeddannelse. Sideløbende hermed pPsaD 10% input kontrol bestående in vitro oversat protein (IVT) blev analyseret. Forløberen (pre) og moden (mat) former af pPsaD er angivet, mens der i mellem er der to bands, der sandsynligvis svarer til trunkerede eller proteolyseres oversættelse produkter, fordi deres intensitet ikke ændre sig under tidsforløbet (*). (B) For at sammenligne satserne for import i kloroplaster fra WT og SP1 planter dyrket under stress betingelser, blev intensiteten af hvert bånd svarer til importeret modent protein i A kvantificeret. Alle data er udtrykt i procent af mængden af importeret protein i kloroplaster fra WT planter efter 12 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har for nylig viste, at chloroplast protein import kan aktivt reguleret af stress, som er afgørende for kloroplast funktion og plante overlevelse 3. I denne undersøgelse, for at overvåge en sådan regulering, vi ændrede vores kloroplast isolation og in vitro import assay procedurer for at muliggøre en vurdering af import kapacitet af planter dyrket under stress betingelser. Resultaterne viste en vigtig rolle for SP1 i chloroplast regulering protein import.
Konventionelle in vitro import analyser anvender planter dyrket på standard MS agar medium 6,17,18. I tilfælde af SP1-mutant beskrives her, har sådanne konventionelle assays afslørede ingen forskelle i protein import i forhold til WT 3. Imidlertid er den rolle, SP1 i reguleringen protein import klart afsløret, når protein import vurderes under stress betingelser under anvendelse af de heri beskrevne metoder (Figur 1). Mens det may ikke være muligt direkte at sammenligne importere data fra stresstilstande assay med dem opnået fra traditionelle assays (som de fremgangsmåder anvender planter dyrket i flydende kultur og på agarmedium, henholdsvis), sammenligninger mellem stress og ikke-stresstilstande er mulige, forudsat at planterne alle dyrkes i det samme flydende dyrkningsmedium, med eller uden stressfaktorer.
Sammenlignet med den stress behandling på agarmedium, flydende kultur er mere bekvemt til behandling af det store antal af planter, der er nødvendige til in vitro import- assays. Desuden letter den ensartede anvendelse af stressor til alle planter, der er særligt vigtigt for kortsigtede stress behandlinger. Fremgangsmåden præsenteres her er blevet anvendt til at studere den osmotiske stress ved hjælp mannitol behandling, men kunne let tilpasses til en lang række andre stressfaktorer for eksempel kortvarig salt stress og oxidativ stress, hvor de tilsvarende stressfaktorer kunne be ligeledes påføres via flydende MS-medium. For andre typer af påvirkninger, foreslår vi graden af stress er først optimeres; overdrevent svære behandlinger kan have negative virkninger på udbyttet og / eller import kompetence isolerede organeller.
Der er flere vigtige skridt i protokollen, som man skal være særlig opmærksom, som beskrevet nedenfor.
Den optimale agarkoncentration for MS-medium kan være forskellige (0,6 - 0,9%, vægt / volumen) afhængigt af producenten. Således anbefales det at empirisk optimere agarkoncentration før påbegyndelse eksperimenter. Mediet bør ikke være så blød, at det klæber til vævet ved høst (trin 1.9), det skal heller ikke være så hårdt, at det hæmmer plante rodudvikling. Saccharosekoncentrationen kan også justeres i henhold til de planter, som anvendes. Ved arbejde med særligt syge mutanter, MS-medium suppleret med 2 - med 3% (vægt / volumen) saccharose kan hjælpe planterne vokser bedre. Når appliggende stressbehandlinger, er det ikke godt at overføre meget gamle anlæg til det flydende medium (f.eks> 14 dage gamle). Dette skyldes, at de mere udviklede rødder ældre planter er lettere beskadiget under overførsel.
Med hensyn til transkription / translationssystem, der er 2 store systemer: sådanne baseret på hvedekim, og sådanne baseret på kanin-reticulocyt. Disse kits kan bruge forskellige skabeloner, såsom lineariserede plasmider, unlinearized plasmider eller PCR-produkter. Pakkerne er også specifik for T3, T7, og SP6 promotorerne. Bemærk, at kittet anbefaler vi her er kun egnet til anvendelse med PCR-produkter og T7-promotoren. Men af ukendte årsager, nogle radioaktivt mærkede preproteins lavet med en sådan ordning kan ikke arbejde effektivt i import analysen; i sådanne tilfælde kan man overveje at forsøge en hvedekimekstrakt system eller et reticulocytlysat-system beregnet til plasmid-skabeloner. Man kan også forbedre resultatet af transkription / translation rehandling ved at modificere reaktionsbetingelserne ifølge producentens håndbog.
Det er vigtigt at starte chloroplast isolation tidligt om morgenen (eller tidligt i lyset cyklus af kammeret vækst) for at undgå akkumulering af stivelse inde i kloroplaster følge fotosyntese, der kan bremse isoleringen af intakte organeller. Proceduren for kloroplast isolation skal ske hurtigt uden unødvendige forsinkelser, og de isolerede kloroplaster skal altid holdes koldt. Dette er for at afbøde den observation, at isolerede chloroplaster vil gradvist mister deres levedygtighed, som ikke er god. Hvis du bruger nyligt optøet CIB eller HMS buffer, skal du sørge for at blande bufferen godt før brug for at opnå en homogen opløsning. De optimale betingelser for homogenisering af plantemateriale er blevet etableret empirisk, og kan variere, hvis der anvendes et andet vævshomogenisator.
Hvis de forskellige plantearter genotyper indeholder Similar klorofyl niveauer, kan klorofyl kvantificering bruges som en alternativ måde at normalisere prøverne forud for udførelsen af import- analyser. Klorofyl kan bestemmes spektrofotometrisk efter ekstraktion af en prøve af de isolerede chloroplaster i 80% (v / v) vandig acetone 19,20. Men hvis import satser af planter viser forskellige klorofyl indhold (f.eks mutanter med klorotiske fænotyper) skal sammenlignes, bruge kloroplast nummer tælle at normalisere chloroplast prøver i import- assays. Det er især vigtigt at resuspendere chloroplaster grundigt i trin 3.11. Utilstrækkelig resuspension kan efterlade aggregater af kloroplaster, hvilket vil gøre det vanskeligt at tælle tal præcist og dermed vil hindre den korrekte belastning i importpriserne reaktioner. Hvis alvorlig sammenlægning ses under mikroskop (f.eks aggregater med> 10 chloroplast sammen), fortsætte ryste kloroplast prøve på is indtil aggregates fjernes. Det er lettere at resuspendere chloroplaster i et mindre volumen buffer.
Det er vigtigt at være opmærksom på, at protein import reaktioner (§ 5), skal udføres med passende forholdsregler på grund af deres radioaktive natur. Nødvendige forholdsregler omfatter: iført engangshandsker, laboratorie tøj og sikkerhedsbriller, overvågning og dekontaminering arbejdsfladen og udstyr, og bortskaffelse af alt radioaktivt affald i en godkendt affaldsbeholder. Også huske på, at det korrekte osmotiske tryk er afgørende for at opretholde intakte kloroplaster under importen reaktioner, og det er især vedligeholdes af HMS buffer. Fordi 10x HMS er tyktflydende, skal det først varmes op til stuetemperatur, og derefter blandes grundigt, og påføres med et snit pipettespids at sikre måling af nøjagtige mængder. I import reaktion tilsættes kold methionin til at hæmme inkorporering af frit radioaktivt mærket methionin i uafhængige chloroplast proteiner gennem organellar oversættelse under inkubationen trin, mens BSA bruges til at minimere proteolyse ved at fungere som et substrat for proteaser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling til PJ fra Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC; give ref BB / K018442 / 1.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
| phytoagar | Melford | P1003 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
| triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
| surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
| filter paper | Fisher | FB59023 | |
| Percoll | Fisher | 10607095 | |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
| filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
| 250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
| Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
| Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
| centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
| fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
| fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
| swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
| radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
| rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
| phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
| haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
| cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
| microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
| Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
| gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| methionine | Sigma | M6039 | |
| bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
| glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
| SDS | Fisher | S/5200/53 | |
| Tris Base | Melford | B2005 | |
| dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
| image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |
References
- Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).
- Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses. Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).
- Ling, Q., Jarvis, P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).
- Chua, N. H., Schmidt, G. W. In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits. Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).
- Highfield, P. E., Ellis, R. J. Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase. Nature. 271, 420-424 (1978).
- Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).
- Froehlich, J. Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases. Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).
- Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts. Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).
- Kubis, S., et al. The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins. Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).
- Kubis, S., et al. Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors. Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).
- Aronsson, H., et al. Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency. Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).
- Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane. Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Aronsson, H., et al. Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves. Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).
- Aronsson, H., Jarvis, R. P. Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays. Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).
- Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma. J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).
- Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants. Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).
- Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts. Plant Cell. 14, 641-654 (2002).
- Miras, S., et al. Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast. J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).
- Nada, A., Soll, J. Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway. J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).
