Her beskriver vi en ny metode til at studere protein import til isolerede chloroplaster under stress. Fremgangsmåden er enkel og hurtig, og kan anvendes til at undersøge konsekvenserne af forskellige stressbetingelser for chloroplast-protein import, og de tilsvarende reguleringsmekanismer.
Kloroplaster er organeller med mange vitale roller i planter, som omfatter ikke blot fotosyntese men mange andre metaboliske og signalering funktioner. Endvidere kloroplaster er kritiske for vegetabilske reaktioner på forskellige abiotisk stress, såsom saltholdighed og osmotiske stress. Et chloroplast kan indeholde op til ~ 3000 forskellige proteiner, hvoraf nogle er kodet af sit eget genom. størstedelen af chloroplast proteiner er imidlertid indkodet i kernen og syntetiseret i cytosolen, og disse proteiner skal importeres til kloroplast gennem translocons på chloroplast kuvert membraner. Nylige undersøgelser har vist, at chloroplast-protein import aktivt kan reguleres af stress. Til biokemisk undersøge en sådan regulering af protein import under stress betingelser, vi udviklede den her beskrevne fremgangsmåde som en hurtig og enkel procedure, der nemt kan opnås i alle laboratorier. Ved denne fremgangsmåde er planter dyrket under normale conditions og derefter udsættes for stress forholdene i flydende kultur. Plantemateriale opsamles, og chloroplaster frigives derefter ved homogenisering. Det rå homogenat separeres ved densitetsgradientcentrifugering, hvilket muliggør isolering af de intakte chloroplaster. Kloroplast udbytte vurderes ved optælling, og kloroplast intakthed kontrolleres under et mikroskop. For protein import analyser, er oprensede kloroplaster inkuberes med 35 S radioaktivt mærket in vitro oversat precursorproteiner, og gennemføres tid-retters eksperimenter for at gøre det muligt at sammenligne import- satserne mellem genotyper under stress betingelser. Vi præsenterer data genereret ved hjælp af denne metode, som viser, at hastigheden af protein import til kloroplaster fra en regulerende mutant specifikt ændres under osmotiske stress betingelser.
Kloroplaster er meget rigelige organeller, der findes i de grønne væv i planter. De er kendt for deres kritiske rolle i fotosyntesen, en proces, der bruger lysenergi til at omdanne kuldioxid til sukker og dermed støtte næsten alt liv på jorden en. Desuden chloroplaster (og den bredere familie af beslægtede organeller kaldet plastider) spiller mange andre vitale roller i planter, herunder biosyntesen af aminosyrer, lipider, pigmenter og føling af miljømæssige signaler, såsom tyngdekraft og patogen udfordring. Fotosyntese genererer reaktive oxygenarter (ROS) som biprodukter, som under visse omstændigheder har nyttige roller, men hvis overproduceres kan forårsage skadelige eller endda dødelige virkninger. Den overproduktion af ROS er især fremmet af ugunstige miljøforhold, og dermed kloroplaster er tæt knyttet til reaktioner på abiotisk stress, såsom saltholdighed og osmotiske stress 2.
Chloroplasts har en kompleks struktur. Hver chloroplast er omgivet af en dobbelt-membran ydre lag kaldet konvolutten, der består af ydre og indre membraner. Internt er der en anden membransystem kaldet thylakoider, hvor lyset reaktioner fotosyntese foregår. Mellem de to membransystemer der er en vandig rum opkald stroma, som er involveret i kulstof fiksering. Et chloroplast kan indeholde op til ~ 3000 forskellige proteiner, og langt de fleste af disse proteiner syntetiseres i cytosolen i forstadieform og skal importeres til organel via dedikerede protein translocons i kuverten membranerne 1. Interessant, har nyere arbejde vist, at chloroplast protein import aktivt er reguleret, og så er i stand til at udøve en betydelig grad af kontrol over kloroplast proteomanalyse. For eksempel blev det rapporteret i 2015 at protein import kan reagere på abiotisk stress gennem direkte regulering af den overflod af the translocon ved den ydre kuvert membran af chloroplaster (TOC) ved ubiquitin-proteasom system 3.
Anvendelse af oprensede chloroplaster og in vitro syntetiseret precursorproteiner kan protein import rekonstitueres in vitro 4,5. Således kan in vitro-metoder anvendes til at vurdere satserne for import i forskellige mutant planter 6, hvilket har været en kritisk tilgang til analyse af formodede komponenter af proteinet import maskiner og for at opdage mekanismerne bag protein import og dens regulering. Desuden kan kloroplaster behandles med yderligere fraktionering eller protease fordøjelse, efter in vitro import, som kan lette undersøgelser af sub-organellar lokalisering og topologi chloroplast proteiner 7,8.
For at undersøge reguleringen af protein import af stress, har vi ændret vores rutine chloroplast isolation metode, som vi vil beskriveher. Vigtigere, blev chloroplaster isoleret fra planter, der var blevet dyrket på standard Murashige og Skoog (MS) agarmedium i 8 dage og derefter overført til flydende MS-medium suppleret med stressor, hvilket giver en forholdsvis kort, kontrolleret stress behandling. Udbyttet og kompetenceudvikling af kloroplaster isoleret fra sådanne stress-behandlede planter er kompatible med nedstrøms in vitro protein import assay 3. Ud over den kloroplast isolation protokol, præsenterer vi vores rutine fremgangsmåde til in vitro protein import, som har vist sig at være robust og er meget udbredt 3,9-12.
Vi har for nylig viste, at chloroplast protein import kan aktivt reguleret af stress, som er afgørende for kloroplast funktion og plante overlevelse 3. I denne undersøgelse, for at overvåge en sådan regulering, vi ændrede vores kloroplast isolation og in vitro import assay procedurer for at muliggøre en vurdering af import kapacitet af planter dyrket under stress betingelser. Resultaterne viste en vigtig rolle for SP1 i chloroplast regulering protein import.
Konventionelle in vitro import analyser anvender planter dyrket på standard MS agar medium 6,17,18. I tilfælde af SP1-mutant beskrives her, har sådanne konventionelle assays afslørede ingen forskelle i protein import i forhold til WT 3. Imidlertid er den rolle, SP1 i reguleringen protein import klart afsløret, når protein import vurderes under stress betingelser under anvendelse af de heri beskrevne metoder (Figur 1). Mens det may ikke være muligt direkte at sammenligne importere data fra stresstilstande assay med dem opnået fra traditionelle assays (som de fremgangsmåder anvender planter dyrket i flydende kultur og på agarmedium, henholdsvis), sammenligninger mellem stress og ikke-stresstilstande er mulige, forudsat at planterne alle dyrkes i det samme flydende dyrkningsmedium, med eller uden stressfaktorer.
Sammenlignet med den stress behandling på agarmedium, flydende kultur er mere bekvemt til behandling af det store antal af planter, der er nødvendige til in vitro import- assays. Desuden letter den ensartede anvendelse af stressor til alle planter, der er særligt vigtigt for kortsigtede stress behandlinger. Fremgangsmåden præsenteres her er blevet anvendt til at studere den osmotiske stress ved hjælp mannitol behandling, men kunne let tilpasses til en lang række andre stressfaktorer for eksempel kortvarig salt stress og oxidativ stress, hvor de tilsvarende stressfaktorer kunne be ligeledes påføres via flydende MS-medium. For andre typer af påvirkninger, foreslår vi graden af stress er først optimeres; overdrevent svære behandlinger kan have negative virkninger på udbyttet og / eller import kompetence isolerede organeller.
Der er flere vigtige skridt i protokollen, som man skal være særlig opmærksom, som beskrevet nedenfor.
Den optimale agarkoncentration for MS-medium kan være forskellige (0,6 – 0,9%, vægt / volumen) afhængigt af producenten. Således anbefales det at empirisk optimere agarkoncentration før påbegyndelse eksperimenter. Mediet bør ikke være så blød, at det klæber til vævet ved høst (trin 1.9), det skal heller ikke være så hårdt, at det hæmmer plante rodudvikling. Saccharosekoncentrationen kan også justeres i henhold til de planter, som anvendes. Ved arbejde med særligt syge mutanter, MS-medium suppleret med 2 – med 3% (vægt / volumen) saccharose kan hjælpe planterne vokser bedre. Når appliggende stressbehandlinger, er det ikke godt at overføre meget gamle anlæg til det flydende medium (f.eks> 14 dage gamle). Dette skyldes, at de mere udviklede rødder ældre planter er lettere beskadiget under overførsel.
Med hensyn til transkription / translationssystem, der er 2 store systemer: sådanne baseret på hvedekim, og sådanne baseret på kanin-reticulocyt. Disse kits kan bruge forskellige skabeloner, såsom lineariserede plasmider, unlinearized plasmider eller PCR-produkter. Pakkerne er også specifik for T3, T7, og SP6 promotorerne. Bemærk, at kittet anbefaler vi her er kun egnet til anvendelse med PCR-produkter og T7-promotoren. Men af ukendte årsager, nogle radioaktivt mærkede preproteins lavet med en sådan ordning kan ikke arbejde effektivt i import analysen; i sådanne tilfælde kan man overveje at forsøge en hvedekimekstrakt system eller et reticulocytlysat-system beregnet til plasmid-skabeloner. Man kan også forbedre resultatet af transkription / translation rehandling ved at modificere reaktionsbetingelserne ifølge producentens håndbog.
Det er vigtigt at starte chloroplast isolation tidligt om morgenen (eller tidligt i lyset cyklus af kammeret vækst) for at undgå akkumulering af stivelse inde i kloroplaster følge fotosyntese, der kan bremse isoleringen af intakte organeller. Proceduren for kloroplast isolation skal ske hurtigt uden unødvendige forsinkelser, og de isolerede kloroplaster skal altid holdes koldt. Dette er for at afbøde den observation, at isolerede chloroplaster vil gradvist mister deres levedygtighed, som ikke er god. Hvis du bruger nyligt optøet CIB eller HMS buffer, skal du sørge for at blande bufferen godt før brug for at opnå en homogen opløsning. De optimale betingelser for homogenisering af plantemateriale er blevet etableret empirisk, og kan variere, hvis der anvendes et andet vævshomogenisator.
Hvis de forskellige plantearter genotyper indeholder Similar klorofyl niveauer, kan klorofyl kvantificering bruges som en alternativ måde at normalisere prøverne forud for udførelsen af import- analyser. Klorofyl kan bestemmes spektrofotometrisk efter ekstraktion af en prøve af de isolerede chloroplaster i 80% (v / v) vandig acetone 19,20. Men hvis import satser af planter viser forskellige klorofyl indhold (f.eks mutanter med klorotiske fænotyper) skal sammenlignes, bruge kloroplast nummer tælle at normalisere chloroplast prøver i import- assays. Det er især vigtigt at resuspendere chloroplaster grundigt i trin 3.11. Utilstrækkelig resuspension kan efterlade aggregater af kloroplaster, hvilket vil gøre det vanskeligt at tælle tal præcist og dermed vil hindre den korrekte belastning i importpriserne reaktioner. Hvis alvorlig sammenlægning ses under mikroskop (f.eks aggregater med> 10 chloroplast sammen), fortsætte ryste kloroplast prøve på is indtil aggregates fjernes. Det er lettere at resuspendere chloroplaster i et mindre volumen buffer.
Det er vigtigt at være opmærksom på, at protein import reaktioner (§ 5), skal udføres med passende forholdsregler på grund af deres radioaktive natur. Nødvendige forholdsregler omfatter: iført engangshandsker, laboratorie tøj og sikkerhedsbriller, overvågning og dekontaminering arbejdsfladen og udstyr, og bortskaffelse af alt radioaktivt affald i en godkendt affaldsbeholder. Også huske på, at det korrekte osmotiske tryk er afgørende for at opretholde intakte kloroplaster under importen reaktioner, og det er især vedligeholdes af HMS buffer. Fordi 10x HMS er tyktflydende, skal det først varmes op til stuetemperatur, og derefter blandes grundigt, og påføres med et snit pipettespids at sikre måling af nøjagtige mængder. I import reaktion tilsættes kold methionin til at hæmme inkorporering af frit radioaktivt mærket methionin i uafhængige chloroplast proteiner gennem organellar oversættelse under inkubationen trin, mens BSA bruges til at minimere proteolyse ved at fungere som et substrat for proteaser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en bevilling til PJ fra Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC; give ref BB / K018442 / 1.).
Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
phytoagar | Melford | P1003 | |
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
filter paper | Fisher | FB59023 | |
Percoll | Fisher | 10607095 | |
ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
MgATP | Sigma | A9187 | |
methionine | Sigma | M6039 | |
bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
SDS | Fisher | S/5200/53 | |
Tris Base | Melford | B2005 | |
dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |