Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Introduction

MS ist eine menschliche Krankheit durch eine chronische Entzündung und Neurodegeneration des ZNS charakterisiert, die in Richtung Myelin gerichtet durch eine Autoimmunreaktion angetrieben wird gedacht werden. Der Verlust von Myelin und Axonen im Laufe der Zeit führen zur allmählichen Rückgang der kognitiven und motorischen Funktion ^1. "Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis" ist ein Oberbegriff für Tiermodellen von Autoimmunkrankheit zu CNS Myelin gerichtet. Wie menschliche MS wird EAE typischerweise durch Immunzellinfiltration des ZNS gekennzeichnet und in einigen Fällen Demyelinisierung ^2. Um jedoch zu der Grad zu einem gegebenen EAE-Modell menschlichen MS teil ähnelt, hängt von der Spezies oder Stamm verwendet und von der Komplexität der zugrunde liegenden anti-Myelinautoimmunreaktion.

Anti-Myelin-Autoimmunität kann experimentell auf verschiedene Weise hervorgerufen werden, aber die am häufigsten verwendete Methode ist heute Mäuse mit einem kurzen Peptid von Aminosäuren zu immunisieren, die immunodominante CD4 nachahmen 35-55), die EAE verwendet wird , ³ in C57BL / 6 - Mäusen zu induzieren. Jedoch für einige experimentelle Zwecke ist es wünschenswert oder sogar notwendig, mit größeren Proteinantigenen zu immunisieren und tatsächlich gibt mehrere Vorteile dieses über Immunisierung mit kurzen Peptid. Erstens, weil der MHC-Restriktion, sind kurze Peptide Regel nur dann wirksam, in einem sehr begrenzten Bereich von Spannungen, während größere Proteinantigene, entweder das gesamte Protein oder einen bestimmten Domäne darstellt normalerweise in mehreren Inzuchtmäusestämmen zur Präsentation verarbeitet werden kann, oder sogar in anderen Spezies ^4. Zweitens ist ein größeres Protein-Antigen in der Lage, eine komplexere Immunantwort enthält mehrere Arten von Lymphozyten in Antigenerkennung induzierende, anstatt limiting Antigen - Erkennung an CD4 ⁺ T - Zellen. Beispielsweise B-Zellen über den B-Zell-Rezeptor (BCR) interagieren direkt mit ganzen nicht prozessierten Proteins. Wir und andere haben gezeigt, dass B - Zellen durch MOG _35-55 Immunisierung aktiviert gezeigt nicht erkennen MOG - Protein ^5. Da B - Zellen ^6, die vor kurzem in der menschlichen MS gezeigt wurden Modelle EAE eine pathogene Rolle zu spielen , die B - Zellen bei Autoimmunpathologie integrieren zunehmend an Bedeutung gewinnen .

Trotz der Vorteile der größeren Protein-Antigene unter Verwendung von EAE zu induzieren, bleiben einige im Handel erhältliche Quellen für solche Proteine. Tatsächlich, während kurze Peptide wie MOG _35-55 sehr schnell synthetisiert werden kann und bei relativ niedrigen Kosten, die kommerziellen Möglichkeiten für MOG Proteins sind begrenzt und die Kosten wesentlich zu erwerben. Dennoch gibt es mehrere Expressionsvektoren für Forschungsgruppen verfügbar MOG extrazelluläre Domäne (MOG _1-125) selbst zu erzeugen. However, alle der Expressionssysteme, die in der Literatur identifiziert worden sind , auf älteren Technologien basieren , die seit mit effizienter Expressionssysteme ⁷ ersetzt wurden. Ferner sind die meisten ⁸ basierend auf Ratten- oder menschlichen MOG. Für einige Untersuchungen der Autoimmunität bei Mäusen, ein Antigen auf der Maus MOG Autoantigen basiert, ist bevorzugt. Schließlich werden alle MOG-basierten Proteine , die wir identifiziert haben, entweder kommerziell oder als Expressionsvektoren, Fusionsproteine zusätzliche Aminosäuren zum MOG _1-125 Base enthält. Dazu gehören ein Tag für die Reinigung und in der Regel andere Sequenzen als auch, von denen viele mit einer Funktion, die wir nicht in der Lage waren, zu identifizieren.

Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wir einen für ein Protein neuartige Fusion basiert auf der Maus MOG extrazelluläre Domäne an einen Tag fusionierten thioredoxin mit dem bekannten Unlösbarkeit von MOG - Protein ⁵ zu bekämpfen. Die Tag-Sequenz enthält auch eine 6xHis-Sequenz für die Reinigung und eine TEV-Protease cleAvage Seite, die für die vollständige Entfernung aller Tag-Sequenzen ermöglicht, falls gewünscht. Dies ist die einzige Methode , die wir kennen reinen MOG _1-125 Protein zu erzeugen. Zur Produktion großer Mengen an Protein zu erleichtern, wurde die MOG _1-125 - Sequenz für die bakterielle Expression-Kodon - optimierten und das MOG - _Tag - Fusionsprotein wurde in den pET-32 - Expressionssystem eingesetzt wird . Hier beschreiben wir ausführlich in das Protokoll zu erzeugen und MOG - _Tag - Protein zu reinigen und rein MOG _1-125, mit nicht spezialisierten Ausrüstung zur Verfügung zu den meisten Immunologie Laboratorien.

Protocol

1. Protein Induction

HINWEIS: In den folgenden Schritten, BL21 Escherichia coli transformierten Bakterien mit einem pET-32 Vektor , der die Sequenz für das MOG - _Tag - Fusionsprotein enthält (siehe Referenz ⁵ und Abbildung 1) zu hohen Dichten gezüchtet werden und dann das MOG - _Tag - Protein zu exprimieren induziert . Siehe Abbildung 2 für die gesamte Timeline - beachten Sie, dass die Tage sind ungefähre Angaben und alternative Haltepunkte sind im Protokoll vermerkt. Wenn mit gereinigtem pET-32 MOG - _Tag - Vektor - DNA ausgehend, wird es notwendig sein, es chemisch in kompetente BL21 E. Transformation coli - Bakterien Ampicillin - Selektion verwenden, wie bereits ⁹ gut beschrieben. Kann eine erfolgreiche Transformation durch Reinigen von DNA aus ausgewählten Bakterien unter Verwendung eines handelsüblichen Kits, durch Verdau mit den Restriktionsenzymen , gefolgt bestätigt werden Alter1 und Sac1 ¹⁰ eine 424 bp - Bande auf einem Agarosegel herzustellen.

Tag Glycerolstammlösung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 200 Umdrehungen pro Minute.
1. Platzieren zwei 1 L Erlenmeyerkolben, die 500 ml steriles LB-Brühe in einem 37 ° C Inkubator in Vorbereitung für den nächsten Tag.
2. Hinzufügen 500 ul 100 mg / ml Ampicillin zu jedem der Kolben, die 500 ml LB aus Schritt 1.2 (Endkonzentration 0,1 mg / ml Ampicillin). 1 ml der Übernachtkultur aus Schritt 1.1 bis jeder der beiden Kolben mit LB-Brühe. Inkubieren bei 37 ° C und 200 Upm für 5 Stunden oder bis zu einer optischen Dichte von 0,6.
3. Nehmen Sie eine 1-ml-Aliquot von einem der Kolben und übertragen sie in einen separaten 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen bei 16.000 × g für 1 min und entfernen Sie den Überstand. Das Röhrchen als T ₀ (pre-Induktion) und dann legte das Bakterienpellet in einen -20 ° C Gefrierschrank für zukünftige Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Analyse (§ 8 und Abbildung 3) zu sehen.
4. 0,5 ml von 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid, Isopropyl β-D-thiogalactosid (IPTG) in jede Kulturflasche. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 ° C, 200 Umdrehungen pro Minute für 4 Stunden, dann bei Raumtemperatur bei 75 Umdrehungen pro Minute über Nacht.

2. Ernte MOG - _Tag - Protein

HINWEIS: In dieser Phase werden die Bakterien große Mengen an MOG - _Tag - Protein produziert. Ernten MOG - _Tag werden die Bakterien zunächst in einem Triton X-100 - Puffer , gefolgt durch Beschallung lysiert. MOG - _Tag wird dann von inclusion bodies und denaturiert mit Imidazol und Guanidin freigesetzt, was zu einem rohen Proteinlösung die MOG - _Tag - Protein enthält.

1. Nehmen Sie eine 1-ml-Aliquot von einem der Nacht-Kulturen aus Schritt 1.5 und übertragen sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen bei 16.000 × g für 1 min und entfernen Sie den Überstand. Beschriften Sie die Wannee T _{O / N} (nach Induktion) setzen dann das Bakterienpellet in einem -20 ° C Gefrierschrank für zukünftige SDS - Page - Analyse (Abbildung 3).
2. die Kulturen gleichmäßig auf 250 ml Flaschen kompatibel mit Hochgeschwindigkeitszentrifugieren verteilen und diese vorwärts von diesem Punkt auf Eis halten. Pellet die Bakterienzellen bei 22.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
3. Überstand verwerfen. Lagern Sie die Bakterienpellets bei -20 ° C oder weiterhin 2,4 bis Schritt.
4. Vorbereitung Lysepuffer (0,1 mg / ml Hühnerei-Lysozym, 0,1% Triton-X (v / v) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)) durch Zugabe von 60 ul Triton X-100 und 120 & mgr; l von 50 mg / ml Hühnerei-Lysozym Stammlösung zu 60 ml PBS.
5. Resuspendieren und alle der Bakterienpellets aus Schritt 2.3 in insgesamt 30 ml Lysepuffer kombinieren. Übertragen Sie diese Lautstärke auf einen runden Boden 50-ml-Tube der Lage Hochgeschwindigkeitszentrifugieren. Dieses Rohr in einem 30 ° C Wasserbad für 30 min. Während der Inkubationszeit, schütteln Sie die Röhrezweimal um die Zellen zu resuspendieren.
6. Nach der Inkubation übertragen das Röhrchen auf Eis und beschallen die Lösung bei 20 kHz, Amplitude 70%, Puls auf 3 sec, Puls ab 3 Sekunden und fünf Impulse pro Runde. Beschallen die Lösung für insgesamt sechs Runden und lassen Sie die Lösung auf Eis zu kühlen in-zwischen den Runden.
7. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 24.000 × g für 15 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und wiederholen Sie die Schritte 2,5-2,7 einmal. Lagern Sie das Pellet bei -20 ° C oder weiterhin 2,8 bis Schritt.
8. Bereiten Puffer A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM Imidazol, pH 7,9) durch Zusatz von 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl und 0,01021 g Imidazol in einen 100 ml Becher. Hinzufügen H ₂ O , bis das Volumen 28 ml erreicht dann den pH - Wert der Lösung auf 7,9 einzustellen. Dann wird die Lösung in einen 100 ml Messzylinder geben und H ₂ O , bis das Volumen 30 ml ist.
9. Resuspendieren des Pellets aus Schritt 2.7 in 30 ml Puffer A und Inkubation für 3 h dieser Lösung bei 4 ° C. Während dieser Zeitabwiegen 17,2 g Guanidin-HCl.
10. Beschallen die Lösung auf Eis 2.6 die gleichen Einstellungen wie in Schritt verwendet wird. Dann fügen 17,2 g Guanidin-HCl zur Lösung. Inkubieren dies auf Eis für 1 Stunde das MOG - _Tag - Protein löslich zu machen .
11. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 24.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und Speichern der Überstand bei 4 ° C bis zur Proteinreinigung.

3. Protein Purification

HINWEIS: In den folgenden Schritten das MOG - _Tag - Protein wird durch 4 Runden Absorption auf geladene Nickel - Harz gereinigt werden (über das His-Tag) und Elution.

1. Nehmen Sie die folgenden Puffer:
   1. Bereiten Puffer B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM Imidazol, 6 M Guanidin-HCl, pH 7,9). Hinzufügen 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g Imidazol und 114,64 g Guanidin-HCl in einem 500 ml Becherglas gegeben. Dann H ₂ O hinzu , bis sie 190 ml erreicht , und den pH - Wert auf 7,9 einzustellen. Übertragen Sie das Solution in einen 250 ml Messzylinder geben und H ₂ O , bis das Volumen 200 ml beträgt.
   2. Vorbereitung Elutionspuffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M Imidazol, 6 M Guanidin-HCl, pH 7,9). Hinzufügen 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g Imidazol und 114,64 g Guanidin-HCl in einem 500 ml-Becherglas. In H ₂ O bis 190 ml erreicht und den pH - Wert auf 7,9. Die Lösung wird in einem 250 ml Messzylinder geben und H ₂ O , bis das Volumen 200 ml beträgt.
   3. Bereiten Streifenpuffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Hinzufügen 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA in einen 500 ml Becher. In H ₂ O bis 190 ml erreicht und den pH - Wert auf 7,9. Die Lösung wird in einem 250 ml Messzylinder geben und H ₂ O , bis das Volumen 200 ml beträgt.
   4. Bereiten Ladepuffer (0,1 M Nickelsulfat). In 5,257 g Nickelsulfat in einen 500 - ml - Becher und fügen H ₂ O bis 190 ml erreicht (VORSICHT, nicht behandeln NickelSulfat außerhalb einer Abzugshaube , bis das Nickelsulfat wurde in H ₂ O) gelöst. Sobald das Nickelsulfat gelöst hat, wird die Lösung in einen 250 ml Messzylinder geben und H ₂ O , bis das Volumen 200 ml erreicht.
2. Split 10 ml Nickel-Harz zwischen zwei konische 50 ml-Zentrifugenröhrchen widerstehen kann Zentrifugalkräfte über 4.500 xg (5 ml in jedem Röhrchen).
3. Laden und ins Gleichgewicht des Nickel Harz:
   1. Das Harz wird durch Zugabe von 40 ml H ₂ O zu jedem Röhrchen enthaltenden Harz. Legen Sie die Rohre horizontal auf einer Wippe und lassen Sie sie bei 4 ° C für 5 Minuten rühren. Sobald Sie fertig sind, Zentrifuge die Röhrchen bei 4.500 × g für 8 Minuten bei 4 ° C.
   2. Überstand verwerfen durch Pipettieren zu vermeiden, um das Pellet zu stören. In 40 ml Ladungspuffer in jedes Röhrchen. Übertragen Sie die Rohre auf einer Wippe und lassen Sie sie bei 4 ° C für 15 min rühren. Sobald Sie fertig sind, Zentrifuge die Röhrchen bei 4.500 × g für 8 Minuten bei 4 ° C.
4. Optional: Nehmen Sie 150 ul des solubilisierten Proteins in Schritt gesammelt 2.11 und es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Das Röhrchen als Vorinkubation und frieren diese bei -20 ° C für eine spätere SDS - Page - Analyse (Abbildung 3, Crude MOG - _Tag).
5. Reinige das MOG - _Tag Protein:
   1. Übertragen , das gesamte Volumen des solubilisierten Proteins von Schritt 2.11 (~ 40 ml, minus den kleinen in Schritt 3.4 entnommene Probe) mit dem ersten Rohr (2, Rohr 1) , die Nickel Harz aus Schritt 3.3, mischen und legen sich horizontal auf einer Wippe bei 4 ° C für 1 Stunde.
   2. Zentrifugiere die Röhrchen bei 4.500 × g für 8 min bei 4 ° C. Sobald Sie fertig sind, den Überstand in die zweiteRohr (2, Rohr 2) aus Nickel Harz und inkubieren , wie im vorherigen Schritt beschrieben. In der Zwischenzeit weiterhin, mit den Schritten 3 bis 6 unten mit Rohr 1.
   3. Resuspendieren Nickelharz in Rohr 1 in 40 ml Elutionspuffer und das Reagenzglas horizontal auf einer Wippe bei 4 ° C für 5 min. Zentrifuge dann das Röhrchen bei 4.500 × g für 8 min bei 4 ° C.
   4. Den Überstand enthalten , eluiert MOG - _Tag - Protein in einer 250 ml Flasche mit der Aufschrift "gereinigtes MOG - _Tag - Protein 'und halten diese Flasche bei 4 ° C. Mit jedem Elutionsschritt bündeln, um die resultierende Überstand in dieser Flasche.
   5. 40 ml von Streifenpuffer zu dem Nickelharz und legen sich horizontal auf einer Wippe für 5 min bei 4 ° C.
   6. Zentrifugiere die Röhrchen bei 4.500 × g für 8 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, dann laden Sie den Nickel-Harz wie in Schritt 3.3 aufgeführt.
   7. Sobald Sie fertig sind, mit dem zweiten Rohr vorwärts bewegen, wie in Schritt 3.5 aufgeführt. Insgesamt 4 Rundes der Absorption des solubilisierten Proteins von Schritt 2.11 auf den geladenen Nickelharz und Elution wird das meiste Protein obwohl erholen, falls gewünscht, zusätzliches Protein konnte in weiteren Runden der Absorption und Elution zurückgewonnen werden.
6. Nach vier (oder mehr) Runden der Absorption und Elution abgeschlossen sind, speichern Sie die gepoolten gereinigtes Protein bei 4 ° C über Nacht. Nickel Harz in 40 ml einer 20% igen Ethanollösung bei 4 ° C gelagert werden, bis sie wieder benötigt wird.

4. Messung Proteinkonzentration

HINWEIS: Bevor fortfahren es ist notwendig , die Menge an gereinigtem Protein MOG - _Tag in 3 wird verwendet , um Dieser Wert Abschnitt erzeugt zu quantifizieren das Endvolumen zu bestimmen , um das Protein am Ende des Protokolls zu konzentrieren. Wir beschreiben einen Standard-Bradford-Test hier. Die Konzentration an gereinigtem Protein MOG - _Tag wird durch Vergleich der spektralen Absorption von seriell DILUT bestimmted MOG _tag Protein mit einer Standardkurve von Rinderserumalbumin (BSA) bei einer bekannten Konzentration.

1. Machen 10x Acetatpuffer durch Zugabe von 23 ml Eisessig und 8,2 g Natriumacetat in einem 3 l Becherglas gegeben und dann fügen Sie 1,9 l H ₂ O , um das Natriumacetat zu lösen. Diese Lösung wird in einen 2 - Liter Messzylinder und fügen Sie H ₂ O , bis das Volumen erreicht 2 L. speichern Dann ist es in einem 2 - l - Flasche bei Raumtemperatur. Auffüllen auf 1 ml Acetatpuffer 1x durch Zugabe von 100 ul 10fach Acetatpuffer bis 900 & mgr; l H ₂ O.
2. eine 96-Well-Platte für Verdünnungen durch Zugabe von 30 & mgr; l 1x Acetat-Puffer in Vertiefungen G2-8 und 60 & mgr; l bis G9 ein. In 48 ul 1x Acetatpuffer zu H2 und H3.
3. Stellen Sie die Anfangs serielle Verdünnung der BSA-Standard in der Reihe G wie folgt zusammen: In 216 ul 1x Acetatpuffer und 54 & mgr; l von im Handel erhältlichen 2 mg / ml BSA-Standard in gut G1 und gründlich mischen. In 210 & mgr; l von gut G1 bis gut G2, gründlich mischen,und dann 180 & mgr; l und G2 zu gut G3 hinzuzufügen. In 150 ul gut G3 gut G4, gründlich mischen und diesen Trend von 30 & mgr; l Zugabe weniger zu jedem nachfolgenden gut bis gut G8. (Siehe Tabelle 1 für die Listen der äquivalenten Verdünnungsfaktoren).
4. Einrichten Dreifachproben von jeder Verdünnung von 10 & mgr; l gut G1 Transferieren zu den Vertiefungen A1, B1 und C1, und 10 ul gut G2 zu Mulden A2, B2 und C2, und so weiter. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette.
5. So richten Sie Verdünnungen von MOG - _Tag, fügen Sie 60 ul gereinigtes MOG - _Tag - Protein aus Schritt 3,6 bis gut H1. In 12 ul von gut H1 bis gut H2, gründlich mischen, dann fügen Sie 12 ul gut H2 zu gut H3, gründlich mischen (dies erzeugt eine 1x Verdünnung in H1, 1/5 Verdünnung in H2 und 1/25 Verdünnung in H3) .
6. Einrichten Dreifachproben für die MOG - _Tag Verdünnungen durch Übertragung 10 & mgr; l von Vertiefungen H1-H3 an Reihen D, E und F, wie in Schritt 4.4 beschrieben.
7. Mix 2 ml Protein Assay FarbstoffReagenz Konzentrat mit 8 ml H ₂ O. Mit 200 & mgr; l dieser Mischung auf alle vorbelasteten Wells in den Reihen A, B, C, D, E und F, eine Mehrkanal-Pipette, falls vorhanden. Pop alle Blasen in den Vertiefungen unter Verwendung einer Nadel, bevor die Proteinkonzentration zu lesen.
8. Innerhalb von 10 min den Farbstoff-Reagenz der Zugabe Messung der 595 nm Absorbanz von allen Wells in den Reihen A, B, C, D, E und F.
9. Verwenden Reihen A, B, und C eine Standardkurve einzurichten, in denen die Positionen 1-9 entsprechen 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 und 0 mg / ml BSA. Auf der Basis dieser Kurve wird die Konzentration von MOG - _Tag - Protein mit der Verdünnung von MOG - _Tag, der am besten die Standardkurve passt. Normalerweise wird es 200 bis 250 mg des MOG - _Tag - Protein aus 1 l Bakterienkultur unter Verwendung des Protokolls beschrieben.
   HINWEIS: Um MOG _1-125 von hier zum optionalen Abschnitt 7 am Ende des Protokolls aufgeführt vorgehen zu machen. Andernfalls fahren Sie in Abschnitt 5.

HINWEIS: Die Dialyse wird durchgeführt , um nach und nach Guanidin aus der Lösung gereinigt, vergällt MOG - _Tag enthält , entfernen Sie das Protein zu ermöglichen refold. Sorgfalt muß bei diesem Schritt ist, wie es MOG selbst sehr unlöslich ist, und während dies durch das Vorhandensein des Thioredoxin-Tag verbessert wird, ist es immer noch anfällig, aus der Lösung zu kommen. Daher erfolgt nach und nach einem relativ niedrigen MOG - _Tag Konzentration und sollte Neufaltung.

1. Vor der Dialyse beginnen, verdünne das gereinigte MOG _tag Protein mit Puffer B (Puffer B kann in Schritt 3.1 wie aufgeführt hergestellt werden) , bis die Konzentration 0,5 mg / ml oder weniger, bezogen auf die Menge des MOG - _Tag in Abschnitt 4 berechnet.
2. Schneiden Sie ca. 30 cm von Dialyseschlauch Schlangenhaut und sichern einen Ende mit einem Verriegelungs hemostat durch das Ende der Schlangenhaut über dreimal falten und das gefaltete Ende mit dem hemostat Klemm. Füllen Sie den Schlangenhaut mit verdünnterMOG - _Tag - Protein (zwischen 60 bis 90 ml MOG - _Tag - Protein pro Röhrchen) dann Luftblasen aus der Schlangenhaut entfernen , indem sie aus dem offenen Ende zu zwingen. Schließlich verschließen das andere Ende der Röhre einen zweiten Verriegelungs hemostat verwenden.
3. Wiederholen Sie Schritt 5.2 , um weitere Abschnitte von Dialyseschlauch füllen , bis alle MOG - _Tag - Protein wurde in Schlangenhaut Dialyseschlauch wurde. Achten Sie darauf, keine Lecks vorhanden sind.
4. Machen 1x acetat mit 4 M Guanidin durch Auswiegen 382,12 g Guanidin-HCl und Zugabe von 100 ml 10-fach Acetatpuffer hergestellt in Schritt 4.1 in einen 2 l-Becherglas. Mit 0,5 l H ₂ O in das Becherglas und lassen das Guanidin-HCl aufgelöst. Nach dem Auflösen wird die Lösung in einen 1 L Messzylinder geben und H ₂ O , bis das Volumen erreicht 1 L. dieses Rezept Wiederholen Sie dies für alle 2 Schlangenhäute , die erforderlich sind.
5. Führen Sie Dialyse wie folgt: Füllen Sie einen großen Eimer (mindestens 10 l) mit 1 l 1x Acetatpuffer mit 4 M Guanidin aus Schritt 5.4. Platzieren Sie oben to 2 Abschnitte Dialyseschlauch MOG - _Tag in den Eimer enthält, Raum für einen Magnetrührstab verlassen im Boden ungehindert zu drehen. Setzen Sie den Eimer in einem 4 ° C Raum auf einer magnetischen Rührplatte und schalten Sie es zu einem langsamen Drehgeschwindigkeit (dh nicht hoch, gerade genug , um die Flüssigkeit zu bewegen):
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden, um allmählich die Menge an Guanidin in dem Puffer zu reduzieren. Stir Zeiten werden als Minimum angegeben, kann aber über Nacht stehen gelassen werden. Die Dialyse wird ein Minimum von 3 Tage dauern, kann aber verlängert werden, falls gewünscht. machen Kontrollieren Sie regelmäßig sicher, dass der Schlauch intakt ist und dass die Enden fest geschlossen sind.
   1. Lassen Sie den Eimer sitzen und rühren für 4-5 Std.
   2. 1 l 1x Acetatpuffer (100 ml 10x Acetatpuffer und 900 ml H ₂ O) an jedem Eimer.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1 und 5.5.2 insgesamt 3-mal für insgesamt 4 l Puffer in den Eimer.
   4. Entsorgen Sie die Hälfte des Puffers in den Eimer und füllen mit 1 l 1x Acetatpuffer (100 ml 10 - fach - Acetat - Puffer und 900 ml H ₂ O, kein Guanidin) und den Schlauch und Rührstab eingerichtet.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1 und 5.5.2 einmal ( das heißt , bis es insgesamt 4 l Puffer in dem Eimer ist).
   6. Schließlich ersetzen Sie die gesamte 4 l Volumen in den Eimer mit 4 l frischem Acetatpuffer 1x und lassen Sie rühren für 4-5 Std. Für beste Ergebnisse, tun Sie diesen Schritt am Tag der Proteinkonzentration.
   7. Die Dialyseschläuche mit neu gefaltet MOG - _Tag vorsichtig entfernen und Eimer Puffer zu verwerfen.

6. Concentrating MOG - _Tag - Protein

Hinweis: Im letzten Schritt, rückgefaltetem MOG _tag Protein an die Arbeitslösung für die Lagerung eingeengt. Als MOG - _Tag sehr unlöslich ist, sollte es nicht mehr als 5 mg / ml. Diese Konzentration ist etwa äquimolaren mit 0,4 mg / ml MOG _35-55 Peptid, das EAE üblicherweise verwendet wird , in Mäusen (mixed 1 zu induzieren: 1 mit komplettem Freund'schem adjuvant (CFA)). Während des Konzentrationsprozesses ist es nicht ungewöhnlich, dass eine kleine Menge von Protein aus der Lösung in Form von weißen Niederschlag zu kommen. Übermäßige Fällung ist jedoch ein Problem.

1. Berechne die endgültige gewünschte Volumen ein MOG - _Tag - Konzentration von 5 mg / ml zu erreichen, basierend auf dem Wert berechnet wird in Abschnitt 4.
2. Linie eine Pfanne mit Aluminiumfolie und decken die Aluminiumfolie mit Polyethylenglykol (PEG) 3350 und PEG 8000 in einem Verhältnis 1: 1. Das PEG 3350 wird in diese Mischung eingebracht , wie es die Proteinaggregation während der Konzentration helfen kann verhindern , und ist eine effektive cyropreservative ^11.
3. Setzen Sie den Schlangenhaut Schlauch (mit MOG - _Tag - Protein innen) auf der Oberseite der Aluminiumfolie und Deckel mit PEG 8000. Lassen Sie diese sitzen bei Raumtemperatur und überprüfen Sie die Lautstärke regelmäßig , bis das Volumen auf oder unter dem geschätzten endgültigen Volumen gleich (in Schritt berechnet 6.1) wird das tatsächliche Volumen in dem nächsten Schritt gemessen werden. Wenn die Pfanne wirdmit Wasser während des Konzentrationsprozesses übersättigten, eine frische Pfanne mit Aluminiumfolie und PEG 3350 und PEG 8000 eingerichtet.
4. Waschen Sie die Außenseite der Schlangenhäute mit H ₂ O und übertragen Sie die MOG - _Tag - Protein in eine separate Glasflasche eine serologische Pipette. Verfolgen Sie die Lautstärke wie das Protein das Volumen, um sicherzustellen, übertragen wird korrekt ist.
   1. Wenn das Volumen unter dem geschätzten endgültigen Volumen reduziert wurde, fügen Sie 1x Acetatpuffer, bis die gewünschte Lautstärke erreicht ist. Wenn das Volumen über dem geschätzten Gesamtvolumen ist, übertragen Sie den _Tag MOG - Protein wieder in den Dialyseschlauch und weiterhin die Konzentration (Schritte 6,2-6,3).
   2. Verteilen Sie das MOG - _Tag - Protein unter 1,5 - ml - Röhrchen (0,5 ml pro Röhrchen), die Gefäße bei -80 ° C bis benötigt. Zur Induktion von EAE, mischen dieses Volumen 1: 1 mit CFA.
5. Ausführen eines SDS - PAGE - Gel , die Expression des MOG - _Tag - Protein unter Verwendung der Proben , die in den Schritten 1 genommen , um zu bestätigen.4, 2.1, 3.4, und das gereinigte Protein MOG aus Schritt 6.4.

7. Generieren von MOG _1-125 von MOG - _Tag TEV Protease (Optional)

Hinweis: dieser optionale Schritt weiterhin aus dem Ende von Schritt 4. Wenn MOG _1-125 ohne zusätzliche Tag - Sequenzen benötigt wird, können die Tag - Sequenzen unter Verwendung von TEV - Protease (Figur 4) entfernt werden. Soweit uns bekannt ist, gibt es kein anderes Expressionssystem erzeugen kann reines MOG _1-125. Es sollte jedoch angemerkt werden , dass ohne die Thioredoxin - Tag, MOG _1-125 stark unlöslich ist , und dies kann zu Problemen bei der Reinigung und Handhabung verursachen, und aus diesem Grund das Tag , wenn es unbedingt erforderlich , aus experimentellen Gründen zu entfernen. Mehrere Schritte sind erforderlich , reine MOG _1-125 zu erzeugen. MOG - _Tag wird zuerst in TEV - Protease - Spaltungspuffer dialysiert. Nach der Verdauung mit TEV-Protease wird das Volumen mit späteren Reinigung st zu unterstützen reduzierteps, dann in Puffer B dialysiert, und dann wird das His-Tag enthält Markierungssequenz nickel Harz entfernt werden. Schließlich Protein wird quantifiziert und reine MOG _1-125 wird auf die Endkonzentration konzentriert.

1. Auffüllen auf 1 l 10fach TEV-Spaltungspuffer (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) durch Zugabe von 1,861 g EDTA, 44,4 g Tris-HCl und 26,5 g Tris in einen 2 l-Becherglas. In H ₂ O , bis das Volumen 990 ml erreicht dann den pH - Wert auf 8 , um das EDTA zu lösen. Die Lösung wird in einen 1 - Liter - Messzylinder und bringen das Volumen bis zu 1 L mit H ₂ O.
2. Verdünnte MOG - _Tag - Protein aus Schritt 3,6 bis 0,5 mg / ml Puffer B unter Verwendung von (dem gleichen Puffer in Schritt 3.1 beschrieben), bezogen auf die Menge an Protein in Abschnitt berechnet 4. Übertragung 120 ml verdünntem MOG _tag Protein Schlangenhaut Schlauch Dialyse wie beschrieben in Schritten von 5,2 bis 5,3. Das Volumen kann die Menge der TEV - Protease jedoch skaliert werden benötigt , um alle der MOG - _Tag - Protein zu spalten wird substantial.
3. Folgen Sie Protokoll, um die Dialyse aufgelistet in Schritt 5.5, außer mit 10-fach TEV-Spaltpuffer der 10-fach-Acetat-Puffer ersetzen in Schritt 7.1.
4. Übertragen Sie die MOG - _Tag, jetzt in TEV Spaltungspuffer, auf eine neue 250 - ml - Glasflasche und überwachen das erhöhte Volumen von Dialyse. 1 & mgr; l β-Mercapto-ethanol pro jede 2,85 ml MOG - _Tag - Protein in die Flasche gegeben. Fügen mindestens 1 mg TEV - Protease (TEV Lager Lösung bei 5 mg / ml) für jede 50 mg des MOG - _Tag - Protein (TEV Protease zu 1:10 TEV aufaddiert werden können: MOG - Protein - Verhältnis) und Inkubieren bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt mindestens 72 Stunden für.
   HINWEIS: Am Ende der TEV Protease inkubiert, weiße Niederschläge am Boden der Glasflasche gesehen werden sollte.
5. Bevor das Protein in einen Dialyseschlauch übertragen, Guanidin-HCl zu der Lösung hinzu, bis die Proteine ​​das Protein vom Kleben an der Glasflasche um Präzipitate zu verhindern aufzulösen. Übertragung von 150 uldiese Lösung auf einem Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml und das Rohr als "MOG mit TEV" beschriften. Lagern Sie die Lösung bei -20 ° C für zukünftige SDS-PAGE-Analyse.
6. Übertragen, die gesamte Flüssigkeit aus Schritt 7.5 in Rohr Dialyse als 5,2-5,3 in Schritten aufgeführt. Füllen Sie einen großen Eimer mit 2 l H ₂ O und legen Sie die Dialyseschlauch in den Eimer. Inkubieren dies bei 4 ° C mit Licht über Nacht gerührt wurde. Dieser Schritt ist wichtig, das Guanidin zu verdünnen out die Proteinkonzentration zu ermöglichen, schnell auf, und das EDTA aus der Lösung entfernt zu beginnen, die mit der Proteinreinigung stören.
7. Konzentriere das Protein in den Schlauch Dialyse wie in den Schritten 6,2-6,3 aufgeführt (mit Ausnahme nur verwenden PEG 8000), so daß das Endvolumen der Lösung beträgt ~ 40 ml. Waschen Sie die Dialyseschlauch mit H ₂ O und entfernen jegliche restliche PEG 8000 noch mit dem Rohr befestigt. Diese Volumenreduktion ermöglicht es, das gesamte verdaute Protein in einen 50-ml-Röhrchen passen Nickel re enthält,sin, wie in Schritt 3.5 beschrieben.
8. Dialysiere die verdaute Protein zu Puffer B:
   1. Füllen Sie einen großen Eimer mit 1 l Puffer B (29,22 g NaCl, 3,152 g Tris-HCl, 0,3405 g Imidazole, 573,18 g Guanidin-HCl, pH 7,9).
   2. Platzieren Sie die Schlangenhäute enthält verdauten Protein aus Schritt 7.7 in den Eimer zusammen mit einer stir Magneten (wie detaillierter in Schritt 5.5 beschrieben). Setzen Sie den Eimer in einen 4 ° C kalten Raum auf einer Rührplatte zu einem langsamen rühren gesetzt und lassen Sie die Schlangenhäute für 5 oder mehr Stunden dialysiert.
   3. Leeren Sie den Eimer und füllen Sie ihn mit einem anderen 1 l Puffer B und lassen diese in der 4 ° C kalten Raum auf einer Rührplatte zu einem langsamen rühren gesetzt sitzen und lassen Sie die Schlangenhäute für 5 oder mehr h dialysiert.
9. Führen Sie die Reinigung des MOG _1-125 - Protein , wie in Abschnitt 3, mit dem wichtigen Unterschied , detailliert , dass die gespaltenen Tag - Sequenzen werden durch die Nickelharz gebunden werden, MOG verlassen _1-125 in Lösung. Auch hier werden vier Runden der Reinigung seinauf dem gleichen Volumen durchgeführt, aber in diesem Fall ist das Ziel Reinheit zu verbessern, und nicht so viel Protein wie möglich wiederherzustellen. Siehe Abbildung 4.
   1. Nehmen Sie die Proteinreinigung Puffer in Schritt 3.1 aufgeführten
   2. Aufladen beide Rohre aus Nickel-Harz, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
   3. Reinige MOG _1-125 durch das Protokoll detailliert in Schritt 3.5, mit der wesentlichen Ausnahme , dass das Eluat aus der Nickelharz Tag verworfen (keep 150 ul des Eluats in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für zukünftige SDS-PAGE - Analyse), während die Lösung enthält MOG _1-125 wird als Endprodukt erhalten.
10. Messen Sie die Konzentration von MOG _1-125 Protein , wie in Kapitel 4:
    1. Stellen Sie die BSA-Standardkurve Verdünnungen wie in Schritten 4.2 und 4.4 beschrieben.
    2. Stellen Sie die Verdünnungen von MOG _1-125 bis wie in den Schritten 4.5 und 4.6 beschrieben. Alternativ kann es nützlich sein, eine größere Reichweite zu erzeugenVerdünnungen (1x, 1/2, 1/4 und 1/8, zum Beispiel). Einstellen von Lautstärke von 1x Acetatpuffer und MOG _1-125 entsprechend.
    3. Führen Sie die Bradford - Assay wie in den Schritten von 4,7 bis 4,9 und berechnen Sie die Menge von MOG erzeugt _1-125 beschrieben. Die erwartete Rendite beträgt etwa 4 mg oder mehr Protein.
11. Refold MOG _1-125 durch schrittweise Entfernung von Guanidin über Dialyse, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
12. Konzentrat MOG _1-125 Protein , wie in Abschnitt 6 beschrieben Die Endkonzentration sollte 2,24 mg / ml, sein , die bis 5 mg / mL MOG - _Tag äquimolare ist.

8. SDS-PAGE - Gel zu bestätigen MOG - _Tag Produktion und Reinheit

HINWEIS: Die Proben aus den Schritten 1.4, 2.1, 3.4, aufgenommen und 6.4 werden durch Standard - SDS-PAGE analysiert , um MOG - _Tag Produktion und Reinheit zu bestätigen. Dieser Schritt sollte nach der letzten Reinigung von entweder MOG - _Tag oder MOG _1-125 durchgeführt werden.

<li> Erstellen Sie eine 2x SDS-PAGE - Ladepuffer durch Zugabe von 1,576 g Tris-HCl auf 2 ml H ₂ O und stellen Sie den pH - Wert auf 6,8. Hinzufügen , 0,4 g SDS in die Tris-HCl - Lösung und dann H ₂ O hinzu , bis das Volumen 7 ml erreicht.
1. Hinzufügen 0,2 g Bromphenolblau bis 10 ml H ₂ O , dann 1 ml dieser zu der Lösung in Schritt 8.1 hergestellt. Schließlich, fügen Sie 2 ml Glycerin die 2x SDS-PAGE-Ladepuffer zu beenden. Wenn diese Lösung Lagerung bei 4 ° C zu halten und sie vor Licht zu schützen für bis zu 3 Monate.
2. Auftauen der gefrorenen Aliquots von Bakterien aus den Schritten 1.4 und 2.1 sowie dem solubilisierten MOG - _Tag - Protein aus den Schritten 3.4 und 6.4 bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie die Salze aus den in den Schritten gesammelt Lösungen 3.4 und 6.4 durch Zugabe von 60 & mgr; l von jedem zu Protein Entsalzungssäulen. Reinige die Proteine ​​Anweisungen des folgenden Herstellers.
4. Geben Sie 20 & mgr; l β-Mercapto-ethanol ad 1 ml der Lösung in Schritt 8.2 hergestellt. Werden 40 ul dieser auf die beiden bacterial Pellets aus Schritt 8.3 und 60 & mgr; l zu den entsalzt Proteine ​​aus Schritt 8.4 und diese für 10 min bei 95 ° C inkubieren.
5. Machen 1x SDS Laufpuffer Seite durch Auswiegen von 5 g Tris, 28,8 g Glycin und 1 g SDS. Fügen diese zu einem 1 L Becherglas und fügen 500 mL H ₂ O , alles zu lösen. Nach dem Auflösen wird die Lösung in einen 1 L Messzylinder und füllen mit H ₂ O , bis das Volumen 1 L. erreicht
6. Einrichten dann ein 12% Polyacrylamid-Gel in einem Gel-Vorrichtung die 1x SDS-PAGE-Laufpuffer zum Gel Vorrichtung hinzuzufügen, so dass der Laufpuffer unmittelbar oberhalb der Oberseite der Vertiefungen in dem Gel ist. Waschen Sie die Vertiefungen des Gels durch Pipettieren von 50 ul jeder Puffer in die Vertiefungen fünfmal ausgeführt wird.
7. Last 10 ul Protein Leiter in die erste Vertiefung und dann werden 10 ul der gekochten Lösungen aus Schritt 8.5 Vertiefungen zu separieren. Führen Sie das Gel bei 115 V für 60 min.
8. Entfernen Sie das Gel aus dem Gerät und überträgt es auf einen kleinen Behälter. Füllen Sie den container mit 100 ml reinem H ₂ O und Transfer für 8 Minuten , den Behälter zu einer langsam rotierenden Plattform. Nach dem 8 min, Dump das Wasser und waschen Sie das Gel zweimal mit H ₂ O
9. Dump das H ₂ O aus dem Behälter und mit 100 ml schnellen stain Reagenz in den Behälter. Lassen Sie diese über Nacht auf einer langsam rotierenden Plattform zu sitzen, mit Alufolie abdecken.
10. Dump die schnelle Fleck Reagenz und fügen Sie ca. 100 ml H ₂ O in den Behälter. Erlauben diese auf einer rotierenden Plattform für 8 min zu sitzen. Dump die H ₂ O und wiederholen Sie den H ₂ O - Waschung zweimal.
11. Bild das Gel einen Imager für Coomassie-Blau Flecken verwenden. Suchen Sie nach einer Band um 31.86 kDa (MOG - _Tag - Protein) und eine schwächere Bande bei 63,72 kDa (MOG - _Tag - Dimere).

Representative Results

Nachdem die Reinigung abgeschlossen ist, gesammelten Proben in den Schritten 1.4, 2.1, 3.4, und das Endprodukt aus Schritt 6.4 sollte auf einem Proteingel (3A) betrieben werden. MOG - _Tag sollte zuerst erscheinen als 31,86 kDa - Bande in der T _{O / N} Probe, aber nicht ₀ T, und sollte die einzige Band in der letzten reinen Produkt. Um zu testen , ob das MOG - _Tag - Protein korrekt gefaltet ist, kann das MOG - _Tag - Protein verwendet werden MOG-Protein - spezifischen B - Zellen durch FACS zu etikettieren. Durch Markierung Maus - Lymphozyten mit einer 1: 1.000 - Verdünnung von MOG - _Tag zusammen mit einem sekundären Antikörper , der gegen das His-Tag und einem fluoreszierend markierten tertiären Antikörper anti-IgG1, MOG-spezifische B - Zellen identifiziert (3B) werden. Alternativ kann MOG - _Tag direkt mit Fluorophoren konjugiert werden Hintergrundfärbung zu reduzieren ( die aus B - Zellen in den sekundären und tertiären Antikörper binden) , wiein Bezug auf ⁵ beschrieben MOG-spezifischen B - Zellen zu identifizieren. Dies ist notwendig , wenn man versucht , MOG-bindende B - Zellen in Wildtyp - Mäusen zu identifizieren, da diese Zellen sind in der Regel sehr selten ^5. IgH ^MOG Mäuse haben eine schwere Kette Knockin die, wenn sie mit einem geeigneten leichten Kappa - Kette gepaart, Spezifität für MOG verleiht. Da die Bindung von MOG - _Tag unter den IgH ^MOG B - Zellen verstärkt wird, bestätigt dies , dass dieses Protokoll eine richtig gefalteten Antigen erzeugt. Wichtig ist , beitragen IgH ^MOG B - Zellen zu Autoimmunpathologie in Modellen der MOG-EAE ¹² gerichtet, was bestätigt , dass MOG - _Tag sowohl T als auch B - Zell - Autoimmunität induziert.

Vor der Dialyse ausgehend das Protein rückzufalten , wie in Abschnitt 5 beschrieben, ist es notwendig , die Proteinkonzentration unter Verwendung eines Bradford - Test gemessen, wie in Abschnitt 4. Repräsentative Ergebnisse eines Bradford - Assays sind in Tabelle 1 gezeigt Abbildung 5 zusammengefasst.

Die Erzeugung von reinem MOG _1-125 wird durch die Zugabe von TEV Protease zu MOG - _Tag - Protein , was zur Spaltung des MOG - _Tag - Proteins in MOG _1-125 und Tag - Sequenz schließlich erreicht , wie in 6 gezeigt. Anschließende Nickelharz Reinigung entfernt MOG _Tag, Tag - Sequenz und Protease TEV Verunreinigungen letztlich in reiner MOG _1-125 führt , wie in Abbildung 6 gezeigt.

Abbildung 1: MOG - _Tag - Protein (duplizierte hier mit freundlicher Genehmigung von Dang et al . ^5.).. Lineare Struktur und Aminosäure- und DNA - Sequenzen des MOG - _Tag - Fusionsprotein. Die DNA-Sequenz für die extrazelluläre Domäne von Maus-MOG (MOG1-125, untere Sequenz in blau) wurde in Bakterien (schwarz für die Expression codon-optimiert). Diese Sequenz wurde synthetisiert und in einen Vektor , der eine N-terminale Fusion mit einem Thioredoxin - Tag enthält und eine S-Tag zu erzeugen , das bekannte Unlöslichkeit des MOG - Protein ^13,14 sowie einen 6x His Tag zur Aufreinigung ¹⁵ entgegenzuwirken. Eine TEV - Protease - Spaltstelle trennt die MOG _1-125 aus den Tag - Sequenzen. TEV-vermittelte Spaltung zwischen Glutamin-164 und Glycin-165 eine alternative Konsens TEV - Spaltstelle ¹⁶ Ergebnisse bei der Entfernung aller nicht-MOG Aminosäuren verwendet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Übersicht über die erforderlichen Schritte reinen MOG - _Tag - Protein zu produzieren , um.MOG - _Tag - Protein, Bakterien exprimieren , das MOG - _Tag - Protein erzeugen zu hohen Dichten gezüchtet werden dann MOG - _Tag induziert mit IPTG zum Ausdruck bringen , wie in Abschnitt 1. Nach einer Nacht - Kultur aufgeführt, werden die Bakterien lysiert und durch eine Reihe von Pelletierung Schritte der Proteinfraktion enthält , Einschlusskörper, die MOG - _Tag enthält, extrahiert wird , wie in Abschnitt 2. MOG - _Tag aufgeführt wird dann aus dem rohen Proteinfraktion gereinigt durch vier Zyklen der Absorption auf geladene Nickel - Harz und die Elution des Proteins MOG - _Tag , wie in Abschnitt 3. Ein Teil aufgelistet der vereinigten Eluat dann für einen Bradford - Assay genommen wird , um die Ausbeute von MOG - _Tag - Protein und den Rest des Eluats zu bestimmen , wird in Acetatpuffer über den Verlauf von mehreren Tagen dialysiert , wie in den Abschnitten 4 und 5 aufgeführt Schließlich wird das Protein aufkonzentriert Verwendung von PEG 3350 und PEG 8000 auf eine Endkonzentration von 5 mg / ml bezogen auf die Ausbeute von MOG - _Tag in der B bestimmtradford Test, wie in Abschnitt 6. Der gesamte Prozess aufgeführt sind, können mindestens 10 Tage in Anspruch nehmen, mit dem Starttag für jeden Schritt in Klammern angegeben. Allerdings sind alternative Stopp- und Startpunkte im Protokoll aufgeführt sind , und Schritte , um eine größere Menge an Zeit kann sich auf , falls gewünscht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig . 3: Reinigung des MOG - _Tag - Protein und Beurteilung seiner Aktivität (A) gezeigt , sind Protein - Proben , die von verschiedenen Punkten auf der Proteinreinigungsverfahren wurden gesammelt und auf einem SDS-PAGE - Gel. T ₀ = BL21 - Bakterien vor der Proteininduktion (gesammelt in Schritt 1.4), T _{O / N} = BL21 - Bakterien nach der Induktion der Proteinexpression (fangenin Schritt 2.1), Crude MOG _tag = _Tag solubilisiertes MOG - Protein vor der Proteinreinigung (in Schritt gesammelt 3.4), reine MOG _tag = MOG - _Tag - Protein nach der Reinigung (in Schritt gesammelt 6.4). (B) Die Bindung des MOG - _Tag - Protein CD19 ^pos CD4 ^neg naive B - Zellen aus Lymphknoten von entweder Wildtyp C57BL / 6 - Mäuse oder IgH ^MOG Mäuse , die eine schwere Immunglobulin - Kette spezifisch für MOG - Protein exprimieren ^7,17 wurde mit bewertet Durchflusszytometrie . MOG - _Tag -spezifische B - Zellen wurden durch Anfärben Lymphknotenzellen mit MOG - _Tag von einem sekundären anti-His - Tag - Antikörper und einem fluoreszierenden tertiären anti-IgG1 - Antikörper , gefolgt identifiziert. Anfärben von Zellen aus C57BL / 6 oder IgH ^MOG Mäuse zusammen mit einem MOG - _Tag Fluoreszenz minus eins (FMO) Steuer Fleck von IgH ^MOG - Zellen gezeigt. Bitte clecken hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4: Übersicht über die Schritte zur Erzeugung MOG _1-125 von MOG - _Tag - Protein. Nach dem MOG - _Tag Eluat zu sammeln , wie in Schritt 3.5 des Protokolls beschrieben, wird das MOG _tag Protein in TEV - Protease - Spaltungspuffer dialysiert. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, wird TEV - Protease auf die MOG - _Tag - Lösung gegeben bei der Spaltung von MOG - _Tag in das Protein MOG _1-125 führt. Das Volumen der Spaltlösung wird dann reduziert und in den Puffer B vor der Proteinreinigung dialysiert. Verunreinigungen von der Spaltlösung werden durch vier aufeinanderfolgende Runden der Absorption auf geladene Nickelharz und Elution der Verunreinigungen letztlich zu einer Lösung von reinem MOG extrahiert < sub> 1-125. Die Konzentration des MOG _1-125 - Proteins wird durch einen Bradford - Assay bestimmt und das Protein wird im Laufe von mehreren Tagen durch die Dialyse gefaltet. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, wird das MOG _1-125 Protein auf 2,24 mg / ml konzentriert PEG unter Verwendung von 3350 und PEG 8000. Dieses Protokoll im Detail im Abschnitt diskutiert 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Beispiel für eine Kurve Bradford - Assay - Standard für die Konzentration von MOG _tag Bestimmung Protein. BSA - Standard aus Tabelle 1 Lesungen wurden aufgetragen , um die MOG - _Tag Konzentration auf die optische Dichte bei 595 nm anhand einer linearen Regressionsformel zu erhalten für die Berechnung.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abb . 6: TEV - Spaltung von MOG - _Tag - Proteins und anschließender Reinigung des MOG _1-125 Gezeigt sind Proteinproben auf SDS-PAGE - Gel Demonstrieren Reinigung von MOG _1-125 ausführen Reines MOG _tag = MOG _tag Protein vor Spaltung TEV _(gesammelt. in Schritt 6.4), MOG - _Tag w / TEV = Proteinfraktion , die nach 72 Stunden Inkubation von MOG - _Tag mit TEV - Protease ( die in Schritt 7.5) gesammelt wurde, Elution = Proteinfraktion, die dem Nickel Harz während der MOG gebunden blieb _{1- 125} Reinigungsprotokoll ( die in Schritt 7.9), reine MOG _1-125 = MOG1-125 Protein nach der Reinigung (in Schritt 7.12 gesammelt). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

BSA (mg / ml)	0,4	0,35	0,3	0,25	0,2	0,15	0,1	0,05	0
	1,079	0,998	0,948	0,853	0,769	0,699	0,583	0,493	0,373
	1,071	1,014	0,95	0,854	0,777	0,681	0,579	0,484	0,375
	1,069	1,017	0,944	0,848	0,781	0,592	0,494	0,374
MOG - Tag Verdünnung	1	1/5	1/25
	1,327	1,013	0,493
	1,332	1,063	0,491
	1,367	1,088	0,488

Tabelle 1: Repräsentative Werte aus einem Bradford - Assay zur Bestimmung der Konzentration von MOG _tag Protein BSA Dilu.gen in bekannten Konzentrationen zur Bestimmung der Standardkurve in Abbildung 5. Die Verdünnungen von MOG _tag Protein Post Reinigung der endgültigen MOG - _Tag die Proteinkonzentration zu bestimmen , werden verwendet , gezeigt ist, verwendet. Zeilen enthalten die optische Dichte bei 595 nm gemessen und jede Zeile stellt eine Wiederholung von insgesamt 3 Wiederholungen bei jeder angegebenen Konzentration.

Discussion

Hier haben wir ein Protokoll für die Herstellung von MOG - _Tag - Protein beschrieben und wie zur Erzeugung reinen MOG _1-125 aus dem MOG - _Tag - Protein. Dieses Protokoll wird sowohl anhand His-Tag - basierte Proteinreinigungsverfahren auf Standard sowie einem zuvor beschriebenen Protokoll für die Erzeugung eines älteren MOG-basierten Protein - ^15. Obwohl es hier nicht beschrieben wird, ist die primäre Verwendung des MOG - _Tag - Protein EAE durch Immunisierung mit Protein - Antigen zu induzieren. Ein Protokoll , das beschreibt , wie EAE in Mäusen induziert, die mit dem MOG - _Tag - Protein - kompatibel ist, kann in Bezug auf ³ zu finden. Wir haben zuvor gezeigt , dass die Immunisierung mit MOG - _Tag oder MOG _1-125 von MOG abgeleiteten _tag nicht nur mit größerer Rückenmark Entzündung und Demyelinisierung im Vergleich zum Standard MOG _35-55 - Peptid, sondern auch , dass pathogene IgH ^MOG B - Zellen CNS Autoimmunkrankheit induziert That erkennen MOG - Protein aktiviert eine Keimzentrum Reaktion als Antwort auf MOG - _Tag oder MOG _1-125, zu produzieren , aber nicht _35-55 ⁵ bis MOG. Daher wird die Immunisierung mit MOG - _Tag in der Tat eine geeignete Anti-MOG B - Zell - Antwort induzieren.

MOG - _Tag - Protein wird durch Absorption auf geladene Nickel - Harz gereinigt (über das His-Tag) und Elution. Wegen der großen Menge an Protein in den vorherigen Schritten erzeugt werden, mehrere Runden der Absorption und Elution erforderlich, der größte Teil des Proteins zu sammeln. Wir haben, dass, wenn ein geeignetes Volumen des Harzes für 50 ml Röhrchen unter Verwendung mindestens 4 Runden erforderlich sind, zu isolieren, die Mehrheit der Protein gefunden. Falls gewünscht, könnte das Protokoll skaliert werden mehr oder größere Rohre und Nickelharz zu verwenden, um die Anzahl der Runden der Absorption zu verringern. Alternativ kann Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit Nickel Spalten effektiv his-markierte Proteine aufzureinigen ^{18 <}/ sup> und in der Tat haben wir herausgefunden , dass HPLC effizient MOG - _Tag - Protein (nicht veröffentlichte Beobachtungen) reinigen kann. Als HPLC nicht zugänglich zu vielen Standard-Immunologie Labors ist, hier das Protokoll aufgeführt ist um gemeinsame Laborgeräte durchgeführt werden. Neben His-Tag Reinigung, funktioniert das MOG - _Tag - Protein eine S-Tag enthalten , die mit S-tag Reinigungsprotokollen kompatibel ist , wenn ¹⁴ bevorzugt.

Rekombinante Proteine auf Basis von MOG (meist von Mensch oder Ratte) wurden zuvor ⁸ beschrieben. Diese wurden anhand von älteren Expressionssysteme, die da durch Systeme ersetzt wurden durch stärkere Transkriptionspromotoren angetrieben erzeugen können größere Mengen an Protein in Escherichia coli - Bakterien. Unser MOG - _Tag - Expressionssystem verwendet den effizienten T7 - Promotor in den pET-32a (+) Vektor, der im Haus zur Verfügung für die Produktion ¹⁹ von MOG - Protein wesentlich effizienter als Systeme ist. Aber es isthould beachten, dass der _Tag - MOG - Protein hier beschriebenen basiert auf Maus MOG. Die Immunisierung mit menschlichem MOG - Protein wurde gezeigt , EAE in Mäusen zu induzieren , die unterschiedliche Funktionen im Vergleich zu Krankheit hat induzierte Maus mit MOG ^8. Ferner kann Ratte MOG immunogener sein als Maus MOG bei Mäusen in einigen Fällen ^20. Daher wird für einige experimentelle Zwecke Maus-basierte MOG - _Tag kann nicht ideal sein. Wir sind dabei , mehrere andere Version des MOG - _Tag - Protein zu erzeugen , als einige Zwecke besser entsprechen können, und das Reinigungsprotokoll wird hier für alle diese beschrieben arbeiten. In der Zwischenzeit ist es möglich, dass das Reinigungsprotokoll hier beschrieben sind, können für andere MOG Expressionssysteme arbeiten, oder auch andere Proteine, solange sie einen 6x His Tag für die Absorption zu Nickel Harz einzuarbeiten. Doch ohne die Thioredoxin-Tag, die Löslichkeit von MOG-Protein bei höheren Konzentrationen kann ein Problem, und natürlich wird es nicht möglich sein, ge nerate reine MOG _1-125 , da dies ist einzigartig für das MOG - _Tag - System.

Messung des MOG - _Tag die Proteinkonzentration vor der Proteinrückfaltungs via Dialyse ist für den Erfolg dieses Reinigungsprotokoll wesentlich. Wenn die Konzentration zu hoch ist, kann das Protein aggregiert und fallen aus der Lösung aus, anstatt in einzelne Proteine ​​falten. Dies kann während der Dialyseprotokoll als weißer Niederschlag zu sehen ist an der Unterseite des Dialyseschlauchs bildet. Wenn dies geschieht, lösen sich die MOG - _Tag - Protein wieder mit 6 M Guanidin und messen die Proteinkonzentration. Verdünne das Protein auf 0,5 mg / ml Dialyse dann wieder beginnen, da keine Präzipitate bei 0,5 mg bilden sollte / ml. Für MOG _1-125 können Präzipitate zu erwarten zu bilden , wie das Protein stark unlöslich ist. Wir haben festgestellt , dass dies die Faltung von MOG nicht _1-125 vorgesehen beeinflussen , dass das Protein ausreichend vor der Dialyse verdünnt wurde.

nt "> Für die TEV - Protease , um effektiv die MOG - _Tag - Protein in reiner MOG spalten _1-125 ist es wichtig , eine ausreichende Menge an TEV - Protease zu verwenden. Ältere Versionen von TEV - Proteasen durch ²¹ Selbstspaltung inaktiviert werden jedoch modernere Versionen leiden Unlösbarkeit gibt ²² so ist es wichtig , genug TEV - Protease hinzufügen ausreichende Spaltung des MOG - _Tag - Protein vor TEV - Protease - Inaktivierung zu erreichen. da im Handel erhältliche TEV - Protease kostspielig sein kann, empfehlen wir die Herstellung und Reinigung von TEV - Protease , wie in Referenz ^22. bei der Verwendung von reine Maus MOG _1-125 Protein für Experimente, ist es wichtig , dass das Protein zu beachten stark unlöslich ist und kann aus der Lösung auszufällen und somit weitgehend vor vermischt werden müssen verwendet werden .

Zusammenfassend hier haben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung und Reinigung von großen Mengen von MOG - _Tag - Protein beschrieben. FurthermErz, die Zugabe eines Spaltungsstelle TEV - Protease in unseren MOG _tag Protein bietet die Möglichkeit , reine MOG zu erzeugen , _1-125 , falls erforderlich. MOG - _Tag - Protein wird durch Anti-Myelin Autoimmun- B - Zellen und MOG - _Tag -induzierten EAE enthält B - Zell-vermittelten Pathologie ⁵ erkannt und gebunden. Daher überwindet MOG - _Tag - Protein die wichtigsten Hürden , die weit verbreitete Verwendung von Protein - Antigen Begrenzung EAE zu induzieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	bio basic	AB0028	Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme	Bioshop	LYS702.10	Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphate buffered saline	life technologies	20012-027	Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II) sulfate	Bioshop	NIC700.500
His bind resin	EMD Millipore	69670-3	Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol	Commercial Alcohols	P016EAAN	Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
bovine serum albumin standard	bio-rad	500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate	bio-rad	500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing	Thermoscientific	68700
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148-25ml	This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease	lifetechnologies	12575-015	Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyethyleneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon microplate spectrometer	Biotek	11-120-611	This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software	BioTek
sodium dodecyl sulphate	Bioshop	SDS001
bromophenol blue	Bioshop	BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Protein desalting columns	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
precast 12% polyacrylamide gel	bio-rad	456-1045
Rapid stain reagent	EMD Millipore	553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Sample Tray	bio-rad	1708272	Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder	bio-rad	1610375